第五节　高效液相色谱法

一、概述

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种分离分析技术。它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，使之发展成为具有高效、高速、高灵敏度的液相色谱技术，亦称为现代液相色谱法，目前已成为应用极为广泛的一种重要分离分析手段，特别是对高沸点、热不稳定性有机化合物、天然产物及生化试样的分析有着其他分析方法无法取代的地位。

与经典液相色谱法相比，HPLC的突出特点见表3-6。

高效液相色谱仪通常是在室温下操作，在特殊情况下，也可在30～40℃的柱温下操作。样品一般不需处理，操作简便。

高效液相色谱柱制备要有较高技术，高效填料一直是各专业厂家严守的机密。在高效液相色谱中，组分的分离依赖于组分、固定相和流动相三者之间的作用力，即一旦合适的色谱柱选定之后，色谱分离的好坏就在于选择合适的流动相。可作为流动相的溶剂很多，因此分离操作的关键是流动相的选择。

高效液相色谱不仅用于分析目的，有时也应用制备色谱来制备少量纯样品。

目前，高效液相色谱发展集中在三个方面：①高效填料、高效柱在色谱领域备受关注，是专业厂商争夺的市场；②使用微柱（柱径小于1mm）可使溶剂用量非常少，既降低成本，又减少污染，但为配合微柱使用，进样装置、检测器以及泵都要小，仪器制造困难；③发展更通用、灵敏度更高的检测器。

二、高效液相色谱法的主要类型

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法和离子对色谱法等几种主要类型。

1.液固吸附色谱法

吸附色谱（adsorption chromatography），也称之为液固色谱（liquid solid chromatography）。吸附一词可能更准确地反映这类分离过程的本质。

液固吸附色谱是利用不同组分的分子在固定相上吸附能力的差异而分离的。固定相是吸附剂，流动相是以非极性烃类为主的溶剂。当流动相通过固定相时，固定相表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子被流动相带入柱内时，只要它们在固定相有一定程度的保留，就会取代数目相当的已被吸附的流动相分子。于是，在固定相表面发生了试样分子与流动相分子的吸附竞争，可用下式表示

当竞争吸附达到平衡时，吸附平衡常数K为：

　　 （3-77） 　　

式中，X为试样分子；M为流动相分子；m为流动相；a为吸附剂；n为M被X取代的分子数目；［X］a和［M］a分别代表吸附剂中试样分子和流动相分子的平衡浓度，［X］m和［M］m则分别代表它们在流动相中的平衡浓度。

不同组分分子与吸附剂分子间作用力不同，从而表现出不同组分的吸附平衡常数不同而得到最终分离。K值大的强极性组分易被吸附，保留值大，难于洗脱；K值小的弱极性组分难被吸附，保留值小，易于洗脱，试样中各组分据此得以分离。

液固吸附色谱由于传质快，装柱容易，重现性较好，20世纪70年代前期曾得到广泛应用。其不足之处是试样容量小，需配用高灵敏度的检测器。液固吸附色谱适用于分离极性不同的化合物、异构体和进行族分离，不适于分离含水化合物和离子型化合物。

2.液液分配色谱法

液液分配色谱（liquid-liquid partition chromatography）是根据组分在两种互不相溶的液体（即固定相与流动相）中溶解度不同而实现分离的方法。在液液色谱中，固定相是通过化学键合的方式固定在基质上。组分在互不相溶的两相中的溶解情况，可用下式表示

当分配达到平衡时，分配系数为

　　 （3-78） 　　

式中，Xm为流动相中的组分分子；Xs为固定相中的组分分子。

不同组分的分配系数不同，这是液液分配色谱中组分之所以能被分离的根本原因。

液液分配色谱根据固定相和流动相的相对极性，可分为正相分配色谱和反相分配色谱两类。在正相分配色谱中，固定相的极性大于流动相的极性，组分在柱内的洗脱顺序按极性从小到大流出。在反相色谱中，固定相是非极性的，流动相是极性的。组分的洗脱顺序和正相色谱相反，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。

在液液分配色谱中，流动相和固定相均为液体，作为固定相的液体是涂在或键合在很细的惰性载体上，可用于极性、非极性、水溶性、油溶性、离子型和非离子型等各种类型样品的分离和分析。

3.离子交换色谱法

离子交换色谱（ion exchange chromatography）是以离子交换剂作固定相的一种液相色谱技术，它是利用被分离组分与固定相之间发生离子交换能力的差异而实现分离的。凡是在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离，它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离（如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子），因此应用范围较广。

