第三节 湖北省医院感染——消毒监测工作指导手册（2010年版）

为做好湖北省医院感染——消毒监测工作，保证监测数据科学、真实、可靠、具有可比性，根据《湖北省医院感染——消毒监测方案》（2010版），编制本指导手册，供湖北省相关监测单位在工作中使用，各单位应按本手册开展相关监测工作，并对工作中遇到的问题提出反馈意见。本手册根据实施情况定期更新，各单位均应按最新版本执行。

一、总则

1．现场调查

调查内容包括疾控机构、医疗机构基本情况和从事医院感染消毒监测工作能力，医疗机构重点科室、设施基本情况，调查内容详见调查表2-4，表2-5。

调查工作每3年开展一次，由疾控机构负责进行，可采取观察、走访等调查方法，调查内容不应漏项。

2．采样检测

1）采样

采样前应根据方案要求制定采样计划，内容包括检验指标、采样时间、采样地点、采样方法、采样数量、采样容器与清洗、采样体积、样品保存方法、样品标签、现场测定项目及仪器、采样质量控制、运输工具和条件等。

（1）采样容器应洗涤干净，并高压灭菌。用自来水和洗涤剂洗涤，并用自来水彻底冲洗后，用质量分数为10%的稀盐酸浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水或去离子水洗净。采用高压蒸汽灭菌，121℃保持15min，并烘干后在2周内使用。

（2）采样器和监测设备应定期校准，并提前检查是否处于良好状态，空气微生物采样器采样前应消毒。

（3）微生物样品采样时严格遵守无菌操作，必要时在酒精灯前操作，工作人员应穿戴工作服、帽子、口罩、手套。

（4）采样时应加入适当的中和剂以中和消毒剂的作用。

（5）样品应在4℃冷藏保存，贮存于暗处，微生物样品在4h内检测。

（6）现场采样时应按方案要求，注意收集并记录监测表上内容。

（7）微生物样品均应对培养基、采样液、稀释液等设阴性对照。

2）样品的管理和运输

（1）现场检测样品，应严格记录现场检测结果并妥善保管。

（2）实验室检测样品，应认真填写样品登记表、采样记录和标签，采样记录应包括样品编号、采样者、日期、时间及地点等相关信息；标签应包括样品名称、样品编号、采样日期，并粘贴或注明于采样容器上。

（3）样品装运前应逐一与样品登记表、样品标签和采样记录进行核对，核对无误后分类装箱。

（4）样品采集后应尽快送回实验室，运输过程中应防止样品损坏和泄露，样品箱应有“切勿倒置”和“易碎物品”的明显标示。

（5）微生物样品均应4℃冷藏运输，应配备专门的冷藏箱，并放入制冷剂。

3）实验室检测

（1）基本要求

A．实验仪器设备应定期检定、校准。

B．实验器皿严格按规范清洗、消毒、灭菌。

C．实验试剂、培养基在有效期内。

D．实验用水应符合GB/T-6682的要求。

E．试验操作应在生物安全柜内进行，严格遵守无菌操作要求。

F．试验原始记录应清楚规范，留档备查。

（2）菌落计数技术

菌落计数及报告方法：

A．作平板菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

B．以每平板菌落数在30～300cfu的稀释度为准记录结果。对菌量极少的样本，按实际菌落数计算最终结果。

C．在记下各平板的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘以2以代表全平板菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。

不同稀释度的选择及报告方法：

A．首先选择平均菌落数在30～300cfu者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之。

B．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300cfu，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数。若大于等于2则报告其中稀释度较小的菌落总数。

C．若所有稀释度的平均菌落数均大于300cfu，则应按稀释度最大的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

D．若所有稀释度的平均菌落数均小于30cfu，则应按稀释度最小的平均菌落数乘以稀释度倍数报告之。

E．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300cfu，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

F．若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。

G．如果所有平板上都菌落密布，应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除以2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘以其稀释倍数作报告。

H．菌落计数的报告：菌落数在100cfu以内时按实有数报告，大于100cfu时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。

