2.3 组织与细胞相容性
2.3.1 引言
组织相容性是衡量材料能否作为生物材料应用的一个重要条件，是生物材料必备的最基本条件。组织相容性一般是指材料与活体组织之间相互容纳的程度，即材料的植入或接触对组织的形态结构和功能的影响程度。组织相容性的评价包括材料在组织生理条件下的老化以及组织由于材料的存在而产生的生物学的反应两个双向不同的方面。组织的生物学反应除了全身性的中毒外，更多的是材料周围组织的局部反应，如炎症、纤维性包囊、免疫、诱变，甚至癌病等。值得注意的是，同一材料在体内不同部位以及接触时间长短的不同，其组织相容性也是不一样的，因此，应用条件不同，对组织相容性的要求也不一样。
2.3.2 组织反应
高分子材料表面与蛋白质等生物大分子及细胞之间的相互作用是导致组织生物学反应的本质所在。与抗凝血材料的研究一样，由于材料表面的组成和分子结构以及它所吸附的蛋白质的组成和结构难以测定，因此，它们与组织生物学的反应十分复杂，甚至其中有的机理直至目前还不清楚。但是，就分子水平而言，最初的起因是材料表面对体液中蛋白质等生物大分子的吸附使它们正常的构象发生变化。影响组织反应的因素包括：①材料中的杂质。杂质的存在不仅会加速材料本身在体内的老化，还会加剧组织的生物学反应。②物理力学性能。材料的硬度、模量、弹性等应与其周围组织尽可能匹配。③形状。薄膜由于其阻隔作用而容易改变周围组织的正常生理环境，削弱其营养供应，而锐利的边角则会使其周围组织损伤而加剧其组织反应。④表面的形态结构。粗糙不均匀的表面会加剧其周围组织的反应。⑤高分子材料本体的化学结构。化学结构主要影响其体内的老化稳定性，而对其组织生物学反应的影响不十分明显。⑥材料表面的分子结构和性质。
2.3.2.1 材料引起的感染
感染是植入材料在临床上最常见的主要并发症之一，有1%～10%的植入患者会发生感染，有些感染可被抗生素和宿主的自身免疫所抑制，材料不必取出，但有些感染也经常发生功能损失，如心血管材料引起感染会使患者死亡。引起感染的因素很多，其机理还不清楚，但以下几个方面应引起注意：①材料的消毒，保证材料无菌；②感染部位可利用巨噬细胞与炎症细胞的相互作用而抑制炎症，但植入体可能限制了巨噬细胞的迁移，使其难以产生抗感染生理过程；③材料的形态与感染有关，单纤维材料比有孔或复合纤维材料具有更强的抗感染能力；④材料的浸出物、降解产物也会引起感染，有时会出现无源性感染。
2.3.2.2 材料引发的钙化
材料表面形成钙化常使材料丧失功能，使植入失败。生物体内产生的病理钙化有两种：转移性钙化，由组织中钙含量增加而产生；营养不良钙化，由营养供应受阻而产生。植入材料一般不会发生转移性钙化，而是营养不良钙化。按钙化的形成因素可将钙化分为两种：内源性钙化，指由材料本身的因素所引起的钙化；外源性钙化，指材料以外的因素所引起的钙化。
影响钙化的因素包括：①材料的机械运动，应力存在处先发生钙化；②材料表面的缺陷，缺陷能加速细胞沉积；③剪切应力，局部过热而导致细胞死亡；④凝血加速钙化、血小板吸附；⑤体液的钙、磷含量，成骨素、脂质和脂蛋白。
阻止或延缓钙化的措施包括：①抗血小板聚集的药物可防止血小板在材料表面的聚积，因而可防止钙化；②表面活性剂可防止细胞在材料表面的粘附；③减轻生物体固定时的压力，从而减少材料表面的缺陷；④在局部使用钙通道阻滞剂可防止内源性钙化；⑤材料交联时选择环氧而不用戊二醛，因为后者可使组织变硬。
2.3.2.3 材料的致癌性