离子交换剂上分布有固定的带电荷基团和与之平衡的可交换离子，当流动相带着组分离子通过固定相时，交换剂上的可交换离子与流动相中具有相同电荷的组分离子进行可逆交换，其过程可用下式表示。

　　 阳离子交换

　　 阴离子交换：

对阳离子交换反应是流动相中的待测阳离子（M+）与交换剂上的阳离子（H+）进行交换，对阴离子交换是待测阴离子（X-）与交换剂上的阴离子（Cl-）进行交换，交换达到平衡时，以浓度表示的平衡常数（亦称离子交换反应的选择系数）为

　　 （3-79） 　　

　　 （3-80） 　　

平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换剂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲和力，因此具有不同的平衡常数。亲和力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。一般说来，待测离子的电荷数越大，水合离子的半径越小，平衡常数K就越大。

对于典型的磺酸型阳离子交换剂，一价离子平衡常数K的顺序为：

二价离子K的顺序为：

Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+，Zn2+>Mg2+

对于季铵型强碱性阴离子交换剂，各阴离子K的顺序为：

>I->>SCN->>Br->>CN->Cl->>OH->

>>>CH3COO->F-

4.体积排阻色谱法

体积排阻色谱法（size exclusion chromatography）又称凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography），以具有一定大小孔径分布的凝胶为固定相，以能溶解被分离组分的水或有机溶剂为流动相，依据被分析组分分子流体力学体积的大小，也就是按组分相对分子质量的大小进行分离。相对分子质量为100至8×105的任何类型化合物，只要在流动相中是可溶的，都可用体积排阻色谱法进行分离。

体积排阻色谱的基本原理是利用凝胶中孔径的大小不同而对大小不同的分子进行分离的。

当流动相携带组分进入色谱柱后，大于凝胶孔径的组分大分子，因不能渗入孔内而被流动相携带着沿颗粒间隙最先流出色谱柱；中等体积组分的分子能渗透到某些孔隙，但不能进入另一些更小的孔隙，它们以中等速度流出色谱柱；小体积的组分分子可以进入所有孔隙，因而被最后淋洗出色谱柱。

柱流动相体积可分为两部分，一部分为粒间体积Vo，另一部分为孔隙体积Vp。其关系式为

Ve=Vo+KdVp　　（3-81）

式中，Ve为保留体积，也称洗脱体积；Vo为粒间体积；Vp为孔隙体积，且Vo+Vp=Vm，Vm是总的流动相体积；Kd为分布系数。

根据式（3-81）可得

　　 （3-82） 　　

如果是大分子（大到所有的孔都进不去），则Ve=Vo，Kd=0；

如果是小分子（小到所有的孔都能进去），则Ve=Vm，Kd=1；

一般组分得到分离的区间必须是0≤Kd≤1。

在排阻色谱中，组分和流动相、固定相之间没有力的作用，完全根据组分分子流体力学体积的大小进行分离。

体积排阻色谱法被广泛用于测定高聚物的相对分子质量及相对分子质量分布。它具有保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器、柱寿命长等优点。其缺点是不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。

5.离子对色谱法

离子对色谱法（ion pair chromatography）是离子对萃取技术与色谱法相结合的产物，是与离子交换色谱分离机理完全不同的一种方法，特别适合分离分析强极性有机酸与有机碱。

离子对色谱法是将一种（或多种）与待测离子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加入到流动相或固定相中，使其与待测离子结合形成疏水的离子对化合物，从而控制待测离子的保留行为。关于离子对色谱法的机理，至今仍不十分明确，已提出的机理有离子对形成机理、离子交换机理、离子相互作用机理等，现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对体系，其固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种与待测离子A+带相反电荷的离子B-，A+和B-由于静电引力结合，形成离子对化合物A+B-，此离子对易溶入有机相，并在两相间进行分配。

式中，下标W为水相，O为有机相。

当分配达到平衡时，其平衡常数KAB可表示为

　　 （3-83） 　　

由于待测离子的性质不同，与反离子形成离子对的能力不同，以及形成的离子对疏水性质的不同，导致待测的各离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同而彼此分开。