3．数据管理

（1）项目负责人为数据质量第一责任人，应指定专人负责数据管理，包括原始记录、监测表的记录和管理，负责将数据录入数据库。

（2）应建立数据审核制度，指定专人负责数据的审核，包括原始记录、监测表和录入数据的审核。

二、采样频次和采样数量

每季度监测1次，各项目具体检测指标和采样数量见表2-4。

三、监测方法

1．医疗器械清洗效果评价

1）目测法

（1）采样方法。在医疗器械清洗打包后灭菌之前，随机抽取手术包，主要取医用剪刀、中号止血钳、鼻镜等医疗器械。

（2）检测方法

A．首先采取肉眼裸视法，取清洗后医疗器械，在光线较好处，观察医疗器械清洗效果。外观表面清洁光亮、无残留物质、无血迹，即为肉眼裸视法合格，否则为不合格。

B．然后采取放大镜观察法，用带光源的10倍放大镜检查样本，尤其注意观察关节处、止血钳齿部、管腔等处是否有污染物残留，无残留物质为放大镜观察法合格，否则为不合格。

C．3人分别独立观察，分别记录肉眼裸视法和放大镜观察法结果。

（3）结果判定

A．2人以上判定肉眼裸视法合格，该样本即为肉眼裸视法合格，否则为不合格。

B．2人以上判定放大镜观察法合格，该样本即为放大镜观察法合格，否则为不合格。

2）ATP生物荧光法测定

（1）采样方法。对目测法检查后的医疗器械，用专用生物荧光测试管中棉拭子采样。

（2）检测方法。用专用生物荧光测试管中棉拭子涂擦医疗器械所有外表面，横竖往返均匀涂擦各5次，每涂擦一遍，将棉拭子转动一次，管腔内表面用棉拭子往返涂擦3次，然后将棉拭子放入生物荧光测试管中，快速挤入裂解液和荧光素酶后，利用pi-102型荧光光度计测定相对光单位值（Relative Light Unit, RLU）。然后加入10μl标准品溶液后，读取ATP含量。

（3）判定标准。只检测ATP含量，暂不判断是否合格。

3）注意事项

（1）采样时同时记录清洗方式、清洗剂种类、医疗器械清洗后存放时间；

（2）在进行目测法和ATP生物荧光法检测时均应戴无菌手套。

2．手术室空气含菌量检测

1）静态条件下监测

（1）采样方法。静态条件下监测时，普通手术室应在消毒处理后，进行医疗活动之前无人条件下，关闭门窗，静止10min后采样；洁净手术室应在消毒处理、运行室内净化空调设施30min后，进行医疗活动之前，无人条件下采样。采样时间不超过30min。

A．浮游法。使用空气微生物采样器，按28.3L/min流量采样，每次采样时间不应超过30min，送检培养。在距地面高度80～150cm处设采样点。采用2点布点方法，即手术区和周边区各布1点，周边区布点需距墙1m。洁净手术室手术区和周边区按2个样本计；普通手术室手术区和周边区算作1个样本，计算平均含菌量。

B．沉降法。普通手术室用直径9cm普通营养琼脂平板在采样点暴露5min，洁净手术室暴露30min，送检培养。

在距地面高度80～150cm处设采样点。采样布点方法，室内面积≤30m2，设一条对角线取3点，即中心1点，两端距墙1m处各取1点；室内面积≥30m2，设东西南北中5点，其中东西南北点距墙1m。当附近有显著障碍物时，可适当避开，但不应布置在送风口正下方。洁净手术室手术区内必须布一点。

（2）检测方法。采样后的培养皿，应立即置于（36±1）℃条件下培养48h，然后计数生长的菌落数。

（3）结果计算

A．浮游法。各采样点空气含菌量：

平均含菌量：平均含菌量（cfu/m3）=各采样点空气含菌量之和/采样点数；

菌落数的平均值保留至小数点后1位有效数字。

B．沉降法。平均含菌量：平均含菌量（cfu/皿）=各采样点平板菌落数之和（cfu）/采样点数

菌落数的平均值保留至小数点后1位有效数字。

（4）结果判定。普通手术室空气含菌量≤200cfu/m3（或4cfu/平皿），判定为合格。洁净手术室暂按表2-5判定。

2）动态条件下监测

（1）采样方法。动态条件下监测时，在进行医疗活动期间，有人条件下采样。按静态条件下监测法进行浮游菌和沉降菌采样。采样时间不超过30min。手术区在病人头部上侧的位置设1点，周边区按静态条件下设置采样点。

