第二节　色谱法基本理论

一、色谱图及有关术语

1.色谱流出曲线——色谱图

当组分进样后，经过色谱柱到达检测器所产生的响应信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线，也叫色谱图，如图3-1所示。曲线上突起的部分就是色谱峰。

色谱流出曲线是色谱基本参数的基础，而色谱基本参数又是观察色谱行为和研究色谱理论的重要尺度，从谱图上可以获得以下信息。

①在一定的色谱条件下，可看到组分分离情况及组分的多少。

②每个色谱峰的位置可由每个峰流出曲线最高点所对应的时间表示，以此作为定性分析的依据，不同的组分，峰的位置也不同。

③每一组分的含量与这一组分相对应的峰高或峰面积有关，峰高或峰面积可以作为定量分析的依据。

④通常在色谱分析中，进样量很少，因此得到的色谱峰多为对称的，呈正态分布的曲线。可以通过观察峰的分离情况及扩展情况，判断柱效好坏，色谱峰越窄，柱效越高，色谱峰越宽，柱效越低。

⑤色谱柱中仅有纯流动相通过检测器时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。可以通过观察基线的稳定情况来判断仪器是否正常。

2.色谱曲线常用术语

（1）色谱峰　组分随流动相通过色谱柱和检测器时，响应信号随时间的变化曲线。

（2）峰底　峰的起点与终点之间的连接直线，即图3-1中的CD。

（3）峰高（h）　从峰最大值到峰底的距离，即图3-1中的BE。

（4）峰底宽度（W）　峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离，即图3-1中的KL。

（5）半峰宽（W1/2）　峰高一半处的峰宽，即图3-1中的HJ。

（6）标准偏差（σ）0.607倍峰高处所对应的峰宽的一半，即图3-1中的。

二、色谱基本参数

（1）死时间（tM）　不被固定相保留的组分从进样开始到柱后出现浓度极大值所需要的时间，单位为min，即图3-1中tM。

（2）保留时间（tR）　待测组分从进样开始到柱后出现浓度极大值所需要的时间，即图3-1中tR。

（3）调整保留时间（）　柱温恒定时，减去死时间的保留时间，即图3-1中。

（4）校正保留时间柱温恒定时，经压力梯度校正因子（j）校正后的保留时间。

　　 （3-2） 　　

（5）净保留时间（tN）　用压力梯度校正因子校正后的调整保留时间。

　　 （3-3） 　　

（6）死体积（VM）　不被固定相保留的组分从进样开始到柱后出现浓度极大值时通过的流动相体积。相当于分离系统中除固定相外，流动相所占的体积，也可以说是色谱柱中所有空隙的总体积。