现代离子对色谱是20世纪70年代初期发展起来的，它主要分为正相离子对色谱和反相离子对色谱两类。正相离子对色谱是以具有不同pH值的缓冲溶液为固定相、有机溶液为流动相，而反相离子对色谱是以有机相为固定相、水溶液为流动相。目前最常用的是反相离子对色谱，它兼有反相色谱的特点，如操作简便、柱效高、分析速度快，而且能同时分离分析离子型化合物和中性化合物，在许多领域获得应用，特别是一些难分离的生化试样如核酸及其降解产物、氨基酸及其衍生物、肽和多肽以及蛋白质混合物等都可用该法进行分离检测。

6.高效液相色谱法的选择

在解决某一试样的分析任务时，如何正确地选择一种合适的液相色谱分离方法，是分析工作者需要解决的首要问题。通常是根据样品的性质，如相对分子质量的高低、水溶性还是非水溶性、离子型还是非离子型、极性的还是非极性的以及分子结构如何等来选择，选择方法可参考图3-20。

三、高效液相色谱固定相及流动相

由于在液相色谱中，存在着组分与固定相和流动相三者之间的作用力，因此固定相与流动相的选择是完成分离的一个重要因素。

1.液固吸附色谱法

（1）固定相　液固吸附色谱的固定相多为具有吸附活性的吸附剂，分为极性与非极性两大类。极性固定相主要有硅胶、氧化铝、硅酸镁分子筛等；非极性固定相主要有高分子多孔微球、高强度多孔活性炭微粒等，其中硅胶是应用最广泛的一种，表3-7列出了部分常用液固色谱的吸附剂。

①极性固定相。在极性固定相中，硅胶和硅酸镁为酸性吸附剂（表面pH=5），氧化铝和氧化镁为碱性吸附剂（表面pH=10～12）。若用酸性吸附剂分离碱性物质（如胺类），则可能造成色谱峰严重拖尾或永久性吸附，解决的办法是向流动相中加入少许碱性物质（如三乙胺），反之亦然。市售的商品硅胶吸附剂，表面皆为氢键型硅羟基，表现出很强的吸附活性，易发生化学吸附，造成色谱峰拖尾，解决的办法是向硅胶柱中加入少量极性改进剂，如在流动相中加入适量水，使其由氢键型硅羟基转化成对样品有适当吸附作用的游离型硅羟基。硅胶主要用于分离溶于有机溶剂的极性至弱极性的分子型化合物。由于硅胶的吸附活性中心具有一定的几何排列顺序，因此也用来分离某些几何异构体。

②非极性固定相。在非极性固定相中，应用最多的是高分子多孔微球，也称为有机胶。它是高交联度的苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球，可用于分离芳烃、杂环、甾体、生物碱、油溶性维生素、芳胺、酚、酯、醛、醚等化合物，还可分离相对分子质量较小的化合物。其分离机制多数认为属于吸附作用，也有认为吸附与分配兼有，并具有小孔凝胶的作用。

（2）流动相　液相色谱中流动相的作用非常重要，对于特定的分离对象，分离选择性和分离速度主要通过选择合适的流动相来实现。在液固吸附色谱中常用斯奈德（L.R.Snyder）提出的溶剂强度参数ε°来表示溶剂的洗脱强度。ε°定义为溶剂分子在单位吸附剂表面的吸附自由能，表示溶剂分子对吸附剂的亲和程度。ε°值越大，表明溶剂与吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来，即对溶质的洗脱能力越强，从而使溶质在固定相上的容量因子越小。依据各种溶剂在吸附剂上的ε°值的大小，可判断其洗脱能力的差别。将洗脱溶剂按ε°值的大小顺序排列起来，则构成溶剂的洗脱系列。表3-8列出了不同溶剂在硅胶和氧化铝上的ε°值。

在液固吸附色谱中，若使用硅胶、氧化铝等极性固定相，应以ε°值小的弱极性戊烷、己烷、庚烷作流动相的主体，再适当加入二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯等中等极性溶剂，或四氢呋喃、乙腈、甲醇、水等极性溶剂作为改性剂，以调节流动相的洗脱强度，实现样品中不同组分的良好分离。若使用高分子多孔微球等非极性固定相，应以ε°值大的水、甲醇、乙醇等极性溶剂作为流动相的主体，可加入四氢呋喃、乙腈等改性剂，以调节流动相的洗脱强度，实现样品中各组分的良好分离。