（2）检测方法。按照静态条件监测法进行检测。

（3）结果计算。按照静态条件下的监测方法进行。

（4）结果判定。动态有人条件下监测，只提供监测数据，暂不判定是否合格。

（5）注意事项

A．进入室内采样人员不超过2人。

B．动态监测采样时，采样点与人员的距离控制在50～100cm之间。

C．采样时同一批平板应设阴性对照。

D．采样时同时记录手术室名称、级别、洁净手术室气流组织形式、手术室长宽高、采样时长，动态监测时还应记录手术室活动人数，浮游法监测时还应记录采样器种类。

3．一般物体表面消毒效果

重点监测手术室、感染疾病科、口腔科、重症监护室、血液透析室、烧伤病房、新生儿室及儿科病房，每次至少监测2个以上科室。一般物体包括手术室手术床、器械车、器械台、麻醉机，病房床头柜、门把手，新生儿暖箱等。

1）物体表面菌落总数

（1）采样方法。消毒前物体表面采样，需在上次消毒6h后采。消毒后物体表面采样，需在上次消毒2h内采。用5cm×5cm的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，采样面积≥100cm2，连续采样4个，用浸有含相应中和剂的无菌采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入10ml含相应中和剂的无菌采样液试管内，立即送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样并送检。

（2）检测方法。将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打80次充分混匀，用无菌吸管吸取1.0ml待检样品，注入灭菌平皿中。倾注已融化的45～48℃的营养琼脂培养基15～18ml，并立即悬摇平皿，使样品与培养基充分混匀。每个样品均同时接种2个平皿。

待培养基冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于（36±1）℃温箱培养48h，计数菌落数，即为1ml样品中的菌落总数。

（3）结果计算

细菌菌落总数：（cfu/cm2）=m×10/S

式中：m——两平行平板菌落数均值；

S——采样面积，cfu/m2（大件物体）, cfu/件（小型物体）。

（4）结果判定

Ⅰ、Ⅱ类区域：细菌总数≤5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。

Ⅲ类区域细菌：总数≤10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。

Ⅳ类区域细菌：总数≤15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。

早产儿室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的物体表面不得检出沙门菌。

（5）注意事项

A．将本次试验未用完的同批次采样液、棉拭、培养基等设阴性对照。

B．采样同时记录科室名称、采样点名称、采样面积和上次消毒距采样的时间。

2）致病菌检测

参见《消毒技术规范》（2002年版）。

4．手卫生监测

1）手部微生物监测

选择手术室的医务人员进行外科手消毒效果的监测。

卫生手重点监测感染疾病科、口腔科、重症监护室、血液透析室、烧伤病房、新生儿室及儿科病房等部门工作的医务人员，每次至少监测2个以上科室。

（1）采样方法

外科手在医务人员对手消毒后采样。

卫生手在医务人员接触患者，进行诊疗活动前采样。

被检人五指并拢，用浸有含相应中和剂的无菌采样液的棉拭子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦2次（一只手涂擦面积约30cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入10ml含相应中和剂的无菌采样液试管内，立即送检。

（2）检测方法。见物体表面菌落总数的检测方法。

（3）结果计算

细菌菌落总数（cfu/cm2）=m×10/S

式中：m——两平行平板菌落数均值；

S——采样面积，一只手面积约30cm2。

（4）结果判定

外科手消毒，监测的细菌菌落总数应≤5cfu/cm2。

卫生手消毒，监测的细菌菌落总数应≤10cfu/cm2。

（5）注意事项

A．将本次试验未用完的同批次采样液、棉拭、培养基等设阴性对照。

B．外科手消毒后采样同时记录医务人员从事岗位、刷手时间、消毒时间、消毒剂名称和主要有效成分及含量。

C．卫生手采样同时记录科室名称、医务人员岗位、手卫生方式、手卫生时间、干手方式、消毒剂名称及主要有效成分、含量。

2）手卫生依从性监测

重点监测感染疾病科、口腔科、重症监护室、血液透析室、烧伤病房、新生儿室和儿科病房医务人员，也可选择其他科室和门诊，对医生、护士及其他医务人员的手卫生行为进行观察，观察医务人员各类手卫生指征后洗手和卫生手消毒执行情况。