生物材料的致癌性一直是人们十分关注的问题，尽管多年的临床经验及一些用之有效的人工器官在使用过程中很少发生肿瘤，但一些动物实验肿瘤的发生屡见不鲜。虽然植入物引发肿瘤的直接相关因素还不十分清楚，但总结病例发现植入物引起癌变通常发生较晚，75%以上是在植入15年后发生的，初步观察表明植入物引起癌变的原因有以下几种：①动物实验的结果表明引起恶性肿瘤的原因与埋入材料的外形有关，粉末或海绵状的材料几乎不会发生恶性肿瘤，纤维状的材料也很少发生，片状材料最易发生。此外还与埋植的方法有关，连续放置的片与打孔的片相比，恶性肿瘤的发生率要高。当植入材料表面变粗糙或变软时，肿瘤的潜伏期延长，但发病率并不降低。②实验观察明确了肿瘤发生率和组织反应后形成的纤维组织包膜的厚度及成熟度有直接关系。高多孔材料的组织包膜很少发生纤维化，无孔板材明显发生纤维化。③被致癌物质污染或在生物老化过程中释放致癌物质的高分子材料埋植在动物体内会引起恶性肿瘤。
植入物引起肿瘤的基本发展过程：植入物在急性反应过程中发生细胞增生和组织浸润；在植入物周围形成一个界线分明的纤维组织包膜；组织反应静止期，即与植入物接触的巨噬细胞处于潜伏状态和吞噬功能失活期，肿瘤前体细胞与植入物表面直接接触；肿瘤前体细胞最终成熟为癌变细胞；肉瘤性增生，肿瘤的产生不是植入物与敏感细胞之间直接的物理化学作用，而是植入物包膜中营养血管减少，同材料接触部分的组织细胞的新陈代谢受阻，与体液直接代谢的营养和氧均不充分，以及持续经受异物刺激，引起细胞异常性分化，造成突变。
避免癌变的措施是寻求致癌机理，找出本质原因：不要采用连续相邻的体状材料埋植法；不使材料与生物组织团有间隙而发生相对运动；材料的存在要使周围组织的生态尽量不受影响；材料不溶解出有刺激性乃至有毒的物质。
2.3.3 细胞相容性的评价方法
细胞生物相容性评价是生物材料生物相容性评价的一项重要内容，是指应用体外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性。细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段，具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，目前几乎所有的生物材料都必须通过相关试验来检测其是否具有细胞毒性，该评价已被广泛应用于生物相容性评价。ISO 10993—5：2009标准对试验的主要步骤、细胞株和细胞培养基、阴性和阳性对照都做了原则要求，并推荐了琼脂覆盖法和分子扩散法（即滤过法）。近年来进一步发展细胞毒性试验，从形态学方法检测细胞损伤、细胞损伤测定、细胞生长测定和细胞代谢特性测定等角度提出了不少试验方法，并从定性评价逐渐向定量测定发展。一些常用的细胞毒性试验方法如下［3］：
（1）细胞形态学评价。细胞形态学评价是一种发展最早的定性细胞损伤检测方法，材料导致细胞损伤从而发生形态学的改变，通过显微镜下观察到变圆或裂解细胞所占的百分比来估算细胞毒性的级别。目测细胞毒性试验无法定量细胞毒性大小，但2008年Bhatia等［4］对显微镜下观察细胞形态毒性的定性判定法与MTT 法等定量细胞毒性判定法进行了比较，研究得出 Pearson相关系数为0.9，说明二者具有良好的相关性。此外，由于该方法可直观地观察到材料细胞毒性的大小，所以目前仍被广泛用于生物材料细胞毒性的评价。
（2）细胞膜完整性测定生物材料对细胞的毒性作用也反映在细胞膜的变化中，细胞膜结构和功能的完整对于将细胞与其周围环境分离起重要作用。Borenfreund等［5］建立了中性摄取试验法。其检测原理是未受损的细胞可摄取中性红染料并将其蓄积在溶酶体内，活细胞摄入中性红染料的水平与活细胞的数量成正比。乳酸脱氢酶释放法，又被称为LDH释放法。LDH是一种存在于活细胞中的稳定的胞质酶，其渗出增加提示细胞膜的稳定性遭到破坏。通过测定进入介质的LDH能够检测细胞膜的完整性，进而反映出细胞活性。LDH在生物相容性的评价中被广泛应用，尤其是在现代毒物学测试中可以提供较MTT测试更有价值的信息。