VM=tMFc　　（3-4）

式中，Fc为流动相流速，ml·min-1。

（7）保留体积（VR）　待测组分从进样开始到柱后出现浓度极大值时所通过的流动相体积，单位为ml。

VR=tRFc　　（3-5）

（8）调整保留体积减去死体积的保留体积。

　　 （3-6） 　　

（9）校正保留体积用压力梯度校正因子（j）校正后的保留体积。

　　 （3-7） 　　

（10）净保留体积（VN）　用压力梯度校正因子校正后的调整保留体积。

　　 （3-8） 　　

（11）比保留体积（Vg）　单位质量固定液柱温校正到273K时的净保留体积。

　　 （3-9） 　　

式中，Tc为色谱柱温度，K；mL为固定液质量，g。

（12）相对保留值（γ21）　在同一色谱柱中，某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比。

　　 （3-10） 　　

在多组分混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种情况下，可用符号α表示，称为选择因子。

　　 （3-11） 　　

式中，为后出峰组分的调整保留时间，所以α总是大于1的。

（13）相比（β）色谱柱中流动相与固定相体积之比。

　　 （3-12） 　　

式中，Vm为色谱柱中流动相体积；Vs为色谱柱中固定相体积。

（14）分配系数（K）　在一定温度下，当组分分配达到平衡时，组分在固定相与流动相中的浓度之比。

　　 （3-13） 　　

式中，cs为在平衡状态时，组分在固定相中的浓度；cm为在平衡状态时，组分在流动相中的浓度。

（15）容量因子（k）　也称分配比，是达到平衡状态时，组分在固定相与流动相中的质量之比。

　　 （3-14） 　　

（16）载气流速（Fc）　在室温下测得，并校正到柱温（Tc）时的载气体积流速。

　　 （3-15） 　　

式中，F0为室温下柱出口载气体积流速，ml·min-1；Tr为室温，℃。

（17）压力梯度校正因子（j）　用于校正色谱中由于作为流动相的气体的可压缩性，在色谱柱进口与出口之间所产生的压力梯度。可用下式计算

　　 （3-16） 　　

式中，pi为色谱柱入口压力；p0为色谱柱出口压力。

（18）载气平均线速度载气沿色谱柱轴向移动的平均速度。

　　 （3-17） 　　

式中，L为色谱柱长。

三、色谱保留值和容量因子的关系

色谱保留值表示组分和固定相相互作用的能力，宏观上表现出峰时间的长短，以及耗用流动相体积的大小。组分保留时间或保留体积均能说明组分与固定相作用的强弱，这主要由组分在两相分配、分离过程中的热力学因素所决定。

根据保留时间的定义式，可以获得一系列推导公式。

　　 （3-18） 　　

容量因子k在色谱柱分配平衡过程中是评价色谱柱对组分保留能力的重要参数。k值越大，组分保留值越大；当k=0时，则表示该组分在柱中不被保留，即和固定相不发生作用，此时该组分的保留时间就是tM。当正常组分通过色谱柱时，可由关系式较容易地求出任一组分的k值。

四、塔板理论

1941年詹姆斯（James）和马丁（Martin）提出塔板理论，并用数学模型描述了色谱分离过程。他们把色谱柱比作一个精馏塔，借用精馏塔中塔板的概念、理论来处理色谱过程，并用理论塔板数作为衡量柱效率的指标。

塔板理论把组分在流动相和固定相间的分配行为看作在精馏塔中的分离过程，柱中有若干块想象的塔板，一个塔板的长度称为理论塔板高度。在每一小块塔板内，一部分空间被固定相占据，另一部分空间充满流动相。当组分随流动相进入色谱柱后，在每一块塔板内很快地在两相间达到一次分配平衡，经过若干个假想塔板的多次分配平衡后，分配系数小的组分先离开色谱柱，分配系数大的组分后离开色谱柱，从而达到彼此分离。虽然色谱柱中并没有实际的塔板，但这种半经验的理论处理基本上能与稳定体系的实验结果相一致。

在色谱法中，一般色谱柱的塔板数很大，约为103～106，此时的流出曲线趋近于正态分布曲线，流出液的浓度c与流动相体积V的关系可用正态方程来描述。即

　　 （3-19） 　　

式中，c为流动相体积为V时的组分浓度；m为组分质量；VR为组分的保留体积；n为理论塔板数。

（1）当V=VR时，c值最大，即

　　 （3-20） 　　

（2）当时，式（3-19）可写成

　　 （3-21） 　　

由式（3-21）可得n与保留时间tR、半峰宽以及峰底宽W的关系为：

　　 （3-22） 　　

从而可求得理论塔板高，即

　　 （3-23） 　　

式中，L为色谱柱的长度；H为理论塔板高。

由式（3-22）和式（3-23）可见，色谱峰越窄，理论塔板数n越大，理论塔板高度H就越小，则柱效能就越高，分离能力就越强。

在实际应用中，经常出现计算出来的n值尽管很大，H很小，但色谱柱的分离能力却不高的现象。这是由于采用tR计算时，并未扣除死时间tM，而死时间并不参与柱内的分配。因而提出了用扣除死时间后的有效理论塔板数neff和有效理论塔板高度Heff作为柱效能指标。

　　 （3-24） 　　

　　 （3-25） 　　

由于不同物质在同一色谱柱的分配系数不同，所以同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的。因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出是用什么物质进行测量的。

塔板理论用热力学观点解释了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出了流出曲线的数学模型，提出了计算和评价柱效的参数。但是，色谱过程不仅受热力学因素影响，同时还与分子扩散、传质等动力学因素有关。因此，塔板理论只能定性地给出塔板高度的概念，却不能给出影响塔板高度的因素，因而无法解释造成色谱扩展使柱效能下降的原因及不同流速下可以测得不同理论塔板数的事实。