（1）手卫生指征

A．直接接触每个患者前后；

B．接触患者黏膜、破损皮肤或伤口前后；

C．接触患者的血液、体液、分泌物、排泄物、伤口敷料等之后；

D．穿脱隔离衣前后，摘手套后；

E．进行无菌操作、接触清洁、无菌物品之前；

F．接触患者周围环境及物品后；

G．接触被传染性致病微生物污染的物品后；

H．直接为传染病患者进行检查、治疗、护理或处理传染患者污物之后。

（2）观察方法。从该医务人员第1次手卫生指征开始观察，连续观察其第1～5次手卫生指征下的手卫生执行情况，在医务人员注意到被观察时即终止观察。

每个医院每次监测至少选择2个科室，每次监测手卫生指征30次，不限制医务人员数量。

（3）观察内容。包括手卫生指征类型、手卫生方法、手卫生时间是否正确，记录到观察表中。

（4）注意事项

A．观察期间，对被观察科室和被观察者均实施盲法，可告知医疗机构。

B．手卫生时间可采用秒表记录或估计。

5．内镜监测

1）内镜清洗消毒效果监测

（1）采样方法。取清洗消毒后内镜，监测部位为内镜的内腔面，采用无菌注射器抽取50ml含相应中和剂的洗脱液，冲洗内镜所有管路，并全量收集，立刻送检。

（2）检测方法。将洗脱液充分混匀，用无菌吸管吸取1.0ml待检样品，注入灭菌平皿中。倾注已融化的45～48℃的营养琼脂培养基15～18ml，并立即悬摇平皿，使样品与培养基充分混匀。每个样品均同时接种5个平皿。

待培养基冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于（36±1）℃温箱培养48h，计数菌落数，即为1ml样品中的菌落总数。

将剩余洗脱液在无菌条件下采用滤膜（0.45μm）过滤浓缩，将滤膜接种于凝固的营养琼脂平板上（注意不要产生气泡），置（36±1）℃温箱培养48h，计数菌落数。

（3）结果计算

A．当滤膜法不可计数时，用下式计算：

细菌菌落总数（cfu/镜）=m×50

B．当滤膜法可计数时，用下式计算：

菌落总数（cfu/件）=m+mf

m为5平行平板菌落数均值，mf为滤膜上菌落数。

（4）结果判定。细菌总数＜20cfu/件为消毒合格。

（5）注意事项

A．将本次试验未用完的同批次洗脱液、培养基设阴性对照。

B．同时将本次试验未用完的同批次洗脱液过滤一只滤膜，接种于凝固的营养琼脂平板上作为滤膜法阴性对照。

C．采样同时记录内镜名称、清洗消毒方式、清洗剂名称、消毒剂名称、清洗时间、消毒时间。

2）内镜室工作量监测

采用问卷调查方式，调查内镜室工作量，包括胃镜、其他消化道内镜、呼吸道内镜当日可使用数量、当日诊疗量、当季度最高日诊疗量。

6．口腔科用水监测

采集口腔科供水系统的水源水、综合治疗台储水罐水、手机喷水、冲洗水检测细菌菌落总数。

1）采样方法

采集口腔科供水系统水源水、储水罐水，采样量10ml。

在清洗灭菌的手机换上后，直接用灭菌试管采集手机冲洗水、喷水，采样量为10ml。

2）检测方法

将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打80次充分混匀，用无菌吸管吸取1.0ml待检样品，注入灭菌平皿中。倾注已融化的45～48℃的营养琼脂培养基15～18ml，并立即悬摇平皿，使样品与培养基充分混匀。每个样品均同时接种2个平皿。

手机喷水和冲洗水应同时取1ml做10倍系列稀释后接种，一般应做2～3个稀释度，每一稀释度接种2个平皿。

待培养基冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于（36±1）℃温箱培养48h，计数菌落数，即为该稀释度菌落总数。