在液固吸附色谱中，对复杂混合物的分离，难以用纯溶剂洗脱来实现，此时需要用二元或三元混合溶剂体系来提高分离选择性。在二元混合溶剂中，其洗脱强度随溶剂组成的改变而连续变化，更容易找到具有实用性的ε°值的混合物。某些二元混合溶剂的强度，如图3-21所示。对于给定的ε°数值，可由图3-21提供几种不同的二元混合溶剂系统。此图最上端横线上的数字标明各种溶剂的溶剂强度参数ε°，此线下面所有横线上标的数字，是与ε°数值对应的强极性溶剂的体积百分数。从第二条横线开始，左端标记的为二元混合溶剂中极性弱的组分，横线右端标记的为极性强的组分。如欲获得ε°=0.30的二元混合溶剂，则可由下述混合溶剂提供，如76％二氯甲烷/戊烷、2％乙腈/戊烷、0.4％甲醇/戊烷、50％二氯甲烷/异氯丙烷、2％乙腈/异氯丙烷、0.3％甲醇/异氯丙烷。图3-21对指导如何选择具有确定ε°值的二元混合溶剂，进行等强度溶剂洗脱来改善分离的选择性，具有重要的实用价值。

使用二元混合溶剂的不足之处，是由于非极性溶剂（如戊烷）和极性溶剂（如甲醇）有时不能以任意比例混合而发生溶剂的分层现象。为此可加入分别能与这两种溶剂混溶的具有中等极性的第三种溶剂（如异丙醇、二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯等），构成三元混合溶剂系统，而使混合溶剂强度发生改变，并可使用梯度洗脱操作。

对以硅胶为固定相的液固吸附色谱法，当欲分离不同类型的有机化合物时，所选用的作为流动相的溶剂，应具有适当的溶剂强度参数。表3-9提供的溶剂强度参数可供参考。

2.液液分配色谱法

（1）固定相　液液分配色谱的固定相由载体和固定液组成。最常用的载体材料是硅胶，可以将固定液直接涂渍或通过化学反应键合于载体表面，后者称为化学键合固定相，它具有耐溶剂冲洗、不流失、柱效高、寿命长，以及适于梯度洗脱等优点，在现代液相色谱中占有重要地位，是液液分配色谱的理想固定相。

涂渍法常用的固定液只有几种极性不同的物质，如β，β'-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷和异三十烷等。极性固定液用于正相色谱法，非极性固定液用于反相色谱法。在化学键合固定相中，于硅胶表面键合氰基、氨基和二醇基等极性基团的固定相用于正相色谱法，键合C8、C16、C18、C22烷基和苯基等非极性基团的固定相用于反相色谱法。HPLC常用的化学键合固定相如表3-10所示。

（2）流动相　液液分配色谱法所用流动相的极性必须与固定相有显著不同，这主要是为了避免因固定液溶于流动相中而流失。为使组分获得良好的分离，通常希望组分的容量因子保持在1～10范围内，若组分的容量因子>10，或<1时，可通过调节流动相的极性来获取适用的容量因子值。

在正相色谱中，流动相的主体为己烷、庚烷，可加入小于20％的极性改性剂，如异丙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈等，这样溶质的容量因子会随改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度明显增加。

在反相色谱中，流动相的主体为水，再加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等改性剂来调节极性，溶质在混合溶剂流动相中的容量因子会随改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度增强。一般情况下甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且黏度小、价格低，是反相色谱中最常用的流动相。改性剂的性质及其与水的比例对保留值和分离效果有影响。例如，在分析有机弱酸时，常向甲醇-水流动相中加入1％的甲酸（或乙酸、磷酸、硫酸），就可抑制峰形拖尾并改善分离效果；对于弱碱性样品，向流动相中加入1％的三乙胺，也可达到相同的效果。

梯度洗脱时，正相色谱法通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例；而反相色谱则与之相反，逐渐增大甲醇和乙腈的比例。反相色谱中溶剂极性越弱，其洗脱能力越强，溶剂强度越高；反之溶剂极性越强，其洗脱能力越弱，溶剂强度越低。水是极性最强的溶剂，也是反相色谱中溶剂强度最弱的溶剂。正相色谱法与反相色谱法的比较见表3-11。

