任务三　核酸的理化性质

一、核酸的物理性质

1.核酸的分子量

DNA和RNA均为生物大分子。DNA分子量比RNA要大，一般在106～1010之间。不同生物和不同种属间DNA分子量差异很大。如多瘤病毒DNA分子量为3×106，而果蝇染色体DNA分子量为8×1010。RNA分子量变化范围较大，一般tRNA分子量最小的为104左右，mRNA约为0.5×106或更大些，rRNA则在（0.6～1）×106左右。

2.核酸的溶解性

DNA纯品为白色纤维状固体，RNA纯品为白色粉末或结晶，两者均为极性化合物，都溶于水，易溶于稀碱，其钠盐极易溶于水，但不溶于乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯乙酸等有机溶剂。常用70％乙醇或异丙酮来进行DNA的沉淀分离。DNA和RNA在生物体内常与蛋白质共同存在，其溶解性受盐溶液浓度的影响。DNA-蛋白质复合物在低浓度盐溶液中随盐浓度的增加，溶解度呈递增趋势，在1mol/L NaCl溶液中溶解度要比纯水中高2倍，在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最低，几乎不溶。RNA-蛋白质复合物在盐溶液中的溶解度受盐浓度影响较少，在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度较大。因此，常用0.14mol/L NaCl来分离RNA核蛋白和DNA核蛋白，分离后再用变性剂（如SDS）除去核蛋白。此外，DNA和RNA在酒精中的溶解性也不相同，DNA在50％酒精中易沉淀，RNA在75％酒精溶液中易沉淀，利用DNA和RNA在酒精中的溶解性差异可以进行核酸的分离与纯化。

3.核酸的黏度

高分子溶液的黏度比普通溶液要大，特别是高分子形状不对称性越大，其黏度就更大。不规则线团分子比规则的球形分子黏度要大，线形分子黏度更大。由于DNA分子细长且呈线状分布，分子长度有的达数厘米，如人的第13对染色体DNA分子量为6.4×1010，伸展长度可达3.2cm，因此，DNA稀溶液的黏度也较大。DNA变性时，分子形状由双螺旋变为无规则线团，空间伸展长度变短，使溶液黏度降低。因此，可用黏度作为DNA变性的指标。RNA的黏度要小很多。

二、核酸的化学性质

（一）核酸的酸碱性

在RNA和DNA分子中，有很多呈酸式解离的磷酸残基和呈碱式解离的氮原子，因此，核酸为两性电解质，又因磷酸基的酸性远远超过碱基的碱性，因此，核酸的等电点通常偏酸性，低至pH2.0～2.5，核酸也表现明显的酸性。核酸在水溶液中能发生两性电离，具有等电点。DNA分子内氢键的形成与其解离状态有关，在pH4.0～11.0范围内碱基最稳定。由于磷酸基pK值较低，当溶液pH>4.0时，核酸呈多价阴离子状态，易与碱性蛋白（如组氨酸）结合。在生理pH条件与近中性缓冲溶液中，由于体系pH远高于核酸等电点，因此，核酸带上负电荷，在电场中向阳极移动。目前，核酸分离常采用聚丙烯凝胶电泳（PAGE）和琼脂糖凝胶电泳进行。聚丙烯凝胶电泳常采用垂直式电泳，用于小片段DNA或RNA的分离与纯化；琼脂糖凝胶电泳常采取水平式电泳，常用于大片段DNA的分离与分析。由于DNA本身不显色，常在电泳系统中加入溴化乙啶（EB）进行检测，EB很容易插入碱基对之间，在紫外光照射下可散发红橙色荧光。

（二）核酸的紫外光吸收

DNA和RNA的嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键。所以，碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm区间有紫外吸收，其中，在260nm处有最大光吸收值，蛋白质在紫外区间最大吸收波长在280nm处。因此，在核酸的分离与纯化过程中，可借助A260nm/A280nm比值判断样品纯度。纯的DNA样品其A260nm/A280nm应为1.8，纯的RNA应为2.0。核酸样品中若含有杂蛋白及苯酚，A260nm/A280nm比值明显下降。不同的核苷酸具有不同的紫外吸收特性。因此，可以利用核酸样品的紫外吸收特性进行核酸含量的测定，但不纯的样品不能用紫外吸收法进行定量测定。纯的核酸样品可根据其A260nm值求出核酸的含量，如1.0A260nm相当于50μg/mL双螺旋DNA，或40μg/mL单链DNA（或RNA），或20μg/mL寡核苷酸。这个方法既快速准确且不会浪费样品。

