任务一　蛋白质的分子组成

一、蛋白质的元素组成

在生物体内，蛋白质的种类很多，其结构和功能也各异，但蛋白质的组成元素基本相似，主要由C（50％～55％）、H（6％～7％）、O（19％～24％）、N（13％～19％）和S（0～4％）组成，部分蛋白质还含有其他一些元素，如P、Fe、Cu、Zn、Mg、Ca、I和Mo等。不同蛋白质平均含氮量比较接近，约为16％，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏定氮法（Kjeldahl）测定蛋白质含量的计算基础，通过测定蛋白质样品中的含氮量可推算蛋白质的含量。

100g样品中蛋白质含量（％）=每克样品含氮克数×6.25×100％

二、蛋白质的基本组成单位——氨基酸

蛋白质是由氨基酸通过酰胺键（肽键）组成的多聚生物大分子，结构复杂，种类繁多，用酸（H2SO4或HCl进行）、碱（NaOH）或酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）水解均可得到含有不同氨基酸的混合液。因此，蛋白质的基本组成单位是氨基酸（amino acid，AA）。

（一）氨基酸的结构

自然界中氨基酸种类超过300种，但构成蛋白质的天然氨基酸只有20种，有相应的氨基酸遗传密码，称为编码氨基酸或标准氨基酸。氨基酸结构中与羧基直接相连的C原子称为α-碳原子，在α-碳原子上连接一个氨基，因此，称为α-氨基酸（脯氨酸为α-亚氨基酸）。20种标准氨基酸中，除甘氨酸外，其α-碳原子都是手性碳原子，有D-型和L-型结构差异，但构成天然蛋白质的氨基酸均为L-α-氨基酸，其结构通式见图2-1。

除常见的20种标准氨基酸外，在自然界还存在许多非编码氨基酸，以游离或结合形式存在，有些在代谢中是重要的前体或中间体，在生物体发挥重要的生理功能。如β-丙氨酸是构成维生素泛酸的主要成分；D-苯丙氨酸参与组成抗生素短杆菌肽S；同型半胱氨酸是甲硫氨酸代谢产物；瓜氨酸和鸟氨酸是尿素合成中间产物；γ-氨基丁酸（γ-GABA）是谷氨酸脱羧产物，是抑制性神经递质，在大脑中含量较高。当前，一些非蛋白质氨基酸已被开发并作为药物应用于临床的疾病治疗中。

（二）氨基酸的分类

1.根据侧链R基团化学结构分类

根据氨基酸侧链R的结构不同，将常见的20种标准氨基酸分为脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环族氨基酸3类。其中，以脂肪族氨基酸最多。根据脂肪族氨基酸结构差异，分为一氨基一羧基氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸5种）、羟基氨基酸（丝氨酸和苏氨酸2种）、含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸2种）、酰胺基氨基酸（天冬酰胺和谷氨酰胺2种）、一氨基二羧基氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸2种）和二氨基一羧基氨基酸（有赖氨酸和精氨酸2种），共15种。芳香族氨基酸有苯丙氨酸和酪氨酸2种。杂环族氨基酸有色氨酸、组氨酸和脯氨酸3种。常见20种氨基酸的结构如图2-2所示。

根据R侧链基团的酸碱性质可分为酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸。酸性氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸2种，碱性氨基酸有赖氨酸（侧链有氨基）、精氨酸（侧链有胍基）和组氨酸（侧链有咪唑基）3种，酸性氨基酸和碱性氨基酸以外的均归类到中性氨基酸，共15种氨基酸。

根据R侧链基团的极性和带电特性，可将20种标准氨基酸分成4组：非极性R基氨基酸（疏水氨基酸）、不带电荷的极性R基氨基酸、带正电荷的R基氨基酸、带负电荷的R基氨基酸（表2-1），后两者称为亲水性氨基酸。