3.离子交换色谱法

（1）固定相　离子交换色谱的固定相为离子交换剂。离子交换剂由基体和带电荷的离子基构成，根据离子基所带电荷的不同，分为阳离子交换剂与阴离子交换剂；根据离子基的酸度和碱度，阳、阴离子交换剂又有强弱之分，如强酸性阳离子交换剂常含有磺酸基（—SO3H），而弱酸性阳离子交换剂则含有羧基（—COOH）或酚羟基（—OH）官能团；强碱性阴离子交换剂常含有烷基胺官能团，如—N（CH3）3Cl，而弱碱性阴离子交换剂则含有弱碱性的—NH2官能团。根据所用基体不同，离子交换剂又分为两种类型，即以交联聚苯乙烯为基体的离子交换树脂和以硅胶为基体的离子交换硅胶。前者交换容量大，pH操作范围宽，但柱效低，遇水有溶胀现象，不耐高压；而后者机械强度高，不溶胀，耐压，高效，但交换容量小，pH范围较窄。选择固定相时主要考虑离子基的性质，若样品是酸性化合物，需采用阴离子交换剂；若样品是碱性化合物，则采用阳离子交换剂。

（2）流动相　离子交换色谱的流动相一般采用盐类的缓冲水溶液。水是一种理想的溶剂，以水溶液为流动相时可以通过改变流动相的pH、缓冲液的类型、离子强度以及加入少量有机溶剂、配位剂等方式来改变交换剂的选择性，使待测组分达到有效分离。在实际分析工作中，通常用钠、钾、铵的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐与其相应的酸混合成的酸性缓冲溶液或与氢氧化钠混合成的碱性缓冲溶液作为离子交换色谱的流动相。

4.体积排阻色谱法

（1）固定相　体积排阻色谱的固定相为具有一定孔径分布的多孔性凝胶物质。对固定相的要求是：孔径分布应有确定的范围，能承受高压，吸附性极小等。其中孔径的大小和分布是固定相的最重要参数，它表明可分离组分的相对分子质量范围。固定相根据其化学成分不同分为无机凝胶（如多孔硅胶、多孔玻璃等）和有机凝胶（如交联聚苯乙烯、交联葡聚糖等）两类，前者机械强度高，稳定性好，耐高温高压，但具有一定的吸附性；后者渗透性好、柱效高，在合成过程中，可通过控制交联剂用量，以得到不同交联度的凝胶，用于不同相对分子质量物质的分离。

（2）流动相　与其他类型色谱的不同之处是，在体积排阻色谱中，选择流动相的目的不是为了控制分离，而只是作为待分离样品的运输工具，因而对其要求是黏度低、毒性小，对样品的溶解性好，对固定相能浸润，与所用检测器匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿和水等。表3-12列出了体积排阻色谱常用的固定相与流动相。

5.离子对色谱法

（1）固定相　在正相离子对色谱中，将含有离子对试剂的水溶液涂渍到硅胶表面和孔隙中作固定相。早期的反相离子对色谱是将固定液涂渍在载体上作固定相。20世纪70年代中期后，反相离子对色谱也同其他液相色谱一样，普遍采用了化学键合固定相，目前常用的是反相色谱中的ODS或C8、C18等化学键合固定相。

（2）流动相　正相离子对色谱常用有机溶剂作流动相，反相离子对色谱常用的流动相是甲醇-水、乙腈-水和以水为主体的缓冲溶液，增加甲醇或乙腈含量，容量因子（分配比）减小。在流动相中增加有机溶剂的比例，应考虑离子对试剂的溶解度；流动相的酸度对保留值有影响，一般pH在2～7.4比较合适。表3-13和表3-14分别为典型的正相和反相离子对色谱系统。

四、高效液相色谱仪

以液体为流动相，采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。高效液相色谱仪的种类很多，根据其功能不同，可分为分析型、制备型和专用型。不论何种类型的高效液相色谱仪，其基本组成是类似的，都是由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统及数据处理系统5个部分组成。图3-22是高效液相色谱仪的示意图。其工作过程如下：高压泵将储液罐的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出。当样品从进样器注入时，流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后的各组分依次进入检测器，检测器输出的电信号供给数据处理及记录装置，得到色谱图。

1.输液系统

输液系统包括溶剂储罐、高压泵、过滤器、阻尼器和梯度洗脱装置，其核心部分是高压泵。

（1）流动相净化

①脱气。通常采用不锈钢或聚四氟乙烯瓶装溶剂，用真空泵或水泵脱除溶剂中的气体。为加快除气速度，也可使用超声波发生器脱气。

脱气的目的主要是消除流动相从色谱柱到达检测器时（即从高压到常压），由气泡释放产生的电噪声干扰。

②过滤。高压泵由于在高压力下操作，柱塞、密封垫必须精密配合才能保证不漏液。因此，流动相在使用之前必须过滤除去微小的固体颗粒，这种微粒可磨损泵的活塞、密封垫、单向阀，堵塞柱头垫片的微孔，损坏泵并降低柱效、缩短柱的寿命。除去机械杂质最简单的办法是使用真空泵的微膜过滤除去杂质。微孔滤膜具有不同孔径、不同材质，应用时可根据需要选用。

