第一节 免疫学检测

免疫学检测是指运用免疫学、分子生物学、细胞生物学等原理和技术，对抗原、免疫分子、免疫细胞进行检测。免疫学检测可分为抗原抗体的检测、免疫细胞及其功能的检测等。

一、抗原抗体的检测

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体在体内（外）合适条件下通过非共价键发生特异性结合的反应，因抗体多来源于血清，故又称为血清学反应。根据抗原性质、标记物、反应现象可分为凝集反应、沉淀反应、免疫标记技术等。

（一）抗原抗体反应的特点

1．特异性 抗原与抗体的结合具有高度特异性。抗原表面的抗原决定基结合到相应抗体的超变区上，在结构与空间构型上具有互补性。抗原抗体结合的特异性越强，亲和力也越高。利用这一特点，在体外可以对许多未知的生物学物质进行特异性鉴定，如利用抗-HAV检测甲肝病毒感染。

2．可逆结合 抗原—抗体复合物在一定条件下可解离为游离的抗原和抗体。抗原与抗体结合除了空间构象互补外，还以静电引力、疏水作用力、范德华力、氢键等分子表面的化学基团之间的非共价键结合。非共价键结合易受酸碱度、离子强度、温度的影响而解离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特性。

3．可见性与带现象 抗原与抗体结合后是否会出现肉眼可见的现象取决于两者适当的比例和浓度。当两者的比例和浓度适当时，复合物才能相互结合成为巨大网格立体状，可出现肉眼可见的反应；若抗原（或抗体）过剩，由于过剩一方的结合价不能被完全占据，多呈游离的小分子复合物形式，或所形成的复合物易解离，不能被肉眼察见。抗体过剩为前带现象，抗原过剩为后带现象。前带现象与后带现象统称为带现象。

4．阶段性 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一个阶段是抗原与抗体特异性结合阶段，该阶段反应迅速，可在数秒钟至几分钟内完成，一般不出现肉眼可见的反应。第二阶段为可见反应阶段，小的抗原—抗体复合物之间靠电荷吸引形成较大复合物的过程，该阶段需数分、数小时甚至数日才能出现肉眼可见的现象。

（二）抗原抗体反应的影响因素

1．离子浓度和酸碱度 抗原、抗体通常为蛋白质分子，在中性或弱碱条件下，表面带有较多的负电荷。pH值过高或过低，均可直接影响抗原、抗体的理化性质，当反应液的pH值接近抗原或抗体的等电点时，抗原和抗体所带正、负电荷相等，自身相吸引，导致非特异性反应而出现凝集（即假阳性反应）。抗原抗体反应的最适pH值为6～8。

2．电解质 抗原和抗体在合适浓度的电解质中会失去一部分负电荷，相互结合，出现肉眼可见的凝集团块或沉淀物。常用0.85%NaCl溶液作稀释液，以提供适当浓度的电解质。

3．温度 抗原与抗体的反应还需要合适的温度。在一定范围内，温度越高，形成可见反应的速度越快；反之，温度越低，反应速度越慢。但温度高于56℃时，可导致抗原—抗体复合物解离，甚至抗原或抗体变性失活。通常37℃是最适温度。

（三）凝集反应

凝集反应是指抗原与相应抗体特异性结合，在适当条件下形成肉眼可见的凝集小块。参与的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。凝集反应可分为直接凝集反应、间接凝集反应、间接凝集抑制反应等（图10-1）。

1．直接凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体在适当电解质参与下结合产生肉眼可见的凝集现象。直接凝集反应的检测可分为玻片法和试管法。

（1）玻片法：一般用已知抗体（诊断血清）与受检颗粒抗原各加一滴在玻片上混匀，数分钟后出现颗粒凝集小块的为阳性反应。此法简便、快速，多用于抗原的定性检测，如鉴定菌种、ABO血型等。

（2）试管法：用已知抗原液（一般为细菌）与一系列稀释的受检血清混合，放入温度合适的地方，一段时间后观察每管抗原凝集程度，产生明显凝集现象的最高稀释度可作为血清中抗体的效价（滴度）。试管法多用于抗体的半定量检测，如肥达反应、外斐反应、交叉互配血等。

2．间接凝集反应 是可溶性抗原（或抗体）吸附于载体颗粒（如红细胞、乳胶颗粒等）的表面，成为致敏颗粒后与相应抗体（或抗原）结合出现的凝集现象。间接凝集反应可分为正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应四类。其敏感性高于沉淀反应和直接凝集反应，临床上应用广泛，常用于检查甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、绒毛膜促性腺激素（HCG）、可溶性微量抗原诊断。

3．间接凝集抑制反应 将可溶性抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的颗粒物，不出现凝集现象称间接凝集抑制反应。

（四）沉淀反应

沉淀反应是指可溶性抗原和相应抗体在适当的条件下形成肉眼可见的沉淀物。沉淀反应可分为液体内沉淀试验（如絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度分析）和凝胶内沉淀试验（如免疫扩散试验、免疫电泳技术）。沉淀反应常用于血浆药物浓度、蛋白质的测定，如血清免疫球蛋白和补体含量的测定。

