2.7 免疫血清的制备

免疫血清的制备是免疫学基础技术之一，高效价、高特异性的免疫血清广泛应用于免疫学诊断、特异性免疫治疗以及生命科学研究的诸方面。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。其特异性主要取决于免疫用的抗原的纯度。因此欲获得高特异性的免疫血清首先必须纯化抗原，免疫方案（包括抗原剂量、免疫途径、免疫次数以及注射抗原的间隔时间等）也是影响免疫血清效价的重要因素。

2.7.1 原理

机体受抗原刺激后，在巨噬细胞和辅助T细胞的作用下，相应的前B细胞被激活，增殖分化，形成浆细胞（抗体形成细胞），分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同抗原决定簇被不同特异性的B细胞所识别，因此由某一抗原刺激后产生的抗体，实际上是针对抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体混合物即多克隆抗体，同时由于记忆性B细胞和记忆性T细胞参与再次应答反应，致使在初级免疫的基础上，多次重复注射免疫性抗原，不仅可获得高效价抗体，同时抗体的亲和力也明显提高（图2.26）。

为获得高质量的免疫血清通常使用免疫佐剂，它可增强抗原的免疫原性，延长其在体内的存留时间，使初次反应与二次反应融合在一起，使机体的抗体水平持续上升达到理想的效果。

2.7.2 抗原的制备

免疫抗原种类很多，根据物理性状可分为颗粒和可溶胶体两类。颗粒性免疫抗原包括细胞和各种微生物，如细菌、病毒等。胶体可溶性免疫抗原是指蛋白质抗原。这两类抗原注射到动物体内均能刺激机体产生特异性抗体。通常，颗粒性抗原的免疫原性大于胶体可溶性抗原的免疫原性。

抗原的相对分子质量一般在40000以上，相对分子质量在6000以下的物质为半抗原，它必须与大分子物质偶联后才具免疫原性。相对分子质量介于二者之间的物质，免疫原性很弱，必须延长免疫时间或与大分子物质偶联才能产生高效价的免疫血清。

蛋白质的免疫原性与所含氨基酸种类及其分子结构有关。通常，用一种氨基酸合成的多肽，不论相对分子质量大小，其免疫原性都很弱。用2～3种不同氨基酸合成的多肽，其免疫原性可增强。分子中含有芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸）的肽类物质，其免疫性更强。

1．抗原纯化

制备多克隆抗体对免疫原纯度要求十分严格。通常，免疫原越纯，获得抗体的特异性越高，因此要求至少达到电泳纯或层析纯。

免疫原的纯化方法常用的有电泳法、层析法等。利用高效液相色谱纯化的免疫原，免疫后获得的抗体的特异性更高。

2．半抗原与载体的偶联

半抗原（多糖、多肽、激素、脂肪胺、类脂质、核苷以及化学物品等）并不是免疫原，只有把这些半抗原和载体结合后，才具有免疫原性，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。常用的载体有蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒等，蛋白质是一种良好的载体，通常有牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）和血蓝蛋白（hemocyanin）等，此外，细菌的鞭毛蛋白（feagellin）和破伤风类毒素等也是良好的载体蛋白。

带有游离氨基或游离羧基及两种基团都有的半抗原，可直接与载体连接；其他不带有游离氨基或游离羧基的半抗原，须加以适当改造，使其转变为带有游离氨基或羧基的衍生物，才能与载体连接，其连接方法一般用物理和化学方法进行，物理吸附的载体有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡萄糖硫酸钠等，它们借电荷和微孔吸附半抗原，化学方法则是利用半抗原的某些功能基团连接到载体上。