五、速率理论

1956年荷兰学者范第姆特（Van Deemter）等人在研究气液色谱时，提出了色谱分离过程的动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中塔板高度的概念，同时考虑了影响塔板高度的动力学因素，指出理论塔板高度是色谱峰展宽的量度，导出了塔板高度与载气线速度的关系式。此关系式称为速率理论方程式，简称范氏方程。范氏方程的数学简化式为

　　 （3-26） 　　

式中，u为流动相的线速度；A为涡流扩散项系数；B为分子扩散项系数；C为传质阻力项系数。

虽然速率理论是在研究气液色谱的基础上提出的，但作适当修改，也适用于其他色谱方法。

以下分别讨论式（3-26）中各项的物理意义。

1.涡流扩散项（A）

在填充色谱柱中，载有组分分子的流动相碰到填充物颗粒时，不断地改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。

由于填充物颗粒大小的不同及其填充的不均匀性，使组分分子通过色谱柱时的路径长短不同，因而，同时进入色谱柱的相同组分在柱内停留的时间不同，到达柱子出口的时间有先有后，导致色谱峰变宽，其变宽的程度由下式决定

A=2λdp　　（3-27）

式中，λ为填充不规则因子；dp为填充物颗粒的平均直径。式（3-27）表明，使用颗粒细、粒度均匀的填充物且填充均匀，是减小涡流扩散和提高柱效的有效途径。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，即A=0。

2.分子扩散项（B/u）

分子扩散项又称纵向扩散，是由浓度梯度造成的。组分进入色谱柱后，是以“塞子”的形式存在于柱的很小一段空间内，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为

B=2γDg　　（3-28）

式中，γ为弯曲因子，是由固定相引起的，它反映了固定相颗粒的几何形状对分子纵向扩散的阻碍程度。对填充柱γ=0.5～0.7，对毛细管柱γ=1；Dg为组分在流动相中的扩散系数，其大小与组分的性质、流动相的性质及柱温等因素有关。相对分子质量大的组分，扩散不易，Dg小。Dg反比于流动相相对分子质量的平方根，并随柱温的升高而增大。因此，在气相色谱中，为了减小分子扩散项，可采用较高的流动相线速度，使用相对分子质量较大的流动相，采用较低的柱温等。组分在液体中的扩散系数约为气体的，故在液相色谱中，纵向分子扩散一般可忽略。

3.传质阻力项（Cu）

由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之。

对于气液色谱，传质阻力项中的系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl，即

C=Cg+Cl　　（3-29）

Cg是指组分分子从气相移动到固定相表面进行浓度分配时所受到的阻力。

　　 （3-30） 　　

式中，k为容量因子。由式（3-30）可见，气相传质阻力与填充物粒径dp的平方成正比，与组分在气相中的扩散系数Dg成反比。因此，采用粒径小的填充物和相对分子质量小的气体（如H2）作载气，可减小Cg，提高柱效。

Cl是指组分分子从固定相的气液界面移动到液相内部进行质量交换达到分配平衡，又返回到气液界面的过程中所受到的阻力。

　　 （3-31） 　　

由式（3-31）可见，固定相的液膜厚度df越薄，组分在液相中的扩散系数Dl越大，则液相传质阻力就越小。降低固定液用量或采用比表面积较大的担体，可以降低液膜厚度，提高柱效。

将式（3-27）、式（3-28）、式（3-30）和式（3-31）代入式（3-26）中，即可得到气液色谱的范氏方程，即

　　 （3-32） 　　

由式（3-32）可知，塔板高度H与流动相的流速有关，此外还与柱的种类、柱填充的均匀性，载体的粒度，流动相的相对分子质量，固定液的种类及液膜厚度，以及柱温等多种因素有关。因此，式（3-32）是指导选择色谱分离操作条件的依据，具有重要的实际意义。

对于液液色谱，传质阻力系数C包含流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs，即

C=Cm+Cs　　（3-33）

其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力［式（3-34）右边第一项］和滞留的流动相中的传质阻力［式（3-34）右边第二项］，即

　　 （3-34） 　　

式中，ωm是与柱和填充性质有关的系数；ωsm是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关的系数；Dm为试样分子在流动相中的扩散系数；dp为固定相的粒径。由式（3-34）可知，固定相的粒径越小，试样分子在流动相中的扩散系数越大，传质速率就越快，柱效就越高。