（3）细胞代谢活性评价。目前，以线粒体琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法应用最广泛。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征之一，所以可以十分灵敏地反映出材料对细胞造成的毒性与损害程度。MTT法是一种快速评定细胞毒性和细胞增殖的比色分析法，常被用于细胞代谢和功能的测定。此方法是由Mosroam在1983年提出的，该方法可以快速、准确、灵敏地反映出细胞增殖程度和材料对细胞造成的细胞毒性与损害程度。近年来MTT法已经在试验中得到广泛的验证。在MTT试验法的基础上发展了XTT试验法。Scudiero等［6］首次采用XTT体外细胞增殖和药敏检测，所得出的细胞生长曲线与 MTT法检测结果相似。XTT法实验时间短、步骤简便，目前已被广泛用于生物材料的相容性评价。由于该法较MTT法具有明显的优点，所以已被纳入国际标准ISO 10993—5：2009中，但实验成本较MTT法高。
（4）细胞增殖率评价。观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速率和增殖率的改变，主要有克隆形成试验。克隆形成试验是检测与生物材料作用后的细胞的克隆形成能力，用克隆形成率来评价材料的细胞毒性。通过直接测定进行有丝分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，主要有5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法。
（5）细胞增殖相关蛋白检测。2000年，Klein等［7］对将 Ki-67蛋白含量作为细胞增殖评价方法进行了研究，并与传统的细胞毒性评价方法进行了对比，他认为 ELISA 法检测Ki-67蛋白含量的方法是一种快速可靠、无放射污染的细胞增殖率评价的新方法，并建议将其作为国际标准 ISO 10993—5：2009细胞毒性评价的补充方法。Oshima等于1997年提出热休克蛋白的检测可以作为牙科材料细胞毒性评价新方法的可能性［8］，随后他们又采用热休克蛋白（HSP70）mRNA 含量检测法对含汞牙科材料进行了毒性评价，提出热休克蛋白（HSP70）含量检测可以作为含汞牙科材料的细胞毒性评价方法，且较传统的中性红比色法敏感［9］。
（6）细胞周期的检测。近些年关于通过检测细胞周期来评价细胞毒性的研究报道日趋增多。细胞周期检测需借助流式细胞仪技术（FCM），对细胞的核酸、蛋白质、酶、细胞周期分布等多种参数进行测定。该技术在材料的生物相容性评价中已有着广泛的应用。
综上所述，评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多，亦各有其特点。各试验方法之间虽然存在一定的相关性，但是很难达到完全一致性。因此在选择试验方法时，必须根据“最接近应用状况”的原则，合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价指标或评价方法。综合运用分子水平评价方法，阐明材料对细胞的作用机制，全面地评价生物材料对细胞的毒性作用，将是生物材料细胞生物相容性评价的发展方向。
2.3.4 其他组织相容性的评价方法
2.3.4.1 急性全身毒性和过敏实验
用材料和/或材料浸提液，通过单一或多种途径，用动物模型做试验，评价其有害作用，只对小动物做初步的整体安全性观察。具体方法：将注射用生理盐水、5%的酒精生理盐水、食用植物油和PEO-400作为浸提液，按一定的样品面积用20 ml浸提液，采用121 ℃×1 h、70 ℃×24 h和50 ℃×72 h的条件分别进行消毒浸取，以这些浸提液做小鼠静脉（盐水）或腹腔（PEO）注射，三天内观察小鼠有无整体外观表现异常或死亡，判断是否合格。利用上述浸提液做家兔皮内刺激试验，每次注射后观察15 min，特别是注意观察末次注射后有无用爪搔鼻、打喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、尿便失禁、休克、死亡等反应。必须设立阴性对照组，并且保证遵循随机化原则。