非极性R基氨基酸共有8种，有丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸4种侧链为脂肪烃侧链的氨基酸和苯丙氨酸、色氨酸2种侧链含芳香环的氨基酸以及侧链含硫的甲硫氨酸和含亚氨基酸的脯氨酸。这些氨基酸在水中的溶解度比极性氨基酸小，其中，丙氨酸R基疏水性最小，介于非极性R基氨基酸和不带电荷的极性R基氨基酸之间。不带电荷的极性R基氨基酸有7种，包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸，其侧链为不解离的极性基团或亲水性基团，能与水形成氢键。其中，甘氨酸侧链介于极性与非极性之间。这些氨基酸中半胱氨酸和酪氨酸R基极性最强。带正电荷的R基氨基酸为碱性氨基酸，在pH7时带正净电荷，侧链为高极性基团，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的R基氨基酸为酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。在pH7左右侧链羧基完全解离，带负电荷。

2.根据营养价值分类

根据人体或动物体对氨基酸的需求以及氨基酸在人体和动物体的合成情况，可将氨基酸分为必需氨基酸（人体不能合成或合成量较少）、半必需氨基酸和非必需氨基酸3个大类。必需氨基酸有8种，包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。半必需氨基酸2种，包括组氨酸和精氨酸。如组氨酸是婴幼儿必需氨基酸，若缺乏时会患湿疹。

（三）氨基酸的物理性质

1.氨基酸的两性电离与等电点

除脯氨酸外，所有氨基酸分子中均含有酸性的α-COOH和碱性的α-NH2，在酸性溶液中，氨基酸可与H+结合形成阳离子（—NH+3）；在碱性溶液中，氨基酸可与OH-结合，失去H+形成阴离子（—COO-）。因此，氨基酸是两性电离物质，称为两性电解质。氨基酸的解离与所处溶液的酸碱性有重要关系，同一氨基酸在不同pH值条件下解离方式不同，可带正或负电荷。当氨基酸处于某pH值溶液时，所带正、负电荷相等，氨基酸成为兼性离子，呈电中性，氨基酸净电荷为零，此时溶液的pH值称为该氨基酸等电点（isoelectric point，pI）。不同氨基酸由于侧链解离程度不同而有不同的等电点。当溶液pH<pI时，氨基酸带正电荷；当溶液pH>pI时，氨基酸带负电荷。氨基酸的两性解离与等电点变化示意图见图2-3。

一般情况下，中性氨基酸pI值在5.0～6.3左右，酸性氨基酸在2.8～3.2左右，碱性氨基酸在7.6～10.8之间。等电点是氨基酸的一个重要物理常数。对于中性氨基酸来说，由于其侧链R基团不解离，所以，，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。对于酸性氨基酸来说，由于其结构中含有3个可解离基团，完全质子化时可看作一个三元酸，所以，pI=，如天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在等电点时，氨基酸溶解度最小，可基于此原理进行氨基酸的分离。常见氨基酸表观解离常数和等电点如表2-2所示。

2.晶体形状

不同氨基酸可形成不同的晶体形状，如L-谷氨酸是四角柱形。同一氨基酸在不同结晶体系中形成的晶体也有差异。如脯氨酸在水中的结晶为柱状体晶形，而在乙醇中晶体为针状晶形。所有氨基酸均为无色结晶，晶形可作为氨基酸鉴定的重要依据。除胱氨酸和酪氨酸外的氨基酸都能溶于水，均能溶于稀酸、稀碱溶液，除脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚外，其他均不能溶于有机溶剂。常见氨基酸的晶体形状见表2-3。

①表示自水中结晶。

②表示自乙醇中结晶。

注：色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺在5mol/L HCl中不稳定，故在较低的HCl浓度下测定。

3.熔点

由于氨基酸以兼性离子形式存在，故熔点比相应羧酸或胺类要高些，一般在200～300℃之间。熔点较低的氨基酸如半胱氨酸为178℃，较高的如酪氨酸为342℃。常见氨基酸的熔点见表2-4。

注：*表示熔点分解。

4.味感

各种氨基酸都有一定的味感，味感与氨基酸的结构和构型有关。一般D-型氨基酸多数有甜味，而L-型氨基酸有甜、苦、鲜、酸4种味感。其中，疏水性氨基酸多具有苦味，而亲水性氨基酸多具有甜味，天冬氨酸和谷氨酸钠盐有显著鲜味。常见氨基酸味感见表2-5。

①界限值单位为mg/100mL。

5.溶解度

由于氨基酸均有α-氨基和α-羧基等极性基团，因此均能溶于水，但在水中的溶解性有显著差异。L-氨基酸和DL-氨基酸在不同温度条件下在水中的溶解度分别见表2-6和表2-7。