（1）偶联剂的选择

偶联剂种类很多，按半抗原与载体蛋白之间偶联的化学键性质，可将偶联剂分为四类（表2.5）。

偶联反应的机制为：

1）能激活半抗原上的羧基，以便使它们与载体（通常为蛋白质上的）上的氨基反应，形成CO—NH键的激活剂，如碳化二亚胺、烷基氯甲酸酯和异唑盐等。

2）在氨基之间形成连接桥（NH—R—NH）的激活剂，如二卤硝基苯、戊二醛等。

3）在酪氨酰、组氨酰、赖氨酰残基之间搭桥，形成偶氮键（—N═N—）的化合物（为双功能的偶氮盐）。

4）对没有羧基或氨基的半抗原，需插入连接基（spacer），才能使半抗原与蛋白质偶联，如琥珀酸酐、甲醛等。

（2）半抗原与载体偶联方法举例

1）碳化二亚胺（carbodiimide）法：碳化二亚胺是一种化学性质非常活泼的缩合剂，常用的有两种，即水溶性的EDC[1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳化二亚胺]和脂溶性的DCC（N, N′-二环己基碳二亚胺），它们可与半抗原上的羧基又可与氨基连接。此法操作简便，只需将半抗原与载体蛋白质按一定分子比在适当的溶液中混合，然后加入碳化二亚胺，搅拌1～2 h，置室温反应24 h，最后，透析除去未反应的半抗原等，即可获得人工免疫原。例如取血管紧张素1.25mg, BSA 25mg溶解于25mL蒸馏水中，再加EDC 375mg，充分混匀后置室温24 h，然后反应液在0.15mol/L NaCl中透析24 h，其间换透析液4次以除去多余的EDC，透析后根据需要调节反应液浓度即可直接乳化免疫动物。

2）戊二醛（glutaraldehyde, GA）法：戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能偶联剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，反应式为：

半抗原-NH2+R—NH2+OHC—（CH2）3—CHO—→半抗原-N═CH—（CH2）3—CH═N—R

例如取BSA 20mg与催产素2mg混合溶解于0.1mol/L pH7.5 PBS 2mL中，在缓慢的搅拌下逐滴加入0.02mol/L GA 1mL，再经Sephadex G-25纯化，即得催产素-BSA偶联物。

3）琥珀酸酐（succinic anhydride）法：将带有羟基而缺少羧基的半抗原化合物（如甾体激素）和琥珀酸酐在无水的吡啶中反应即得到带有羧基的半抗原-琥珀酸衍生物，再经氯甲酸异丁酯或碳化二亚胺法制备载体半抗原偶联物。

例如：皮质醇与BSA的偶联。称取皮质醇、琥珀酸酐各0.5 g放入吡啶中，置室温中反应24 h后，倾入由45mL水和6mL浓盐酸组成的混合液中，抽滤析出沉淀，并以蒸馏水洗至pH5，干燥后以丙酮重结晶，即为皮质醇-21-半琥珀酸。取此产物69mg溶于1.5mL二氧六环中，加入0.035mL三正丁胺，降温至10℃，并加入0.019mL氯甲酸异丁酯，置4℃,40min。此即为反应溶液。另取BSA 250mg溶于蒸馏水与二氧六环等体积配成的溶液中，加1mmol/L NaOH 0.25mL,4℃冷却反应液，将反应液加至搅拌下的BSA与二氧六环等体积组成的混合液中，在4℃继续反应2 h，蒸馏水透析过夜。用稀HCl调至pH4.5，此时有沉淀产生，4℃放置20 h，离心分离沉淀，再溶于pH5.5的水中，蒸馏水透析过夜，即获皮质醇-BSA偶联物。

4）氯甲酸异丁酯（isobutyl chloroformate）法：利用半抗原上的羧基和载体蛋白质上的氨基以肽键相连接。此法操作简便，多用于类固醇抗原的制备，其反应式如下：

半抗原-COOH+Cl—COO—CH2CH（CH3）2—→

半抗原-COO—COO—CH2CH（CH3）2

半抗原-COO—COO—CH2CH（CH3）2+R—NH2—→

半抗原-NH—R+HO—CH2CH（CH3）2

5）O-羧甲基羟胺[O-（carboxymethyl）hydroxylamine]法：带有羰基的半抗原与O-羧甲基羟胺反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物，再经碳化二亚胺法制备载体-半抗原偶联物，反应式如下：

某些半抗原虽然分子中含有游离基团，但因为这些基团对于维持其生物活性十分重要，因此不能直接用来与载体蛋白质偶联，必须在半抗原分子上远离基团的部位寻找偶联位点进行连接。

（3）偶联率的测定

由于半抗原与载体结合的数目（偶联率）与免疫原性密切相关，一般认为：全抗原的偶联率在10～40之间可以有效地刺激抗体的产生，如果小分子连接数目太少（＜10），则不能充分体现半抗原结构的特异性，若偶联率太高（＞40），往往因为过多的小分子影响蛋白整体的溶解性及其他性质，所以偶联率是评价全抗原性质乃至影响最终所得抗体效果的重要指标。

测定偶联率的方法很多，一般都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。常用的方法有紫外分光光度法、考马斯亮蓝法、相对分子质量测定法和同位素示踪法等。

