任务四　蛋白质的理化性质

蛋白质是由许多氨基酸通过酰胺键构成的高分子化合物。因此，蛋白质也具有氨基酸类似的物理化学性质，如两性解离、等电点、紫外吸收及呈色反应等，但也有氨基酸不具备的理化性质，如变性和复性、胶体性质、沉降与沉淀等。

一、蛋白质的紫外吸收特性

大多数蛋白质分子中都含有酪氨酸和色氨酸残基，这两种氨基酸分子中的共轭双键在紫外线280nm波长处有特征性吸收峰，特别是色氨酸吸收能力最强。紫外吸收强弱与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用蛋白质在280nm处的紫外吸收强度来对蛋白质进行定量分析，也可以用于蛋白质的纯度分析。需要注意的是，由于核酸在260nm的特征性吸光会影响到蛋白质测定，因此需进行校正，校正公式为：蛋白质浓度（mg/mL）=1.55A280-0.76A260，测定范围为0.1～0.5mg/mL。

二、蛋白质的呈色反应

蛋白质分子中的肽键与氨基酸侧链基团可以与许多化学试剂发生呈色反应，常用于蛋白质的定性和定量分析。

1.双缩脲反应

双缩脲（H2NOC—NH—CONH2）为两分子尿素在180℃左右加热释放出一分子氨（NH3）后得到的产物。在碱性条件下，含有2个或2个以上氨基甲酰基（—CONH2）的化合物均能与Cu2+反应生成紫红色复合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中肽键数量越多，反应溶液颜色越深，而氨基酸及二肽无此反应。双缩脲反应常用于蛋白质和多肽的定性与定量分析。由于氨基酸不具备此反应，因此，蛋白质随着水解的进行，反应物颜色深浅会逐步变浅，可监测蛋白质的水解过程。临床上常用于血清总蛋白、血浆纤维蛋白原的含量测定。

2.Folin-酚试剂反应

酚试剂最早由Folin于1912年首先发现，因此，也称Folin-酚试剂。1922年吴宪等将酚试剂用于蛋白质的定量分析，1951年Lowry改良了酚试剂反应。酚试剂由A和B两部分组成。试剂A相当于双缩脲试剂，试剂B为磷钨酸和磷钼酸。首先，在碱性条件下，蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸与试剂A中的Cu2+形成蛋白-铜紫红色络合物，然后再与试剂B反应。蛋白质中的酪氨酸中的酚基能将试剂B中磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色化合物（钼蓝和钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比，是蛋白质含量测定最常用方法。该法灵敏度高，比双缩脲反应灵敏度高100倍，比紫外分光光度法提高10～20倍，可测定微克水平的蛋白质含量。缺点是Folin-酚试剂只与蛋白质中个别氨基酸反应，受蛋白质中氨基酸组成的特异性影响，即不同蛋白质所含酪氨酸、色氨酸不同而使显色强度有所差异，要求作为标准的蛋白质其显色氨基酸的量应与样品接近，以减少误差。临床上常用于测定血清黏蛋白、脑脊液中的蛋白质等微量蛋白质的含量。

3.米伦试剂反应

米伦试剂为HgNO3及Hg（NO3）2、硝酸和亚硝酸的混合物，加入到蛋白质溶液后可产生白色沉淀，沉淀加热后变成红色，这是由于蛋白质分子结构中含有酚基。酪氨酸以及含酪氨酸的蛋白质均有此反应。

4.考马斯亮蓝反应

当pH<pI时，蛋白质分子带正电荷（呈阳离子），能与阴离子染料结合产生颜色反应，产物色泽深浅与蛋白质含量成正比。常见染料有溴甲酚绿、邻苯三酚红和考马斯亮蓝G250等。其中，考马斯亮蓝应用最为广泛。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，最大吸收波长为465nm，当与蛋白质结合后变为青色，最大吸收波长变成595nm，可测定微克级蛋白质（Bradford法）。此外，考马斯亮蓝R250与G250结构类似，也含有6个苯环和带2个负电荷，但比G250更加敏感，常用于电泳凝胶上的蛋白质显色。在临床上，常用于血清白蛋白和脑脊液中总蛋白等蛋白质的含量测定。

5.茚三酮反应

在pH5～7条件下，蛋白质中的α-氨基可与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，产物最大吸收波长为570nm。可通过测定570nm处可见光吸收强度来测定蛋白质的含量，常用于蛋白质的定性与定量分析。

6.黄色反应

蛋白质溶液遇到浓硝酸后先产生白色沉淀，白色沉淀加热后变为黄色，再加碱，颜色更深呈橘黄色。其原理是硝酸能将蛋白质芳香环的苯环硝化产生黄色硝基苯衍生物。所有含有芳香环（包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的蛋白质均有此反应。