（2）高压输液泵　高压输液泵是高效液相色谱仪中最关键的部件，其作用是将流动相在高压下连续不断地送入色谱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。它应具备流量稳定，输出压力高，流量范围宽，耐酸碱和缓冲液腐蚀，压力变动小，易于清洗和更换溶剂等特性，并具有梯度洗脱功能。

高压输液泵分为恒压泵和恒流泵两类。恒压泵主要指气动放大泵，在系统中，泵的压力始终保持恒定，但流速随着系统压力的变化而变化，即不能保证在任何时刻的流速都保持不变。恒流泵有往复泵和螺旋柱塞泵，这类泵输出流量恒定。在液相色谱中应用最多的是往复泵，泵的柱塞在输液过程中前后往复运动。柱塞向后移动时，将溶剂吸入泵的腔体中；柱塞向前移动时，将液体排出腔体。柱塞的前后移动，是由一个偏心轮的旋转驱动的。液体的流向是由泵的一对单向阀控制。泵的结构示意如图3-23所示。

（3）梯度洗脱装置　HPLC的洗脱方式有等度和梯度两种。等度洗脱是洗脱过程中保持流动相组成配比不变；梯度洗脱则是在洗脱过程中连续或阶段性地改变流动相组成，以使柱系统具有最好的选择性和最大的峰容量。

往复泵可以连续不断地以恒定的流量输送液体，更换溶剂方便，适合梯度洗脱。

梯度洗脱是根据组分的复杂程度，在组分的洗脱过程中，不断调整混合溶剂的组成，改变溶剂的强度或溶剂的选择性，使多组分复杂混合物得到满意分离。实现梯度洗脱主要依赖于泵系统，根据溶剂混合时所处的压力，一般分为两种类型，即低压梯度和高压梯度。

①低压梯度。低压梯度是溶剂在常压下混合，然后用高压泵将其送至柱系统中。这种方法简单，只需一个泵，经济实用。

实现低压梯度的最好方法是，使用时间比例电磁阀，通过微处理机控制溶剂输入电磁阀的开关频率，以控制泵输出的溶剂组成，低压溶剂梯度示意如图3-24所示。

②高压梯度。高压梯度一般使用两台高压输液泵，每台泵输送一种溶剂。两台泵输出的溶剂在一混合室内混合（见图3-25），每台泵的溶剂流量单独控制。

2.进样系统

进样系统是将样品引入色谱柱的装置，包括取样与进样两个功能。在液相色谱中，进样方式有微量注射器进样、阀进样、自动进样器进样等。

（1）微量注射器进样　用1～100μl微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内。这种进样方式简便快速，可获得比其他进样方式都要高的柱效，但压力不能超过10MPa。

（2）阀进样　目前多采用六通阀进样，其结构与工作原理与气相色谱所用六通阀完全相同。进样阀可在高压下（35～40MPa）直接将样品送入色谱柱，不需要停留，进样量由固定体积的定量管严格控制，因此进样准确、重现性好。

（3）自动进样器进样　由计算机自动控制定量阀进行取样、进样、清洗等一系列操作，操作者只需将样品按顺序装入储样装置中。该法实现了全自动化操作，节省人力，适合大批量样品的分析。

3.分离系统

分离系统包括柱管与固定相两部分，样品在此完成分离，是色谱仪的心脏。

柱管通常采用优质不锈钢制作，柱长10～30cm、内径4～5mm，柱接头的死体积应尽可能小，以减少柱外效应。高效液相色谱柱的获得，主要取决于固定相的性能（有关固定相的内容前面已详述，此处不再介绍），但也与柱床结构有关，而柱床结构直接受填充技术的影响。色谱柱的装填方法有干法和湿法两种。粒径大于20μm的固定相，可用干法装填，而粒径小于20μm的固定相，需用湿法装填，湿法也叫匀浆法，即以一合适的溶剂（或混合溶剂）作为分散介质，经超声波处理，使固定相微粒在介质中形成匀浆，然后在高压泵作用下将匀浆压入柱管中。