1）紫外分光光度法：紫外吸收法的原理在于载体蛋白与小分子（不包括肽类分子）往往具有各自不同的最大紫外吸收峰，当两种分子偶联后，这些峰值处的吸收会出现叠加现象，即这时的吸收值是两种分子共同贡献的结果。

根据Lambert-Beer定律，载体蛋白（p）与小分子（h）在各自以及彼此的最大吸收波长（设蛋白的最大波长为m，小分子为n）处的吸光值与浓度（C）符合下列关系：

式中b为吸收池的光程，ε为摩尔吸光系数。

按照吸光值叠加原则，偶联物（p-h）在m和n波长下的吸光值分别为

式中Ap-h, m, Ap-h, n分别是偶联物在m和n波长下的吸光值；εp, m, εp, n是载体蛋白在m和n波长下的摩尔吸光系数；εh, m, εh, n则是小分子在m和n波长下的摩尔吸光系数；Cp, Ch分别是偶联物中载体蛋白和小分子的摩尔浓度（mol/L）。

（5）÷（6），并经过变换则得到

式中Ch/Cp即偶联率，在具体测量中，只要准确称取载体蛋白、小分子的量，并用相同的缓冲液稀释后分别测量m和n波长处的吸光值，然后根据（1）～（4）式得到εp, m, εp, n, εh, n, εh, m；再测量偶联物在两种波长下的吸光值即可通过上式计算获得全抗原的偶联率。

例如，杨利国等在制备GnRH-BSA偶联物时，以该法测量了产物的偶联率。先用PBS（0.04mol/L, pH7.2）稀释GnRH（相对分子质量1141）和BSA（相对分子质量70000）纯品，配制相应的溶液，以紫外分光光度计扫描，测得GnRH和BSA的最大吸收波长分别为266nm和274nm，再依据两种物质在这两个波长处的吸光值求得εGnRH,266nm, εGnRH,274nm, εBSA,266nm, εBSA,274nm分别为3.52×106,3.39×106, 3.97×107,4.31×107L/mol；而偶联物GnRH-BSA在266nm和274nm处的吸光值分别为0.85和0.87，将上述值代入公式得

即1个BSA分子与12个GnRH相连。

另外，计算偶联率时也可以根据载体蛋白相对分子质量常常大于小分子半抗原的特点，假设偶联物的相对分子质量近似等于载体蛋白的，则偶联物的浓度（mol/L）与偶联物中载体蛋白的浓度相等，此时偶联物中载体蛋白的浓度（mol/L）可表示为

式中mp-h为偶联物的质量，Mp为载体蛋白的相对分子质量，V为偶联物溶液的体积。同样按照叠加原理，偶联物在小分子的特征波长处的吸光值符合（6）式。

变换（6）式可得

式中Cp可按（7）式计算，而εp, n·b和εh, n·b可以通过测量载体蛋白和小分子的标准溶液吸光值，根据（2）,（3）式计算可得。

例如，在罂粟碱（相对分子质量399）和BSA（相对分子质量67000）偶联过程中，由于BSA的相对分子质量远大于罂粟碱的相对分子质量，所以在分别测得罂粟碱和BSA的最大特征波长309nm,280nm处的吸光值后，根据偶联产物在280nm处吸光值叠加的原则，由如下公式

计算，可得偶联率为17。

2）考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝G-250可以和蛋白质结合并产生颜色转变（由红色变蓝色），而且研究表明染料G-250主要与蛋白质中的精氨酸和赖氨酸残基的氨基部分反应，所以对于利用载体蛋白中游离氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）与小分子进行偶联的全抗原而言，测量载体蛋白偶联前后的ε-氨基数目的变化，可以估算小分子的相应偶联情况。

由于赖氨酸只有ε-氨基，则有

式中C, C′为赖氨酸（或氨基）的摩尔浓度（mol/L）与质量浓度（g/L）; N为一个蛋白分子中的赖氨酸数目；Mp为载体蛋白的相对分子质量。

将（8）式代入Lambert-Beer定律，则有

A=εbNC′/Mp

令

式中Kp为不同浓度的蛋白与考马斯亮蓝反应后测量595nm处吸光值，并以吸光值A为纵坐标，相应浓度为横坐标所得曲线的斜率；ε为结合了考马斯亮蓝的赖氨酸的摩尔吸光系数。