天然DNA样品在发生变性时，由于氢键断裂、双链解离、碱基暴露、共轭双键充分释放，所以变性后的DNA在260nm处的紫外吸光度值显著增加，称为DNA增色效应（hyper-chromic effect）。变性的DNA若重新恢复到双链结构，其紫外吸光度值又回到之前水平，称为DNA减色效应（hypo-chromic effect）。

（三）核酸变性、复性和杂交

1.变性

维持核酸结构稳定性的作用键主要为氢键和碱基堆积力。在加热、强酸或射线等作用下，核酸的氢键和碱基堆积力遭到破坏，核酸空间结构发生改变，核酸的理化性质和生物学功能也发生改变，称为核酸的变性（denaturation）。变性后的核酸由于只是氢键与碱基堆积力的破坏，双螺旋结构解开，但没有核苷酸共价键的断裂，因此，其分子量并没有发生改变。引起核酸变性的因素主要有温度、pH、酰胺与尿素等。如将DNA稀盐溶液加热到80～100℃时，双螺旋结构发生解体，形成无规则线团，260nm处紫外吸收值升高（可增加25％～40％）、黏度降低、浮力密度升高且生物活性丧失。

DNA变性是“跃进”的过程，变性在很窄的温度范围内完成。通常将DNA双螺旋结构失去一半时所对应的温度称为该DNA的解链温度或熔解温度（melting temperature，Tm）。Tm值一般在70～85℃之间，与下列因素有关：①样品均一性，均一性越高的DNA样品，熔解过程中发生温度范围越窄；②（G+C）％含量，（G+C）％含量越高，Tm越高，（G+C）％含量与Tm关系的经验公式为（G+C）％=（Tm-69.3）×2.44；③介质离子强度，离子强度较低的介质中，Tm较低，熔解温度范围也很窄，在离子强度较高的介质中，情况相反。常用1mol/L NaCl保存DNA样品。

2.复性

变性DNA在适当条件下，DNA单链重新结合并恢复为双链螺旋结构的现象称为复性（renaturation）。DNA复性后，其理化性质与生物学功能得以恢复，如紫外吸收值下降、黏度增高以及生物学活性恢复或部分恢复。常根据紫外吸收值的变化作为复性评判指标。热变性的DNA急冷时，DNA无法复性，复性需要温度缓慢冷却。DNA复性条件有：①有适当阳离子存在，如Na+浓度≥0.01mol/L；②适当pH值，常用pH6.8缓冲溶液；③适当的温度，一般为60℃；④适当的DNA浓度和复性时间。

3.核酸分子杂交

将不同来源的DNA样品放在试管里，经热变性后并慢慢冷却可复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成DNA-DNA异源双链杂交分子。DNA与互补的RNA之间也可发生杂交，形成DNA-RNA杂合双链，该过程称为核酸分子杂交（molecular hybridization）。核酸分子杂交实质上就是在一定条件下核酸分子间的互补碱基的氢键配对，可在液相或固相条件下进行。固相核酸杂交多在膜上进行，常用膜有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜以及化学活化膜等。常用固相杂交的方法有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、菌落杂交、斑点杂交和原位杂交等。Southern印迹杂交主要用于检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子。Northern印迹杂交主要用于检测经凝胶电泳分离且转移到膜上的RNA分子。菌落杂交主要用于检测固定在膜上，经裂解从细菌菌体释放的DNA分子。斑点杂交主要用于检测固定在膜上的DNA或RNA分子。原位杂交主要用于检测细胞或组织中的DNA或RNA分子。

以Southern印迹杂交为例介绍DNA-DNA核酸分子杂交：DNA经限制性内切酶酶解后用琼脂糖凝胶电泳进行分离。分离完成后，将凝胶浸泡在NaOH溶液中，使DNA变性，DNA变性完成后，将变性DNA转移到硝酸纤维素薄膜上（硝酸纤维素薄膜只吸附变性DNA），80℃烘烤4～6h，使DNA牢固地吸附在酸酸纤维素薄膜上，然后与放射性同位素标记的变性DNA探针杂交。杂交须在较高盐浓度及适当温度（一般68℃）下进行数小时或数十小时，杂交完成后，通过洗涤除去未杂交标记物，将纤维素薄膜进行放射自显影确定杂交效果。