7.乙醛酸反应

往乙醛酸和蛋白质的混合溶液中缓慢加入浓硫酸，可发现两液层之间出现紫色环，这是由于吲哚基参与了反应。因此，含色氨酸的蛋白质及色氨酸可有此反应。

8.坂口反应

精氨酸分子中的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及α-萘酚在碱性条件下（NaOH溶液）产生红色反应物。此反应可用于精氨酸及含精氨酸的蛋白质的定性与定量分析。

9.醋酸铅反应

含有半胱氨酸、胱氨酸的蛋白质均能与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，这是由于半胱氨酸、胱氨酸及含巯基蛋白质的分子结构中含有—S—S—或—SH基团。

常见蛋白质的呈色反应见表2-14。

三、蛋白质的胶体性质

蛋白质是生物大分子，分子量一般在，蛋白质在溶液中的形状常为球形、椭圆形和纤维状等，分子颗粒直径大小在1～100nm之间，为胶体溶液，具有胶体性质，如布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜等。

蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，其稳定性维持有两个重要因素：①蛋白质表面有水化层。蛋白质表面多为亲水性基团（如—COO-、、—CO—NH2、—OH、—SH、酰胺键等），可吸引水分子，在蛋白质表面形成“水化层”，每克蛋白质可结合0.3～0.5g水，有利于蛋白质颗粒的隔离而不聚集。②蛋白质表面带有相同电荷。蛋白质在等电点时，表面静电荷为零。在非等电点，蛋白质表面均带有同性电荷，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷。蛋白质分子靠近时，由于同性电荷的相斥，使蛋白质颗粒很难聚焦而沉淀出来。破坏蛋白质表面的水化层或电荷可使蛋白质沉淀析出，如盐析法等。蛋白质的亲水胶体性质具有非常重要的生理意义，因为，生物体中含大量水分，蛋白质与水分结合后能形成各种流动性不同的胶体系统，如生物细胞的原生质就是复杂且非均相的胶体系统，物质代谢、能量代谢均可以在此进行。此外，蛋白质的弹性、组织细胞的形状、体液的黏度等均与蛋白质的亲水胶体性质有关。

由于蛋白质不能透过半透膜，因此，常利用透析除去蛋白质溶液的小分子。将蛋白质装入透析袋中，置于蒸馏水中，由于小分子可以自由透过半透膜，在膜内外浓度差的作用下，小分子物质从膜内透析出来，蛋白质溶液得到了纯化，这种操作方法称为透析法。常用半透膜为玻璃纸或高分子合成膜。生物膜也具有半透膜的性质。如人体细胞膜、线粒体膜和微血管壁等，有利于体内蛋白质专属性分布在膜内外，对维持细胞内外的水和电解质平衡有重要生理意义。如血浆蛋白等大分子胶体物质不能通过毛细血管壁，成为影响血管内、外两侧水平衡的重要因素。球状蛋白的表面多为亲水基团，在溶液中具有强烈的吸引水分子作用，使蛋白质分子表面形成水化膜，将蛋白质分子相互隔开，阻止其聚集而沉淀。

四、蛋白质的两性电离与等电点

蛋白质是由氨基酸缩合形成的，除两端的氨基和羧基可解离外，侧链中的某些基团，如天冬氨酸、谷氨酸残基的β-羧基和γ-羧基，赖氨酸残基中的ε-氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸的咪唑基等在一定条件下也可解离。因此，和氨基酸一样，在纯水溶液中和结晶状态下均以两性离子形式存在，即蛋白质分子可同时带有正负两种电荷，羧基带负电荷，氨基带正电荷。蛋白质的解离状态可用下式表示：

溶液中蛋白质的带电特性与溶液pH值有关。当蛋白质溶液处于某特定pH值时，其解离成正、负离子趋势相等，呈兼性离子状态，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点（pI），溶解度最小，能沉淀析出。不同蛋白质由于氨基酸组成类别和数量不同，具有不同的等电点。等电点是蛋白质的特征性常数，与所含氨基酸种类和数目有关（表2-15）。

通常情况下，含酸性氨基酸较多的酸性蛋白质其等电点偏酸（如胃蛋白酶、丝蛋白等），而含碱性氨基酸较多的碱性蛋白质其等电点偏碱（如鱼精蛋白、组蛋白等）。当溶液pH>pI时，蛋白质带负电荷；pH<pI时，则带正电荷。人体内蛋白质种类繁多，大多数蛋白质等电点在pH=5.0左右，所以，在生理条件下（pH为7.4），蛋白质多以阴离子存在。人体内部分蛋白质的等电点见表2-16。