4.检测器

检测器是用于连续监测柱后流出物组成和含量变化的装置。其作用是将色谱柱中流出的样品组分含量随时间的变化转化为易于测量的电信号。用于高效液相色谱的检测器应具有灵敏度高、线性范围宽、响应快以及死体积小等特点。

液相色谱检测器可分为两类：一类是测量样品和流动相的共有性质，也称总体检测器。它对试样和流动相总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光检测器和蒸发光散射检测器等；另一类是测量样品中溶质所特有的性质，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外检测器、荧光检测器和电化学检测器等。

（1）紫外吸收和光电二极管阵列检测器　紫外吸收检测器在液相色谱中应用最广，几乎是一切色谱仪的必备检测器，它噪声低、灵敏度高、结构简单。

紫外吸收检测器的工作原理是朗伯-比尔定律。当一束紫外光通过样品池时，入射光的一部分被样品组分吸收，吸光度与组分浓度及光程长度有如下关系

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式中，I0为入射光强度；I为透射光强度；ε为组分的摩尔吸光系数；b为检测器光程长度；c为组分摩尔浓度；A为组分吸光度；T为组分透光率。

检测器有固定波长型和可变波长型两种，它们的代表性光路如图3-26和图3-27所示。

固定波长检测器用低压汞灯作光源，测定波长为254nm或280nm。光源所发射其他波长的光经过滤光片消除。可变波长检测器采用氘灯和钨丝灯组合光源，波长在190～800nm范围可调，从而增加了检测器的灵敏度和选择性，扩大了检测器的应用范围。

紫外吸收检测器属于选择性检测器，凡是具有共轭π键和孤对电子的物质，如共轭烯烃、芳烃以及含有、、、基团的化合物，在紫外光区都有吸收，都可用紫外吸收检测器进行测定。如果某些化合物没有吸收，可以通过衍生化法转变成有紫外吸收的物质，以利于紫外检测。

近年来，研制出一种应用光电二极管阵列的检测器，称为光电二极管阵列检测器（photodiode array detector，PAD）。PAD由于采用计算机快速扫描采集数据，可获得组分的三维谱图，即吸光度随保留时间和波长变化的三维图。PAD的检测原理与紫外吸收检测器相同，只是PAD可同时检测到所有波长的吸收值，相当于全扫描光谱图。它采用2048个或更多的光电二极管组成阵列，混合光首先经过吸收池，被样品吸收，然后通过一个全息光栅经色散分光，并投射到光电二极管阵列检测器上，每个光电二极管输出相应的光强信号，得到吸收后的全光谱。PAD的特点是不需要机械扫描就可瞬时获得全波长光谱，这种检测器不仅可以避免由于波长选择不合适而漏检被测组分，以及定量处理中所遇到的响应值小的麻烦，而且可快速地定性判别或鉴定不同类型的化合物，还可对未分离组分判断其纯度。

（2）示差折光检测器　示差折光检测器又称折光指数检测器（refractive index detector），其最大的特点是对所有的物质都有响应，只要被测组分与洗脱液的折射率有差别就可使用，因此是通用型检测器。

不同的物质具有不同的折射率，当样品组分随流动相从柱中流出，它的折射率与纯流动相不同。示差折光检测器是以纯溶剂作参比，连续监测柱后洗脱物折射率的变化，并根据变化的差值确定样品中各组分的量。

示差折光检测器按工作原理可分为反射型、偏转型和干涉型三种。

现以偏转型为例进行介绍。它是基于折射率随流动相中成分的变化而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流动相中成分变化的函数。因此，测量折射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。图3-28是偏转型折光检测器的光路图。

光源1发射出的光经透镜2聚焦后，从狭缝4射出一条细窄光束，经反射镜5反射后，经透镜6穿过工作池7和参比池8，被平面反射镜9反射，成像于棱镜11的棱口上，然后光束均匀分解为两束，到达左右两个对称的光电倍增管12上。如果工作池和参比池通过的都是纯流动相，光束无偏转，左右两个光电倍增管的信号相等，此时输出平衡信号。如果工作池有试样通过，由于折射率改变，造成了光束的偏移，左右两个光电倍增管所接受的光束能量不等，因此输出一个代表偏转角大小，即反映试样浓度的信号。红外隔热滤光片3可阻止红外光通过，以保证系统工作的热稳定性。透镜10用于调整光路系统的不平衡。