1．单向免疫扩散试验 将琼脂与抗体混匀后浇注成板，凝固后在板上打孔，孔中加入抗原，抗原向孔的四周扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度呈正相关。单向免疫扩散试验常用于定量测定血清IgG、IgM、IgA和C3等（图10-2）。

2．双向免疫扩散试验 在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体，当抗原和抗体向四周扩散后两孔间可出现沉淀线。本法用于抗原（或抗体）的定性或定量检测，用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体）；可鉴定抗原性物质或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等（图10-3）。

3．免疫电泳试验 琼脂板的小孔内加入抗原进行电泳，琼脂板中央挖一横槽，加入已知相应的免疫血清，相互扩散一定时间后，在抗原和抗体比例最适处可形成沉淀弧。参照已知抗原、抗体形成的电泳图，根据沉淀弧的外形、数量和位置，即可分析样品中所含成分。本法主要用于以下几方面：抗原、抗体的纯度检测；抗体各组分的研究；各种疾病中血清蛋白组分的分析，如多发性骨髓瘤、肝病、全身性红斑狼疮等。

4．免疫比浊法 在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。本法快速、简便、敏感，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。

（五）免疫标记技术

免疫标记技术是指用已知抗原（或抗体）标记上易显示的物质，通过检测标记物，间接测定抗原—抗体复合物的方法。免疫标记技术具有快速、灵敏、可定性（或定量），甚至定位的优点，成为目前应用最广泛的免疫学检测技术。常见的标记物有酶、荧光素、放射性核素、胶体金、化学发光物质等。

1．酶免疫技术 酶免疫技术是将酶的高效催化反应的专一性和抗原—抗体反应的特异性相结合，通过酶作用于底物而显色，证明发生了相应免疫反应的一种免疫检测技术。按实际应用分为酶免疫组化技术和酶免疫分析技术两大类。

（1）酶免疫组化技术：酶免疫组化技术是应用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体在组织细胞原位与抗原发生反应，通过化学反应显色，对相应抗原进行定量、定性、定位的检测技术。该技术主要用于细胞表面的抗原、组织切片中的抗原（如肿瘤）的检测，自身免疫疾病的诊断，寄生虫的检测，病毒、细菌的鉴定等。

（2）酶免疫分析技术：酶免疫分析技术（EIA）是用酶标记抗原（或抗体）检测特异性抗原（或抗体）含量的一种微量分析技术，主要用于可溶性抗原或抗体的定量和定性测定。常用的标记物有碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）等。常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）等。酶联免疫吸附试验是将已知的抗原（或抗体）吸附在某固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，酶标记抗原—抗体反应后结合到固相载体上，用洗涤的方法将液相中的游离成分洗除，最后加入酶反应的底物，根据反应的颜色深浅来进行定量或定性分析。因具有简便、快速、特异性强等优点，该技术成为应用最广的酶免疫分析技术。ELISA三种必要的试剂为：①免疫吸附剂：固相的抗原或抗体；②标记物：酶标记的抗原或抗体；③显色剂：酶反应的底物。最常用方法有检测抗体的间接法以及检测抗原的双抗体夹心法（图10-4）。

1）间接法：将抗原包被在固相载体上，加入待检标本后特异性结合形成固相抗原—待检抗体复合物，洗涤后加入酶标记抗抗体（又名酶标二抗）形成固相抗原—待检抗体—酶标二抗复合体，加底物显色，判定标本中抗体的含量。间接法用于检测梅毒螺旋体抗体、人免疫缺陷病毒抗体等的检测。

2）双抗体夹心法：将特异性抗体与固相载体结合形成固相抗体，与待检标本中的相应抗原形成固相抗原—抗体复合物，洗涤后加入的酶标记抗体与免疫复合物中的抗原结合形成固相抗体—抗原—酶标抗体复合物，加底物显色，根据显色程度进行抗原的定量或定性检测。这是一种非竞争结合测定，常用于甲胎蛋白、乙肝表面抗原等检测。

2．免疫荧光技术 免疫荧光技术是将抗原—抗体反应与荧光标记检测结合起来的一种免疫标记技术，具有直观性、敏感性和特异性，可用于自身抗体检测来辅助诊断自身免疫病、肿瘤相关抗原鉴定、淋巴细胞亚群的鉴定、病原体抗原或抗体检测等。

3．放射免疫测定法 放射免疫测定法是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定，具有准确性高、重复性好等优点，临床用于测定激素水平、药物、肿瘤标志物、病原体抗原或抗体等。

4．免疫印迹技术 免疫印迹技术是用凝胶电泳分离得到的蛋白质转移到固相载体膜上，再用标记的抗体对蛋白质进行定性或定量分析的技术，具有敏感性高、特异性强、分析容量大等优点，广泛用于医学研究，如检测蛋白质特性和分布、HIV感染的确认等。

二、免疫细胞及其功能的检测

免疫细胞是免疫系统的基本功能单位，泛指与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，包括淋巴细胞、单核—巨噬细胞、粒细胞等，可以通过对免疫细胞进行分离后检测其数量及功能。