3）结果计算

菌落总数（cfu/ml）=mn×10n

mn为n稀释度的两平行平板菌落数均值；n为稀释度指数，n=0为原液接种，n=1为10倍稀释液接种，依此类推。

4）结果判定

只提供监测数据，不判定是否合格。

5）注意事项

（1）水源水和储水罐水可只接种原液，手机喷水和冲洗水应适当稀释后接种。

（2）将本次试验未用完的同批次稀释液、培养基等设阴性对照。

7．医院污水监测

监测医院污水接触池出口水余氯、粪大肠菌群数（MPN/L）和肠道致病菌（主要监测沙门氏菌、志贺氏菌）。

1）污水余氯监测

按GB 18466-2005《医疗机构水污染物排放标准》采样检测。

2）粪大肠菌群数

当余氯检测合格时，仅监测粪大肠菌群，按GB 18466-2005《医疗机构水污染物排放标准》采样检测。

3）致病菌

当余氯监测不合格时，加做致病菌，按GB 18466-2005《医疗机构水污染物排放标准》采样检测。

8．压力蒸汽灭菌器

1）灭菌温度、压力、灭菌时间

使用温度/压力监测设备对灭菌器的灭菌过程进行监测。

（1）标准测试包。标准测试包由16条41cm×66cm的全棉手术巾制成，将每条手术巾的长边先折成3层，短边折成2层，然后叠放，制成23cm×23cm×15cm大小的测试包。

（2）检测方法。容积超过60L的大型压力蒸汽灭菌器，将温度压力监测设备的顶端20mm部分插入标准测试包的几何中心部位，测试包放入灭菌器排气口处，或生产厂家建议的灭菌器内最难灭菌的部位，且灭菌器应处于满载状态。

容积不超过60L的小型压力蒸汽灭菌器，直接将一个温度压力监测设备放入灭菌器内，手提式灭菌器放入底部（靠近排气管口），立式灭菌器放入排气口处，台式灭菌器放入排气口靠近柜门处，且灭菌器应处于满载状态。

采用快速压力蒸汽灭菌程序灭菌时，直接将一个温度压力监测设备置于空载的灭菌器内。

按以上方法放置温度压力监测设备，经过一个灭菌周期后，记录灭菌压力、温度和灭菌时间。

（3）判定标准。只提供监测数据，暂不判定是否合格。

2）生物监测法

按照“标准测试包”的要求，将嗜热脂肪杆菌芽孢菌片或自含式生物指示物制成标准生物测试包或生物PCD，或使用一次性标准生物测试包，对灭菌器的灭菌质量进行生物监测。

（1）检测方法。大型压力蒸汽灭菌器，标准生物监测包置于灭菌器排气口的上方或生产厂家建议的灭菌器内最难灭菌的部位，且灭菌器应处于满载状态。

小型压力蒸汽灭菌器一般无标准生物监测包，应选择灭菌器常用的、有代表性的灭菌包制作生物测试包或生物PCD，置于灭菌器最难灭菌的部位，且灭菌器应处于满载状态。

采用快速压力蒸汽灭菌程序灭菌时，应直接将一支生物指示物，置于空载的灭菌器内。

将生物指示物置于标准试验包的中心部位，按以上方法，经过一个灭菌周期后，在无菌条件下取出标准试验包的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，经56℃培养7天（自含式生物指示物按产品说明书执行），观察培养结果。

试验应设阳性对照和阴性对照。如果一天内进行多次生物监测，且生物指示剂为同一批号，则只设一次阳性对照即可。

（2）结果判定

A．阳性对照组培养阳性，阴性对照组培养阴性，试验组培养阴性，判定为灭菌合格。

B．阳性对照组培养阳性，阴性对照组培养阴性，试验组培养阳性，则灭菌不合格；同时应进一步鉴定试验组阳性的细菌是否为指示菌或是污染所致。

3）注意事项

（1）检测所用生物指示物必须经卫生部批准，并在有效期内使用。

（2）检测时应同时记录灭菌器名称型号、类型、容积、科室名称，设定灭菌温度、压力、灭菌时间。