当蛋白质溶液pH值远离蛋白质等电点pI时，由于蛋白质本身所带电荷，在电场作用下会向与电性相反的方向移动，这种现象称为蛋白质电泳（electrophoresis）。由于蛋白质所带电荷不同、分子形状和分子量不同，在电泳过程中泳动的速度也不同，因此，可以利用电泳进行蛋白质的分离与纯化。此外，离子交换色谱技术、等电点沉淀技术也常用于蛋白质的分离与纯化。临床上利用三氯乙酸沉淀蛋白质制备无蛋白血滤液。

五、蛋白质的变性与复性

蛋白质在某些理化因素作用下，空间结构受到破坏，导致其理化性质和生物学活性改变或丧失的现象称为蛋白质变性（denaturation）。其主要作用机制是由于蛋白质结构中的非共价键和二硫键断裂，不涉及肽键的断裂。蛋白质变性后，高度折叠的空间结构变为松散，疏水基团外露，溶解性降低，黏度增加、不对称性增加，失去结晶能力，生物学功能减弱或丧失，易受到酶的水解。引起蛋白质变性的因素有高温、高压、紫外线、超声波、强酸、强碱、重金属离子、生物碱试剂等，可分为可逆变性和不可逆变性两类。

变性蛋白质在一定条件下去除其变性因素，能恢复或部分恢复原来的空间构象，并再现其生物学活性的现象称为蛋白质复性（renaturation）。在牛胰核糖核酸酶溶液中加入尿素和β-巯基乙醇后，维持酶空间结构的四个—S—S—被破坏，酶失去催化活性。当用透析法去除尿素和β-巯基乙醇后，—S—S—重新形成，原有空间结构及催化活性得以恢复（图2-17）。一般情况下，蛋白质变性是不可逆的，蛋白质复性与变性因素、蛋白质类型、分子结构改变程度等有关。如鸡蛋白加热凝固就是不可逆变性，胰蛋白酶在酸性环境条件下短暂加热可变性，但缓慢冷却又可复性。

药品在生产过程中可利用蛋白质变性原理进行药物的灭菌或除菌。如利用乙醇、紫外线、高温及高压等使致病微生物蛋白质变性而灭菌。在中草药有效成分提取或其注射液制备时利用加热和浓乙醇等除去杂蛋白。在酶、蛋白质或生物制品（疫苗、抗生素等）生产时，常采用低温保存蛋白质生物制剂，或加入保护剂、抑制剂等增强蛋白质抗变性能力。

六、蛋白质沉淀技术

蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀，分为可逆沉淀和不可逆沉淀。用透析等方法除去沉淀因素后，蛋白质能恢复其天然构象，称为可逆沉淀。重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等使蛋白质沉淀后无法用透析等方法去除沉淀剂而使蛋白质恢复天然构象的称为不可逆沉淀。常用的沉淀方法有盐析法（中性盐沉淀）、有机溶液沉淀法、等电点沉淀法、金属盐沉淀法、生物碱试剂沉淀、有机聚合物沉淀、聚电解质沉淀法等。

1.盐析法沉淀

在蛋白质溶液中加入中性盐后（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）可产生“盐溶”和“盐析”反应。在中性盐浓度较低时，随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度增加的现象称为“盐溶”。主要是由于低盐浓度可使蛋白质表面吸附某种离子，蛋白质颗粒表面携带同种电荷而排斥，同时与水分子作用也增强，增强了蛋白质的溶解度。一般情况下，无机盐浓度在生理离子强度范围内（0.15～0.2mol/kg）时，蛋白质溶解度最大。而高盐浓度时，因破坏蛋白质水化层和中和电荷，使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀的现象称为“盐析”。

蛋白质经盐析后，其分子内部结构并没有发生改变，不会引起蛋白质变性，并保持原有生物活性，沉淀剂透析去除后，可重新溶解，盐析为可逆沉淀。一般蛋白质分子量越大，所需中性盐浓度越小，可利用这种差异分离不同分子量的蛋白质，这种方法称为分段盐析法。如用半饱和硫酸铵溶液沉淀血清球蛋白，饱和硫酸铵溶液分离血清清蛋白。盐析时溶液pH值越接近蛋白质pI，效果越好。盐析法常用于酶、激素等具有生物活性的蛋白质药物生产。