使用示差折光检测器要注意以下事项：①流动相的组成一定要恒定，不能使用梯度洗脱；②不能使检测池带压工作，在与其他检测器串联使用时应放在最后；③流速要恒定，泵的流速波动要小于0.5％，使用往复泵时要用阻尼装置；④温度应恒定，恒温控制要达±0.001℃。

示差折光检测器比紫外吸收检测器的应用面广，但灵敏度低（低两个数量级），价格较高。对于无紫外吸收的物质，如脂肪烷烃类以及生命科学中常遇到的各种糖类化合物等都可用示差折光检测器进行检测。

（3）荧光检测器　荧光检测器是一种具有高灵敏度和高选择性的浓度型检测器，它是利用某些试样具有荧光特性来检测的。许多有机化合物具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有的荧光活性很强。荧光检测器的检测原理是，某些物质在受紫外光激发后，能发射荧光，并且在一定条件下，荧光强度与流动相中的物质浓度成正比。对不产生荧光的物质，可使其与荧光试剂反应，生成可发生荧光的衍生物再进行测定。

荧光检测器包括激发光源、选择激发波长用的单色器、流通池、选择发射波长用的单色器及用于检测发光强度的光电倍增管。通常采用氘灯为激发光源，流通池与紫外检测器类似。图3-29为单光路固定波长荧光检测器光路图。由光源发出的光，经激发光单色器后，得到所需要的激发光波长。激发光通过样品流通池，一部分光线被荧光物质吸收。荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为了消除入射光与散射光的影响，一般取与激发光成直角的方向测量荧光。荧光经发射光单色器分光后，单一波长的发射光被光电倍增管检测。荧光检测器按单色器的不同可分为固定波长荧光检测器和荧光分光检测器；按有无参比光路，又可分为单光路荧光检测器和双光路荧光检测器。图3-30为双光路固定波长荧光检测器示意图，其中的参比光路有利于消除流动相所发射的本底荧光以及光源波动的影响。图3-31为双光栅荧光分光检测器示意图。

荧光检测器灵敏度高，检出限可达10-12g·mL-1，比紫外检测器高出2～3个数量级，但其线性范围较窄，仅约为103。荧光检测器对流动相脉冲不敏感，可用于梯度洗脱，缺点是仅对具有荧光特性的物质有响应，适用范围有一定的局限性。荧光检测器可用于多环芳烃、黄曲霉素、色素、卟啉类化合物、农药等的分析；很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、蛋白质、甾族化合物及某些代谢药物等都可以用荧光法检测，尤其在生物样品痕量分析中很有用。

（4）蒸发光散射检测器　蒸发光散射检测器是一种新型的通用型检测器，其性能比示差折光检测器优越得多，主要适用于无紫外吸收，不能用紫外检测器检测的组分，如糖类、脂肪酸、甘油三酯及甾体等，其工作原理如图3-32所示。组分经色谱柱分离后随流动相流出，在通向检测器途中，被高速载气（N2）喷成雾状颗粒，在受温度控制的蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，溶质形成不挥发的微小颗粒，被载气携带通过检测系统。检测系统由激光光源和光电倍增管组成。在散射室中，光被散射的程度取决于散射室中溶质颗粒的大小和数量。粒子的数量取决于流动相的性质及喷雾气体和流动相的流速。当喷雾气体和流动相的流速固定时，散射光的强度与流动相中组分的浓度成正比。蒸发光散射检测器消除了溶剂的干扰和因温度变化而引起的基线漂移，利于梯度洗脱，死体积小、灵敏度高。其缺点是蒸发光散射检测器对有紫外吸收的组分检测灵敏度相对较低，且只适合流动相能完全挥发的色谱条件，若流动相含有难以挥发的缓冲剂，就不能用该检测器进行检测。

（5）电化学检测器　电化学检测器是根据电化学分析方法而设计的。电化学检测器主要有两种类型：一是根据溶液的导电性质，通过测定离子溶液电导率的大小来测量离子浓度；另一类是根据被测物在电解池中工作电极上所发生的氧化-还原反应，通过电位、电流和电量的测量，确定被测物在溶液中的浓度。

对那些无紫外吸收或不能发生荧光，但具有电活性的物质，都可用电化学检测器进行检测。目前电化学检测器主要有电导、安培、极谱和库仑4种。此外，电化学检测器所用流动相必须具有导电性，因此一般使用极性溶剂或水溶液，主要是盐的缓冲液作流动相。

常用高效液相色谱检测器的性能比较如表3-15所示。