6.旋光性

除甘氨酸外，蛋白质中的氨基酸均有旋光性，因为α-氨基酸中的α-碳原子是不对称碳原子，即与α-碳原子相连的4个取代基各不相同，分别为羧基、氨基、氢原子和侧链，由于α-碳原子连接的4个取代基在空间有不同的排布，所以氨基酸有D-型和L-型构象，它们为镜像结构或左右手关系。这两种形式称为光学异构体、对映体或立体异构体。氨基酸的其中一个异构体使偏振光向左旋转（称左旋，记为“-”），另一个异构体使偏振光向右旋转（称右旋，记为“+”），两者旋转程度相等。α-氨基酸具有的这一性质称为旋光性或光学活性，也称为分子的手性（chirality）。氨基酸的旋光度除与侧链R基性质有关外，还与测定pH有关。这是因为氨基酸为两性电解质，在不同pH条件下氨基和羧基的解离状态不同。比旋度是一个可以进行氨基酸鉴别和纯度测定的物理常数。常见氨基酸的比旋度见表2-8。

7.紫外吸收特性

氨基酸在可见光区都没有光的吸收，但对于侧链基团含有芳香环的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）因具有共轭双键结构，所以，对紫外光区具有光吸收现象，可吸收一定波长的紫外线，酪氨酸和色氨酸的紫外光区吸收峰在280nm左右，苯丙氨酸紫外吸收峰在260nm左右（图2-4）。由于绝大多数蛋白质均含有这些含芳香环侧链的氨基酸（酪氨酸和色氨酸残基），因此，也具有共轭双键结构，在280nm处也有紫外光吸收现象，可以利用蛋白质在280nm的吸光度值测定样品中的蛋白质含量，这种方法称为紫外分光光度法测定蛋白质含量。

8.疏水性

蛋白质在水中的溶解度与氨基酸侧链的极性有重要关系。氨基酸侧链的极性基团（带电荷或不带电荷）和非极性（疏水）基团的分布情况与蛋白质的溶解性、结构及脂质结合能力等有重要关系。氨基酸的疏水性（hydrophobicity）为1mol氨基酸从水溶液转移至乙醇溶液时所产生的自由能变化。不考虑活度系数变化的前提下，，其中S乙醇和S水分别为氨基酸在乙醇和水中的溶解度，单位为mol/L。氨基酸结构可分为甘氨酸基和侧链，假定甘氨酸侧链（RH）的为0，则，所以，氨基酸侧链残基的疏水性。氨基酸侧链残基的疏水性常用Tanford法测定。常见氨基酸侧链的疏水性见表2-9。

数值较大时，表示该氨基酸侧链是疏水的，常位于蛋白质的结构内部；而疏水性数值为较大负值时，表示该氨基酸为亲水性，常位于蛋白质结构的外部。赖氨酸是一个例外，该氨基酸为亲水性氨基酸，但疏水值却为正数，这是由于赖氨酸分子中含有4个易溶于有机相的亚甲基。

（四）氨基酸的化学性质

1.α-氨基参与的反应

（1）与亚硝酸反应　氨基酸的游离α-氨基可与亚硝酸反应生成α-羟基酸和氮气。

该反应生成N2的50％来自于氨基酸、50％来自于亚硝酸，是范式（Van Slyke）定氮法的理论基础。ε-NH2与HNO2反应较慢。脯氨酸为亚氨基酸结构，没有游离α-氨基，不能与HNO2反应。组氨酸和色氨酸被环结合的N也不能发生此反应。赖氨酸除了α-氨基外，含有的ε-氨基也能与亚硝酸反应生成氮气，但反应速率较慢，控制反应时间在3～4min，α-氨基可作用完全。

（2）酰基化和烃基化反应　氨基酸的氨基可与酰基化试剂或烃基化试剂反应，α-氨基上的H原子被酰基或烃基取代生成相应的产物。其反应通式为：

该取代产物对氨基酸的氨基有保护作用，在多肽及蛋白质人工合成时常用于保护氨基，以及蛋白质一级结构测定时进行N末端氨基酸分析与测定。常用的酰基化试剂有苄氧甲酰氯、叔丁氧甲酰氯、对甲苯磺酰氯、邻苯二甲酸酐、丹磺酰氯等。常用烃基化试剂有2，4-二硝基氟苯（DNFB，也称Sanger试剂）和苯异硫氰酸酯（PITC）。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸），常用来鉴定蛋白质和多肽的N末端氨基酸残基。苯异硫氰酸酯（PITC）和氨基酸反应比较特殊，在弱碱性条件下，先和氨基酸反应生成烃基化产物苯氨基硫甲酰氨基酸（PITC-AA），在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-AA）。此反应在多肽和蛋白质氨基酸序列分析中具有特殊重要作用。