则对偶联物（p-h）而言，同样有

式中x为载体蛋白所连接的小分子数（即偶联率）; Mp, Mh分别是载体蛋白和小分子的相对分子质量。

（9）÷（10）式则得到

即通过分别测量不同浓度载体蛋白和偶联物分别与考马斯亮蓝G-250反应后的吸光值，然后通过吸光值-浓度曲线的斜率、载体蛋白的赖氨酸数目以及载体蛋白与小分子的相对分子质量就可以算出偶联率（x）。具体操作方法见第5章相关部分。

常见的载体蛋白所含赖氨酸数目如下表所示：

例如生物小分子雌酮（E1，相对分子质量为270.36）与载体蛋白BSA偶联为完全抗原，对偶联产物用透析法除去未反应的小分子物质，并用葡聚糖凝胶G-25柱进一步纯化脱盐，并收集蛋白质峰。利用考马斯亮蓝法可以测定蛋白质的浓度，也可以测定蛋白质中游离氨基的数目。测定完全抗原中的游离氨基的数目，并同载体蛋白自身的游离氨基的数目进行比较，可测定完全抗原中E1的偶联率。分别取0.1mg/mL BSA溶液0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1mL，用PBS溶液将其均稀释为0.1mL，加入5.0mL蛋白试剂。以试剂空白为参比，测定595nm处的吸光值，从而可计算出E1与BSA的偶联率。

3）相对分子质量测定法：由于载体蛋白在偶联前后相对分子质量的变化可以体现连接小分子的数目，所以对于比较纯的偶联物，可以采用相对分子质量测定法来估算偶联率。常用的相对分子质量测量方法有SDS-PAGE凝胶电泳和基体辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。这一方法对于小分子和短肽类半抗原都适用。

如睾酮与BSA连接制备全抗原时，已知BSA和睾酮-17-半琥珀酸酯的相对分子质量分别为70000和315，利用凝胶电泳测得偶联产物的相对分子质量为80000，则偶联率为32[=（80000-70000）/315]。

4）同位素示踪法：同位素示踪法的原理在于小分子（蛋白亦可）用放射性同位素标记后仍能与载体蛋白偶联，并且其偶联率在标记前后保持不变。实际操作中常利用同位素标记的半抗原与载体蛋白反应前后游离的标记半抗原数目的差别进行计算。这一方法对于所有偶联物的偶联率测定都适用，但操作繁杂，且涉及放射性同位素，必须在有辐射防护设备和射线检测仪的条件下才能应用。

例如，在脱落酸与BSA载体蛋白的偶联反应中，用放射性强度为77000 cpm的放射性同位素标记脱落酸，将19.15mg该脱落酸与100mg BSA反应；偶联结束后透析除去未与蛋白质结合的半抗原，然后测定得透析袋中的偶联物的放射性强度为5500 cpm，则脱落酸的偶联比率为7.1%（=5500/77000），而脱落酸与BSA的反应摩尔比为50.7，所以偶联物中脱落酸与BSA的比例为3.6∶1。

5）其他方法：在偶联率测定时，也有学者利用偶联的两种分子和偶联物分子中氨基氮以及总氮含量的变化或者计算二硝基苯化（DNP化）的氨基酸吸光值的变化推算全抗原的偶联率。

（4）偶联物的纯化和保存

在大分子载体与小分子半抗原偶联反应物中，也含有游离的载体蛋白质、半抗原、偶联剂、偶联副产物、缓冲液成分。这些复杂成分严重影响抗原抗体结合反应，有些试剂毒性很强，注射到动物体内可干扰免疫反应，严重者引起动物死亡，因此，必须对偶联反应的产物进行纯化，常用的方法有：离心、盐析、透析、凝胶层析等。保存偶联物常用的方法有：低温液态保存、冻干保存和低温冷冻保存。

2.7.3 佐剂的应用

使用适当的佐剂可以提高动物机体对免疫原刺激的应答能力。佐剂常与抗原共同注入动物体内，以产生预期的高效价免疫血清。常用的佐剂有：氢氧化铝[Al（OH）3]、明矾[K2SO4·Al2（SO4）3·24H2O]、石蜡油、羊毛脂等。硝酸纤维素膜和聚丙烯酰胺对于量少的抗原特别有用，从聚丙烯酰胺凝胶上切下含有抗原的凝胶条或经电泳转移于硝酸纤维素膜后的抗原膜可直接用于免疫动物。目前应用最广泛的是福氏佐剂，它是一种含有稳定剂（包括乳剂）的矿物油，能与抗原形成稳定的油包水乳剂，福氏佐剂分为不完全和完全两种。福氏不完全佐剂由羊毛脂和石蜡油按一定的比例（1∶2～1∶9）混合后乳化而成。在福氏不完全佐剂中加入一定量（浓度为75mg/mL）加热灭活的卡介苗，即为福氏完全佐剂。福氏佐剂中羊毛脂与石蜡油的配比可根据需要而定，一般冬季由于羊毛脂呈固态，所以用量较少（便于注射）；在夏季，羊毛脂融化呈糊状，可以多用一些。一般常用的配比为1∶4。