2.3.4.2 植入实验和局部毒性试验
将材料植入适当部位或组织，观察7～90天，最后用光学显微镜和电子显微镜评价材料对活体组织的局部毒性作用，但要有“标准样”做参比。
植入实验包括皮下植入和骨内植入两种实验方法，是评价材料生物相容性和安全性的主要体内方法。该方法是通过将生物材料植入动物的合适部位，在一定时期通过组织学切片观察组织的变化。皮下植入实验适用于评价长期与组织接触的材料对皮下组织的反应。骨内植入实验是指在实验动物左右肢的同一位置的一侧放置实样，另一侧放置对照样本。实验期内观察动物并记录异常表现，实验完毕后对植入体周围组织进行生物反应评价。
2.3.4.3 遗传毒性和致癌试验
这是生物材料中最复杂和最麻烦的问题。在体外检测方法中常用Ames试验，但是由于Ames试验菌种的变异，试验结果的假阴性率不断增加，因此一般同时还需要进行体外染色体畸变试验和微核试验，这样才能对遗传毒性做出科学的评价。分子生物学和分子基因学将在遗传毒性和致癌试验的评价中有很大的发展潜力，可以在基因转录水平和翻译水平研究细胞的调节机制。生物材料安全性体外试验中还包括原癌基因激活和抑癌基因失活的研究，尤其是P53基因，在人类大多数肿瘤中都发现了其功能障碍，这为研究生物材料可能存在的破坏性作用提供了依据。
2.3.5 展望
对生物材料的安全性评价，不仅要从整体水平去观察材料对人体各系统的影响，从细胞水平去观察材料对细胞的数量、形态及分化的影响，还要深入分子水平去观察材料对细胞DNA、mRNA以及蛋白表达水平的影响，从整体、细胞和分子生物学这三个水平全方位地评价生物材料的生物相容性，以确保生物材料被安全地应用于人体组织。建立材料对分子、细胞及机体的相互作用的系统性评价已成为生物材料评价的发展趋势和最终目的。
生物医用材料需求量的日益增长令其对生物学效应评估效率和可靠性的要求也不断提高。现有的动物实验和细胞水平的研究在揭示材料与机体的相互作用和生物相容性机制方面还需进一步深入。蛋白质组学及其相关技术的发展也为在蛋白质水平上评价生物材料的生物相容性提供了广阔的平台［11］。蛋白质组学技术可以一次性定性、定量研究大量蛋白质，快速阐明外来生物材料所引发的体内反应，这种高通量蛋白质分析技术令研究的焦点得以从少数几种常规蛋白质转移到材料作用后蛋白水平响应过程中包括的所有蛋白质，为生物医用材料的生物学评价提供新的视角和手段。
借助于iTRAQ-Coupled 2-D LC-MS/MS分析，新加坡Xu等［12］首次报道了分别在羟基磷灰石和碳纳米管增强的羟基磷灰石上培养的人成骨细胞的比较蛋白质组学。研究发现，培养在这两种不同表面上的成骨细胞对细胞粘附和增殖相关蛋白的表达有差异性：羟基磷灰石上的成骨细胞有更高的蛋白表达水平和增殖水平。Zuckerman等［13］采用蛋白质组学技术研究了生物材料表面粘附的人单核细胞系U937的细胞内蛋白表达水平，以及基底材料表面吸附的蛋白和磷酸化抑制剂AG18浓度对该细胞蛋白表达的影响。Dinnes等［14］采用蛋白质组学技术（2-DE和MALDI-ToF质谱），研究了聚碳酸酯—聚氨酯材料表面化学对单核细胞来源的巨噬细胞蛋白表达的影响。Kim等［15］用蛋白质组学技术分析了血清和血浆蛋白在材料表面上的吸附。该方法无须依赖抗体的同位素标记，可以大规模研究蛋白吸附。由此可见，运用蛋白质组学的策略对生物医用材料的生物学效应进行研究，从分子层面分析材料与生物体的相互作用，并在整体水平上反映响应蛋白质的动态变化，是进一步探索生物医用材料生物相容性研究的有效手段。