（3）脱氨基反应　氨基酸在氧化剂或氨基酸氧化酶的作用下发生氧化脱氨，生成相应的α-酮酸。该反应是生物体氨基酸分解代谢的第一步，氨基酸只有脱除氨基后才能进行体内代谢。

2.α-羧酸参加的反应

（1）成盐或成酯反应　氨基酸成盐或成酯反应常在多肽与蛋白质合成中应用。

氨基酸与碱作用（如NaOH）即生成盐，如氨基酸钠盐。氨基酸重金属盐不溶于水。氨基酸羧基与醇反应可生成酯。如在干燥HCl气体条件下，氨基酸与无水甲醇或乙醇反应可生成相应的甲酯或乙酯。氨基酸成盐或成酯后，羧基被保护，氨基化学性质加强，容易与酰基、烃基等发生取代反应。但有一个例外，氨基酸与对硝基苯酚生成相应对硝基苯酯后，羧基反应活性反而增强了，易发生酰化反应，这种酯称为活化酯。

（2）成酰氯反应　氨基酸氨基经保护后，结构上的羧基可与五氯化磷或二氯亚砜等反应生成相应的酰氯，羧基被活化，容易与另一个氨基酸的氨基形成肽键，在人工合成多肽中经常使用。

（3）叠氮反应　氨基酸氨基用适当基团保护后，羧基经酯化后生成相应的酯，再与肼和亚硝酸反应生成叠氮化合物，使羧基被活化，也常应用于多肽的人工合成。

（4）脱羧基反应　氨基酸在生物体内的氨基酸脱羧酶的催化下，脱去羧酸生成相应伯胺并放出CO2。氨基酸脱羧酶有严格的专一性。一种氨基酸脱羧酶只能催化一种特定氨基酸脱羧。氨基酸发酵过程中，可利用该反应进行氨基酸产量的测定，加入特定氨基酸脱羧酶后，利用瓦勃呼吸计可以定量测定CO2的量，从而进行氨基酸的计量。

3.α-氨基和α-羧基共同参加的反应

（1）茚三酮反应　在弱碱性条件下，氨基酸与茚三酮水合物共热时，氨基酸氧化脱氨脱羧，茚三酮水合物被还原并与氨和另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，该蓝紫色化合物最大吸收波长为570nm，其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，茚三酮反应非常灵敏，可用于氨基酸和蛋白质的定性与定量分析。

氨基酸在0.5～50μg/mL范围内，含量与吸光度值成正比。脯氨酸是亚氨基酸，与茚三酮反应生成一种黄色物质，其最大吸收波长在440nm处。

（2）合成肽反应　一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间脱水缩合生成酰胺化合物，形成的酰胺键为肽键。由两个氨基酸组成的肽称为二肽。如甘氨酸和丙氨酸反应如下：

两种不同的氨基酸可形成两种二肽，三种不同的氨基酸可形成6种三肽，n种不同的氨基酸可以形成n！种不同的多肽。

4.侧链R基参与的反应

氨基酸侧链R基团上存在可发生多种化学反应的官能团，如Ser和Thr的羟基、Tyr的酚羟基、Cys的巯基、Trp的吲哚基、His的咪唑基、Arg的胍基、Met的甲硫基、Lys的ε-氨基、Asp和Glu的侧链羧基等。侧链参与的化学反应可用于氨基酸的定性定量分析和蛋白质的化学修饰。