在免疫动物时，将福氏佐剂与抗原（蛋白质浓度为1～100mg/L）按体积比1∶1混合后免疫动物。佐剂与抗原乳化可按以下方法操作：

1）研磨法：将佐剂加热，取1.73mL放入无菌的研钵内待冷却后缓缓滴加1.5mL抗原，边滴边向同一方向研磨，待抗原全部加入后，即形成乳白色粘稠的油54包水乳剂，滴在水面上并不扩散。

2）注射器乳化法：用研磨法进行乳化，不仅对抗原损失严重，而且容易引起细菌污染，采用注射器乳化法容易得到优质抗原乳化剂。其操作方法如下：将等量的福氏佐剂和抗原混合液分别放入两个5mL注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意接口不能太松，交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。将乳剂滴入冷水中保持完整不散，成滴状浮于水面，即为合格的油包水剂。

3）快速乳化法：利用超声波粉碎器快速乳化抗原和佐剂混合物，此法操作简便、快速。将抗原和佐剂按所需量加入离心管中，置超声波粉碎器上，超声头浸液面下0.5 cm，防止打碎离心管，以水浴降温，每次乳化10～15 s，反复乳化3～4次，即完成乳化。

4）复合乳剂：按上述方法制成的抗原乳化剂，再加入2倍体积的2%Tween-20生理盐水，用机械方法或超声处理，制成分散的乳剂小滴的复合乳剂。此复合乳剂粘度低，便于使用，且能更快引起更强的免疫应答。

2.7.4 动物免疫

免疫方案包括：动物种系、抗原剂量、免疫途径、加强免疫时间、免疫次数和佐剂的选择等。

1．用于免疫的动物

能作免疫用的动物主要是哺乳类和禽类。常用的有家兔、绵羊、豚鼠和鸡等。有时根据需要也采用山羊、马、猴、鼠和鸽子等。选择合适的动物进行免疫极为重要，应注意以下几点：

1）抗原与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物的亲缘关系越远越好，太近不易产生高效价的抗体。

2）动物的生理状况：同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，由于个体差异，产生的抗体的效价常有较大差异。这与动物的年龄和营养状况密切相关。免疫动物最好选择雄性个体，年龄不宜太大或太小。年龄太小的个体，容易产生免疫耐受性；年龄太大或营养不良，则免疫功能低下，不易产生高效价抗体。采用家兔作免疫时，一般选择3～9月龄、体重1.5～2 kg左右、健康的个体为宜。

3）抗血清的需要量：根据实验中抗血清的需要量，选用最经济的动物和免疫只数，制备大量血清时应选用马、羊等大动物。若需要量不多则可选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。

动物免疫后要作好动物的编号、管理和记录，适当增加营养，注意动物的健康状况。

制备免疫血清用的动物选定后，根据抗原的性质确定免疫剂量、免疫途径、免疫间隔时间和次数，这些都是实验成功与否的关键。

2．免疫剂量

主要依据抗原的免疫原性强弱、相对分子质量大小、抗原来源难易确定抗原剂量。如要获得高效价的抗体，免疫剂量可适当增加，时间间隔可延长，但抗原量过量易产生免疫耐受。通常蛋白质抗原免疫家兔，以每次0.5～1mg/kg为宜，加强免疫时，适当减少抗原量，约为初次剂量的1/2～1/3。

3．免疫途径

免疫途径对免疫成功与否有明显影响。常用的途径有静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮内、皮下和足掌等。对抗原的吸收速度为：静脉=脾脏=淋巴结＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内。一般情况下为延长抗原刺激时间，基础免疫应选择缓慢吸收的途径为宜。

4．加强免疫

第一次免疫后，间隔2～3周进行第二次免疫，以后每1～2周加强免疫一次。免疫的次数，主要决定于抗原的性质和动物对免疫抗原的反应能力。免疫原性强的抗原（如蛋白质）加强免疫次数便少，相反，半抗原的免疫原则需增加至10次左右，其抗体效价才能达到最高值。抗体的亲和力往往随着加强免疫的间隔时间、次数的增多而升高。

