第三章 厌氧性细菌
第一节 破伤风梭菌的微生物学检查法
破伤风梭菌是破伤风的病原体。根据典型的症状和病史，即可作出诊断，由于病原菌分离培养阳性率很低，故一般不作细菌学检查，若必须作，则可按下列方法进行。
一、标本直接涂片染色镜检。
（一）材料
1．标本
临床标本：病灶处取脓汁或坏死组织（一般不易检见，且意义不大）。
2．实验材料：革兰染色液一套、芽胞染液一套、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、光学显微镜等。
（二）方法 制作标本片、革兰染色、芽胞染色、油镜观察。
（三）结果
1．革兰染色，菌体细长呈杆状，长2～18μm，宽0.5～1.7μm，革兰氏染色阳性，芽胞正圆，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状，为无色空白区。
2．芽胞染色 菌体呈细长杆状，染成蓝绿色，芽胞圆形，染成红色，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。
二、分离培养与鉴定
（一）材料
1．标本（同标本直接涂片镜检）
2．实验材料：
培养基：疱肉培养基、血琼脂平板，卵黄琼脂平板，溴甲酚紫牛乳培养基，明胶培养基、糖发酵管（葡、乳、麦、蔗）、厌氧袋或厌氧罐、石蜡、凡士林、接种环、酒精灯、超净工作台或接种箱。
（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述培养基中，进行厌氧培养后观察结果。
（三）结果 培养特性及生化反应。
破伤风梭菌的培养特性及生化反应与临床标本检查结果对照表
三、毒力试验（方法略）
（刘菊华）
第二节 产气荚膜梭菌的微生物学检查法
产气荚膜梭菌能引起人和动物多种疾病，其中A型是人类气性坏疽和食物中毒的主要病原菌；C型可引起坏死性肠炎。
一、标本直接涂片染色镜检
（一）材料
1．标本
临床标本：依据病情采取标本，创伤深部的分泌物，穿刺物，坏死组织块、菌血症时期的血液，可疑食物。
2．实验材料：革兰氏染色一套，芽胞染色液一套，荚膜染色液一套（密尔氏法）、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油等。
（二）方法 制作标本片，革兰氏染色，芽胞染色，荚膜染色，油镜观察。
（三）结果
1．革兰氏染色，产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，长3～19.0μm，宽0.6～2.4μm，芽胞位于次极端呈椭圆形，直径小于菌体，有荚膜，从深部创口取材涂片镜检有三个特点：①有荚膜的革兰阳性大杆菌；②白细胞少且形态不典型；③并伴有其他杂菌。
2．芽胞染色：芽胞呈红色，菌体呈蓝色。
3．荚膜染色，菌体呈鲜明红色，荚膜呈蓝色。
二、分离培养与鉴定
（一）材料
1．标本（同标本直接涂片镜检）。
2．实验材料：培养基：疱肉培养基，血琼脂平板，卵黄琼脂平板，溴甲酚紫、牛乳培养基、明胶培养基、糖发酵管（葡、乳、麦、蔗）、厌氧袋或厌氧罐、石蜡、凡士林、接种环、酒精灯、超净工作台或接种箱。
（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述培养基中，进行厌氧培养后观察结果。
（三）结果 培养特性及生化反应。
产气荚膜梭菌的培养特性及生化反应与临床标本检查结果对照表
三、动物试验