（1）半胱氨酸巯基参与的反应　半胱氨酸巯基（—SH）化学性质很活泼，在较弱的氧化剂作用下，两个Cys巯基之间发生氧化形成二硫键，产物是胱氨酸，反应可逆。

在还原剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等作用下，胱氨酸—S—S—键打开重新形成两个Cys。二硫键广泛存在于蛋白质分子中，可存在于同一条肽链中，也可以是两条肽链之间的连接键，对于稳定蛋白质空间结构有重要作用。在较强氧化剂如过甲酸作用下，巯基或二硫键被氧化成磺酸基，此反应不可逆，常用于蛋白质一级结构测定时打开二硫键。巯基易与烷化剂，如碘乙酸、对氯汞苯甲酸等作用生成相对稳定的烷基化衍生物。当烷化剂与巯基作用后可使这些蛋白质失去活性。

（2）酪氨酸酚羟基参与的反应　酪氨酸酚羟基在碱性条件可使Folin-酚试剂（含磷钼酸和磷钨酸）还原生成钼蓝和钨蓝，产物在680nm有最大光吸收。利用Folin试剂可进行酪氨酸含量测定。因大多数蛋白质含有酪氨酸，因此可用Folin-酚法进行定量测定，也可用于蛋白酶酶活力测定。Tyr酚基在羟基两侧的3位和5位容易发生亲电取代反应，如碘化和硝化，还可和重氮化合物结合生成橘黄色化合物（Pauly反应），也可用于酪氨酸测定。

氨基酸侧链基团参与的部分化学反应见表2-10。

三、肽和肽键

1.肽键

肽键是一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基缩合脱去1分子水形成的酰胺键（图2-5）。

酰胺键为特殊共价键，较稳定。从键长来看，肽键键长（0.132nm）介于C—N单键（0.147nm）和双键（0.127nm）之间，具有部分双键性质，其CO具有部分单键性质，肽键不能自由旋转。从键角看，肽键中键与键夹角均为120°。与肽键相连的6个原子（Cα、C、O、N、H、Cα）始终处在同一平面上，称“肽键平面”、“酰胺平面”或肽单元。与C—N相连的氢和氧原子与两个α-碳原子呈反向分布。见图2-6。

2.肽

肽是氨基酸的线性聚合物，由氨基酸通过肽键形成。由2个氨基酸形成的肽称为二肽，3个氨基酸形成的肽称为三肽。10个以下氨基酸形成的肽常称为寡肽（oligopeptide），10个以上氨基酸形成的肽称为多肽（polypeptide）。多肽链中形成肽链的原子和α-碳原子交替重复排列构成主链骨架，伸展在主链两侧的R基称为侧链。蛋白质分子结构可含有一条或多条共价主链和许多侧链。

每一条多肽链有自由α-氨基的一端称为氨基末端或N端，有自由α-羧基的一端称为羧基末端或C端。由于氨基酸之间通过脱水缩合形成酰胺键，因此氨基酸结构不再完整，常称为氨基酸残基（amino acid residue）。见图2-7。

在表示蛋白质（或肽）分子时，常以氨基末端的氨基酸为第1个氨基酸残基，习惯命名时，从氨基末端开始，在每个氨基名称后面加上“酰”字，阅读时，常由左至右进行。如下列由甘氨酸和丙氨酸组成的二肽，由于氨基酸的顺序不同，可生成甘氨酰丙氨酸和丙氨酰甘氨酸。

由两种不同氨基酸组成的二肽有两种异构体，而由20种不同氨基酸组成的二十肽其异构体有2×1018种，这就可以解释为什么蛋白质结构具有多样性了。不同蛋白质分子，由于其组成的氨基酸种类不同以及氨基酸排列顺序不同，就构成了自然界蛋白质的多样性。

3.生物活性肽

在生物体内存在许多活性肽，它们具有特殊的生物学功能，如催产素、加压素和舒缓激肽等。在生物体内也存在着许多具有生物活性的低分子量的肽，如谷胱甘肽、抗利尿激素、血管紧张素Ⅱ、β-内啡肽及表皮生长因子等（表2-11），在生物体的能量代谢、物质代谢以及代谢调控及神经传导等过程中发挥重要作用。

如还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸γ-羧基与半胱氨酸和甘氨酸通过肽键相连形成的三肽（图2-8）。分子结构中的巯基具有还原性，具有保护细胞膜结构和细胞内酶蛋白分子巯基的还原性的作用，使其处于活性状态。巯基还具有噬核特性，能与一些致癌剂、药物、重金属离子结合，避免这些毒物与DNA、RNA及蛋白质结合，并促使其排出体外。