5．免疫方案

免疫动物的方案要根据抗原的性质不同而异。以家兔为例，一般有以下几种方法：

1）微量免疫法：先于家兔两后足掌皮下注射灭活的卡介苗，每只约50mg, 1～2周后于腋窝淋巴结注射福氏佐剂抗原0.1mL（约含0.5mg抗原）。背部每隔2周皮下多点注射1mg抗原，不加佐剂，注射2～3次，一周后试血，鉴定抗体效价，合格者采血备用。

2）全量免疫法：首次于家兔足掌皮下注射福氏完全佐剂抗原1～10mg,1～2周后在皮下注射福氏不完全佐剂抗原1～10mg,2～3周后于背部皮下多点注射1～10mg,5周后试血，合格者采血备用。

3）混合免疫法：此法综合足掌皮下、淋巴结、皮下多点和静脉等途径进行免疫，具有抗原量小、产生抗体效价高的优点。此法是于家兔两后足掌皮下注射福氏完全佐剂抗原混合物各0.5mL（5mg/mL）,1～2周后于双侧后肢肿大的腋窝淋巴结各注射0.2mL福氏不完全佐剂抗原。1～2周后于背部皮下多点注射1mg同样的抗原乳剂。3周后经耳静脉采血测试效价，若效价不够高，可用不加佐剂的抗原（5mg/mL）耳静脉注射加强免疫，1周内注射3次，分别为0.1,0.3,0.5mL，一周后采血测试效价，合格后准备放血，分离血清，低温保存备用。

免疫动物放血前，常用ELISA法或免疫双扩散测试抗体效价。若经免疫双扩散测定其效价在1∶16以上即达到要求，应及时采血，防止拖延时间引起效价下降。

6．动物采血

免疫动物经测试合格后，即可采血。采血前动物应禁食24 h，以防血脂过高，禁食期间必须保证饮水充足。常用采血方法如下：

1）心脏采血法：将动物固定于仰卧位或垂直位，剪去左胸侧体毛，消毒皮肤。以食指及中指触摸其胸壁探明心脏搏动最明显处，用连接16号针头的50～100mL注射器在该部位与胸壁成45°角刺入，当针头刺中心脏时有明显的落空和搏动感，待血液进入针筒后固定位置开始采血。本法常用于家兔、豚鼠、大鼠、鸽子等小动物，但若操作不当容易引起动物死亡。

2）颈动脉放血法：是一次性放血较为常用的方法，家兔、山羊、绵羊等动物放血常采用此方法，其放血量较多，所获得的抗体不存在亲和力、特异性和效价等方面的差异。具体操作方法是将动物仰面固定于动物固定架上，暴露颈部。在颈部用2%普鲁卡因局部麻醉，15min后纵行切开颈中部皮肤，暴露气管前的胸锁乳突肌。分离肌肉，在肌束下面靠近气管两侧，即见淡红色搏动的颈动脉，仔细分离一侧的颈动脉，在颈动脉套入两根丝线，一根在远心端，另一根在近心端。先将一侧颈动脉远心端扎紧，然后用止血钳夹住颈动脉近心端，用眼科剪朝近心端将颈动脉剪一“V”形小口，将塑料管插入动脉中，并用近心端丝线结扎固定，防止放血塑料细管滑出。在塑料细管出口处接上灭菌的三角烧杯或离心管，轻轻松开止血钳，血液很快流出。2.5 kg家兔可放血约80～100mL，开始时血流速度很快，以后逐渐减慢，此时可将动物的后部垫高。动物临死前常发生挣扎，所以务必绑定好，以防挣脱插管。

3）静脉采血：家兔可用耳静脉放血，山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血。这种采血法可隔日1次，可以采集大量血液。家兔耳静脉切开法可采集数毫升血液。绵羊采用静脉采血一次能放300mL血液，放血后立即回输100 g/L葡萄糖生理盐水，3天后可再采血。小鼠通常用断尾或摘除眼球法采血，每只小鼠可获得1～1.5mL的血液。马和驴一次可放500mL或更多的血液，但必须间隔1～2月后才可继续采血。

7．血清分离与保存

血液收集后，室温静置2～3h,4℃冰箱过夜（注意容器必须干净并且干燥，以免发生溶血），以3000r/min离心30min，取上清，加入防腐剂（终浓度0.02%硫柳汞或0.02%叠氮钠）分装后置-20℃或-70℃保存备用。

8．结果鉴定

以双相琼脂扩散试验或间接ELISA法检测血清的抗体效价。