（一）目的 观察产气荚膜梭菌发酵肌肉和组织中的糖类，产生大量气体，造成的气肿现象。
（二）材料
1．标本：产气荚膜梭菌培养液。
2．动物：健康小白鼠一只。
3．无菌注射器、镊子，剪刀等。
4．革兰染色液一套、光学显微镜、香柏油、温箱等。
（三）方法 将产气荚膜梭菌培养液0.5ml注射入小白鼠腹腔10min后断髓处死，置37℃温箱孵育5～8h观察小白鼠腹部膨胀气肿现象。
（四）结果 见小白鼠腹部隆起，剖检时腹部放出大量气体，恶臭，各脏器物均肿胀，并有许多气泡，尤以肝脏为甚，称泡沫肝，取内脏组织印片，革兰氏染色镜检，可见革兰阳性粗大杆菌、外围负染透明的荚膜。
（刘菊华）
第三节 肉毒梭菌的微生物学检查法
肉毒梭菌可引起人类食物中毒（由肉毒毒素污染的罐头、香肠、腊肠、臭豆腐、豆瓣酱引起），创伤感染中毒，婴儿肉毒中毒。
一、标本直接涂片染色镜检
（一）材料
1．标本：
临床标本：依据病情采取标本，食物中毒，婴儿肉毒患者可取粪便，剩余食物。
2．实验材料：革兰氏染色液一套、芽胞染色液一套、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油等。
（二）方法 制作标本片、革兰氏染色、芽胞染色、油镜观察。
（三）结果
1．革兰氏染色：为革兰氏阳性粗短杆菌，长4～6μm，宽0.9μm，芽胞呈椭圆形，粗于菌体，位于次极端，使细菌呈网球柏状。
2．芽胞染色：芽胞呈红色，菌体呈蓝色。
二、分离培养与鉴定
（一）材料
1．标本（同标本直接涂片镜检）。
2．实验材料：培养基：疱肉培养基、血琼脂平板、卵黄琼脂平板、溴甲酚紫牛乳培养基、明胶培养基、糖发酵管（葡、乳、麦、蔗），厌氧袋或厌氧罐、石蜡、凡士林、接种环、酒精灯、超净工作台或接种箱。
（二）方法 无菌操作，将标本接种于上述培养基中，进行厌氧培养后观察结果。
（三）结果 培养特性及生化反应。
肉毒梭菌的培养特性及生化反应与临床标本检查结果对照表
三、动物试验：
（一）目的 检测肉毒素的存在及多价抗毒素血清的中和作用。
（二）材料
1．标本：肉毒梭菌液体培养物、病人液体标本或可疑食物悬液。
2．动物：健康小白鼠3只。
3．肉毒素多价抗毒素血清。
4．灭菌滤菌器、无菌注射器、解剖刀、剪刀、镊子、瓷盘等。
（三）方法
1．标本处理，取不少于5d培养的液体培养物，病人液体标本或1∶10的可疑食物悬液，待3000rpm离心30min，取上清液经滤菌器除菌，取滤液作试验。
2．试验方法：第一组：取上述滤液0.5ml，注入小白鼠腹腔内。
第二组：取滤液加热100℃30min后，取0.5ml，注入小白鼠腹腔内。
第三组：先给小白鼠腹腔注射肉毒毒素多价抗毒素血清0.5ml，再取上述滤液0.5ml，注入小白鼠腹腔内观察动物发病情况（从注射后1h～4d）。
（四）结果
第一组：如滤液中有肉毒素存在，一般注射1h后，小白鼠出现四肢麻痹，呼吸困难，眼睑下垂，瞳孔散大，流涎等中毒症状，最后因心衰或呼吸困难而死亡，剖检内脏可见明显充血，大量出血与血栓形成等。
第二组：因加热破坏了肉毒素素，小白鼠不发病。
第三组：因肉毒毒素多价抗毒素血清可中和肉毒毒素对小白鼠有保护作用而不发病。
（刘菊华）
第四节 供厌氧芽胞梭菌培养及生化反应的培养基
1．疱肉培养基
（1）成分：
牛肉渣0.5g
肉汤培养基7ml
（2）制备：取制备牛肉浸液剩下的并经过处理的肉渣，装于15mm×150mm试管中，每管0.5g，并加入pH7.6的肉汤培养基7ml，上盖3～4ml厚的融化凡士林，经10.343 kPa（15磅）高压灭菌15min后备用。