液液色谱中固定相传质阻力系数Cs可用下式表示

　　 （3-35） 　　

式中，ωs是与容量因子有关的系数；Ds为试样分子在固定液中的扩散系数；df为液膜的厚度。由式（3-35）可知，试样分子从流动相进入到固定液内进行质量交换的传质过程与液膜厚度的平方成正比，与试样分子在固定液的扩散系数成反比，即液膜越薄，试样分子在固定液的扩散系数越大，传质速率就越快，柱效就越高。

综上所述，对液液色谱的范氏方程，可表示为

　　 （3-36） 　　

式（3-36）与气液色谱范氏方程式（3-32）的形式基本一致，主要区别是在液液色谱中纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。

4.速率方程式讨论

根据速率方程式，测定不同流速下的塔板高度H，做气相色谱（GC）和液相色谱（LC）的H-u曲线，如图3-2所示。

由图3-2可见，GC和LC的板高H与流速u的变化关系有相同之处也有不同之处。LC的纵向扩散非常小，u与H的关系较简单。这是由于LC的纵向扩散系数和传质阻力系数都与GC有所不同。因纵向扩散B/u在LC中很小，故H主要由传质阻力项Cu决定，即流速u越大，板高H亦越大；而在GC中纵向扩散明显，在低流速时，纵向扩散尤为明显，在此区域，增大u可使H变小，如图3-3所示。但是随着u的继续增大，传质阻力也会增加，所以在高流速区，Cu对H的影响更大一些。在GC的H-u曲线上存在一个最低点，即对应于u最佳和H最小的一点，而在LC的H-u曲线上很难找到这一点。

GC的最佳流速可以通过实验和计算求出，将式（3-26）微分得

　　 （3-37） 　　

　　 （3-38） 　　

　　 （3-39） 　　

　　 （3-40） 　　

5.速率方程中三个参数A、B和C的求法

①选择3种相差较大的不同流速u，测得3张色谱图。

②在3张色谱图中选择某个峰，分别求出3种u及对应的板高H。

③由已知的u和H建立3个速率方程，解联立方程求取A、B和C。

例如，某有机化合物于2m长的色谱柱上，在3种不同的载气流速下，测得的数据如下表。

求H=A+B/u+C中的A、B和C。

解：先求u和n，后求H。

　　 如 　　

同理，可求取u2和u3下的H2和H3，得另两个方程为

解此三元一次方程组，即可求得A、B和C的具体数值。

六、分离度

1.分离度的定义

分离度也称分辨率，是指相邻两个峰的分离程度，用R表示，常用其作为柱的总分离效能指标。其大小为相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽度总和的一半的比值，即

　　 （3-41） 　　

由式（3-41）可见，两峰保留值相差越大，峰越窄，R值就越大，相邻两组分分离得就越好。一般来说，当R<1时，两峰总有部分重叠；R=1，分离程度可达95％，两峰基本分开；R=1.5，分离程度达99.7％。通常用R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。

相邻两组分保留时间的差值反映了色谱分离的热力学性质，色谱峰的宽度反映了色谱过程的动力学因素。因此，分离度包括了两方面的因素，并定量地描述了混合物中相邻两组分的实际分离程度。

2.分离度与柱效能、选择性的关系

分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。实际上，分离度R受柱效n、选择因子α和容量因子k三个参数的影响。若能找出它们之间的关系，便可借助于这些参数来控制分离度。对于相邻两组分，由于它们的分配系数差别小，可近似地取，W1W2=W，由式（3-22）得

　　 （3-42） 　　

将式（3-42）和tR=tM（1+k）代入式（3-41），整理后得

　　 （3-43） 　　

式（3-43）即为色谱分离的基本方程式，它反映了分离度与柱效、选择因子和容量因子三者的关系。由式（3-43）知，可以通过提高塔板数n、增加选择因子α和容量因子k来改善分离度。增加柱长，制备出性能优良的色谱柱可以提高n值；改善固定相，使各组分的分配系数有较大的差别，可增加α；改变流动相（液相色谱）或固定相（气相色谱），改变柱温可使k改变，通常将k控制在2～7之间。

在实际应用中，往往用neff代替n，此时R的表达式为

　　 （3-44） 　　

于是可得柱长L为

　　 （3-45） 　　

由式（3-45）可计算出达到某一分离度所需要的色谱柱长度。