（一）免疫细胞的分离

目前，用于人体免疫学研究的单个核细胞主要来源于外周血，外周血也是免疫功能检测最常用的材料，外周血中含有红细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板等。在体外测定免疫细胞的功能，需从待检材料中分离所需细胞。由于细胞表面标志、理化性状及功能等存在各种差异，所以可根据其特点设计不同方法进行分离。先用葡聚糖—泛影葡胺密度梯度离心法分离出单个核细胞，又用吸附柱过滤法（或Percoll分离液法、贴壁黏附法）得到纯化的淋巴细胞，再用E-花环试验或尼龙毛分离法分离T细胞或B细胞，用流式细胞仪分离技术（或磁珠分离法）可进一步鉴定T细胞亚群和某些特定类型。

1．外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（PBMC）包括单核细胞和淋巴细胞。常用的分离方法是葡聚糖—泛影葡胺密度梯度离心法。血小板比重为1.030～1.035，单个核细胞的比重为1.075～1.090，多核白细胞和红细胞比重为1.092左右，层次非常明显。将单个核细胞层吸出，经洗涤后便可用于某些试验。

2．淋巴细胞的分离 根据密度离心分离得到的单个核细胞包括单核细胞和淋巴细胞，需把单核细胞去除后才能得到纯化的淋巴细胞。纯化可借助吸附柱过滤法，即利用单核细胞具有贴壁生长的特点，从柱上洗脱下来的主要是淋巴细胞。

3．淋巴细胞及其亚群的分离 淋巴细胞中含有T、B淋巴细胞，需进一步分离，分离的方法很多，比较成熟的方法有E-花环试验、免疫磁珠分离技术、流式细胞术等。

（1）E-花环试验：指T细胞表面的绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子/E受体）与SRBC结合形成玫瑰花环。E-花环密度大，易沉底，分离后可获得纯化的T细胞，可以用于外周血中T细胞数量和功能的检测。

（2）免疫磁珠分离技术（IMB）：是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术。其原理是磁珠上的抗体与特异性抗原物质结合后，形成抗原—抗体—磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离。如采用抗CD3（CD4或CD8）特异性抗体IMB可分离T淋巴细胞（CD4+T或CD8+T淋巴细胞）。

（3）流式细胞术（FCM）：是利用流式细胞仪为检测手段对单个细胞定量分析和分选的新技术，可用于淋巴细胞及其亚群的分析、淋巴细胞功能分析、艾滋病患者CD4+T或CD8+T淋巴细胞数量检测等。

（二）免疫细胞功能的测定

检测T、B细胞的数量及功能有助于某些疾病的辅助诊断、疗效观察及科研分析。

1．T细胞功能测定

（1）T细胞增殖试验（淋巴细胞母细胞转化）:T细胞受抗原或有丝裂原（植物血凝素、刀豆蛋白A、美洲商陆等）刺激后，细胞形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，并转化为淋巴母细胞，用于了解细胞增殖情况。T细胞增殖试验有形态学检查法、3H-TdR渗入法、MTT比色法三种。

（2）T细胞分泌功能测定：T细胞受各种抗原或丝裂原刺激后分泌各种细胞因子，反映T细胞功能。

（3）T细胞介导的细胞毒试验：细胞毒性T细胞（CTL）经抗原刺激后，可特异性杀伤具有抗原的靶细胞，可用形态学检查、51Cr释放法、细胞增殖评价法了解靶细胞被杀伤情况。

（4）体内试验：①特异性抗原皮肤试验：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原做皮试可导致迟发型超敏反应。如结核菌素试验，用旧结核菌素（OT）注射到受试者前臂，于24～48h后观察局部是否有红肿和硬结，硬结直径大于0.5cm者为阳性。②PHA皮肤试验：将定量PHA注射到受试者前臂皮内，可非特异性刺激T细胞发生母细胞转化，呈现以单个核细胞浸润为主的炎症反应，常用于检测机体的细胞免疫水平。

2．B细胞功能测定B细胞在抗原刺激下，增殖分化为浆细胞分泌免疫球蛋白，介导体液免疫应答，若B细胞功能低下或缺乏，特异性抗体的产生将会减少或缺损。

（1）可通过单向琼脂扩散法、速率比浊法、ELISA法等测定标本中的IgM、IgG、IgA等各类Ig的含量。

（2）溶血空斑试验：指抗体生成细胞所产生的抗体与SRBC表面相应抗原表位结合，加入新鲜补体后，补体溶解细胞，形成肉眼可见的溶血空斑。空斑数为抗体形成细胞数；空斑大小为抗体形成细胞产生抗体的多少。

案例分析

李某，男，24岁，间断发热8个月，发热伴腹胀、腹痛7天到医院就诊，患者自从发病以来，体重下降6kg。既往体健，无吸毒和输血史，有不洁性行为史。查体：口腔内可见白色片状膜性物。HIV初筛阳性。

1．要确认HIV感染，需要做什么免疫学检测？

2．在AIDS疾病治疗过程中，要用什么方法检测CD4+T或CD8+T淋巴细胞数量？