2.有机溶剂沉淀

在蛋白质溶液中，加入适量与水互溶的有机溶剂（如乙醇、丙酮、甲醇等）能破坏蛋白质表面水化膜，使蛋白质相互聚集而析出，称为有机溶剂沉淀法（organic solvent precipitation）。常用于蛋白质、酶、核酸和多糖等药物的提取。有机溶剂沉淀法的优点有：①提取溶剂易挥发，不易残存在蛋白质溶液中，产品纯度较高；②沉淀的蛋白质与母液密度差较大，可利用离心分离法进行产物的收集，但往往会引起蛋白质变性，需在低温条件下进行。有机溶剂易燃易爆，车间和设备需做好防护。有机溶剂沉淀的原理是由于亲水性有机溶剂的加入降低了介质的介电常数，使溶质分子间静电引力增加，聚集而形成沉淀。常见的溶剂的介电常数见表2-17。其中，乙醇和丙酮由于介电常数较低，是最常用的沉淀用溶剂。2.5mol/L甘氨酸介电常数很高，可用作蛋白质溶液的稳定剂。此外，水溶性的有机溶剂还能降低自由水浓度，使蛋白质表面水化层厚度降低并降低蛋白质亲水性，导致蛋白质脱水聚集。在有机溶液沉淀中，脱水作用比静电作用更突出。

利用有机溶剂进行蛋白质沉淀时，溶液pH值应尽量选择在蛋白质等电点附近。此外，应减少无机盐的使用，因为少量中性盐的存在，会出现“盐溶”现象。如用硫酸铵析出的蛋白质进一步用有机溶剂沉淀法纯化时，应先脱盐。同时，要考虑到蛋白质在低温下的稳定性和溶解性，应在低温下（最好低于0℃）进行。对不耐热蛋白质，常采取搅拌和少量多次加入的方法，避免有机溶剂与水混合时产生的热量使蛋白质变性。一般将蛋白质冷却至0℃左右，然后在充分搅拌下加入预冷（-10℃）的有机溶剂进行蛋白质的沉淀。乙醇沉淀法目前常用于血浆蛋白质（如血清白蛋白）的制备，也常用于食品药品级酶制剂的沉淀。

3.等电点沉淀法

两性物质（如蛋白质、氨基酸）在等电点时净电荷为零，容易沉淀析出。等电点法操作简单、试剂消耗少，分离过程中引入杂质少，是常用的分离纯化方法，主要适用于水化程度不高，在等电点时溶解度很低的物质。如四环素在等电点pI=5.4左右难溶于水而沉淀。对于亲水性很强的蛋白质，在等电点左右仍不产生沉淀，或由于不同蛋白质等电点较为接近，常与其他沉淀法联合应用。在部分药物生产过程中，常利用等电点沉淀法进行杂质去除，如胰岛素纯化时，调pH值至8.0以除去碱性杂蛋白，调pH3.0以除去酸性杂蛋白。

4.金属盐沉淀法

蛋白质在pH>pI的溶液中呈阴离子，可与金属离子（Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag2+、Ca2+等）结合成不溶性蛋白盐而沉淀。重金属盐沉淀法在临床上常用于抢救误食重金属盐中毒的患者。通过灌服大量牛奶、豆浆等蛋白质，使灌服的蛋白质与重金属离子形成不溶性络合物，减轻重金属离子对机体的损害。长期从事重金属作业的人员，提倡多吃高蛋白食物，以防止重金属离子被机体吸收而造成损害。金属盐沉淀法常用于生物活性物质的分离纯化，如锌盐用于杆菌肽和胰岛素的沉淀。CaCO3用于人血清白蛋白、柠檬酸及乳酸等分离。在进行细胞胞内产物提取时，也常用锰盐选择性除去核酸，降低溶液黏度。如E.coli小规模连续分离β-半乳糖苷酶时，在细胞匀浆中加入0.05mol/L Mn2+可除去30％～40％核酸，对酶无损失。红霉素发酵液中杂蛋白可用ZnSO4沉淀除去。DNA和其他核酸可用MgSO4除去。金属盐沉淀有时分解困难，并容易使蛋白质变性，需注意操作条件。

5.生物碱试剂沉淀

蛋白质含有与生物碱相似的含氮基团，能与生物碱试剂结合形成不溶性的沉淀。主要是由于蛋白质在酸性溶液中（相对于蛋白质等电点来说）带正电荷，能与生物碱试剂的负电离子结合形成不溶性盐，反应不可逆。当pH<pI时，蛋白质呈正离子，可与生物碱试剂（如苦味酸、单宁、磷钨酸、磷钼酸、三氯乙酸和磺基水杨酸等）的酸根离子结合成不溶性的盐而沉淀。临床上，常用三氯乙酸和磷钨酸沉淀血液中的蛋白质以制备无蛋白滤液，或者用苦味酸检验尿蛋白以及进行中草药注射液中蛋白质的检查。单宁、苦味酸的收敛作用等原理也是利用生物碱对蛋白质的沉淀作用。生物碱试剂可引起蛋白质变性。蛋白质变性和沉淀反应是两个不同的概念。变性可表现为沉淀和溶解状态，而蛋白质沉淀并不一定变性。