2．溴甲酚紫牛乳培养基
（1）成分：
新鲜牛奶（脱脂）100ml
16g/L溴甲酚紫溶液0.1ml
（2）制备：将溴甲酚紫指示剂加入牛奶中，分装试管，每管约5ml，于表面加已融化的凡士林，厚约5mm。55.16 kPa（8磅）高压灭菌20min后经37℃孵育24～48h，若无细菌成长即可使用。
3．糖发酵培养基
（1）成分：
胰蛋白质15g
维生素C 0.1g
酵母浸出粉7g
硫乙醇酸钠0.5g
L-半胱氨酸0.25g
溴甲酚紫0.01g
氯化钠2.5g
蒸馏水1000ml
（2）制备：上述基础培养液按10g/l加入所需的糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖），即成各种糖发酵管。分装后，经68.95 kP a（10磅）高压灭菌20min后备用。
4．心脑浸液及心脑浸液血琼脂
（1）成分：
牛脑浸出液200ml
牛心浸出液250ml
磷酸氢二钠2.5g
半胱氨酸0.5g
蛋白胨10g
氯化血红素（5g/L）1ml
酵母浸出物（粉）5g
维生素K10g/L溶液0.1ml
葡萄糖2g
氯化钠5g
蒸馏水1000ml
（2）牛心脑浸出液的制备：将去筋膜并绞碎的牛脑和牛心各500g，分别置于两只2000ml的三角烧瓶中，各加1000ml蒸馏水，4℃置冰箱过夜。次日撇去浮油，分别置45℃水浴中加温1h，再煮沸30min，用纱布过滤。不易滤清时，再置冰箱待杂质沉降，吸取上清液。各补足水分至1000ml,103.43 kPa（15磅）高压灭菌15min后备用。
将已制备的牛心脑浸液和上述成分加入容器内，加蒸馏水至1000ml加热溶解，冷却后调pH至7.6～7.8。分装后103.43 kPa（15磅）高压灭菌15min。
牛心脑浸液琼脂与血琼脂，上述牛脑浸液基础培养基加入2%琼脂，即为牛心脑琼脂。在牛心脑浸液琼脂中加入5% ～10%脱纤维羊血，即成心脑血琼脂。
5．硫乙醇酸盐培养基
（1）成分：
胰酶解酪蛋白17g
半胱氨酸0.25g
植物胨或大豆胨3g
亚硫酸钠0.1g
葡萄糖6g
0.5%氯化血红素溶液1ml
氯化钠2.5g
10g/L维生素K1溶液0.1ml
硫乙醇酸钠0.5g
琼脂0.7g
蒸馏水1000ml
（2）制备：混合上述各成分加热至完全溶解，煮沸1～2min，冷却后调整pH值至7.2～7.4。分装后置103.43 kPa（15磅），高压灭菌15min,4℃保存备用。
6．卵黄琼脂平板
（1）成分：
示蛋白胨或胰酪胨40g磷酸氢二钠（NaHPO4）5g
氯化钠（NaCl）2g
硫酸镁50bMgSO4 0.2ml
葡萄糖2g
琼脂20g
蒸馏水1000ml
（2）制备：将以上成分加热溶解，调pH值至7.3～7.4,103.4 kPa（10磅）高压蒸汽灭菌20min，待凉至50℃左右时，于90ml培养基中，加入无菌蛋黄悬液10ml（按无菌操作取出蛋黄，加入等量生理盐水、混匀），混合后倾注平板。
7．明胶培养基
（1）成分：
明胶12g
肉浸液100ml
（2）制备：在100ml肉浸液中加入明胶12g，隔水加热溶解，矫正pH值至7.2，趁热以绒布过滤，然后分装于小试管中，高压灭菌68.95 kPa（10磅）15min后备用。
说明：明胶加热溶解及灭菌温度不可过高，时间不能太长，以免破坏明胶凝固能力；明胶培养基在20℃以下凝成固体，24℃以上自动液化。
（刘菊华）