第二章 氧化应激检测指标与方法

第一节 氧化应激概述

在正常情况下，机体代谢过程中活性氧簇不断地通过非酶促反应和酶促反应产生，每日有1%~3%的摄入氧转变为超氧阴离子（Superoxide anion, O2·－）及其活性衍生物，但在抗氧化酶以及外源性和内源性抗氧化剂的协同作用下被不断清除，在生理情况下，活性氧（Reactive oxygen species, ROS）自由基的生成与清除处于动态平衡，ROS自由基可维持于有利无害的极低水平。由于内源性和（或）外源性刺激使机体代谢异常而骤然产生大量ROS自由基，或机体抗氧化物质不足，使机体内氧化系统与抗氧化系统间平衡失常，则使机体处于氧化应激状态，其结果导致生物活性分子的损伤及生物学效应的改变，并进一步引起细胞死亡和组织损伤，与很多病理过程相关。

氧化应激（Oxidative stress, OS）是指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内高活性分子，如ROS自由基和活性氮（Reactive nitrogen species, RNS）自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，使体内氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致细胞和组织损伤。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，在氧化应激过程中，由于受到自由基的氧化胁迫，构成细胞组织的各种物质如脂质、糖类、蛋白质、脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid, DNA）等所有的大分子物质，都会发生各种程度的氧化反应，引起变性、交联、断裂等氧化损伤，进而导致细胞结构和功能的破坏以及机体组织的损伤和器官的病变，甚至癌变等。研究表明，活性氧自由基和活性氮自由基可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质（图2-1），可诱发基因的突变、蛋白质氧化和脂质过氧化，被认为是导致衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（阿尔茨海默病）、糖尿病的一个重要因素。

一、体内常见的氧化剂

体内的氧化剂主要包括ROS自由基和RNS自由基两大类，有些ROS自由基与RNS自由基尚呈现交叉性或双重作用。ROS自由基是一类含氧、化学性质活泼、氧化性强的物质的总称。生物体内产生的ROS自由基主要有超氧阴离子、羟自由基（Hydroxyl free radicals,·OH－）及其活性衍生物如过氧化氢（Hydrogen peroxide, H2O2）、单线态氧（Singlet oxygen,1O2）及LO·、LOO·及LOOH等脂质过氧化物。ROS自由基是近年来发现的信息分子家族中的新成员，ROS自由基作为第二信使调节细胞增殖、分化、凋亡等相关的信号转导通路，但当细胞内ROS自由基产生过多时，细胞处于氧化应激状态，导致严重的细胞损伤并且引起一些疾病。RNS主要有一氧化氮（·NO）、二氧化氮（·NO2）和过氧化亚硝酸盐（·ONOO－）及反应生成的系列含氮化合物等。NO在低浓度时主要起调节作用，而高浓度时则可引起机体氧化损伤。在一定条件下，NO与O2结合而成为有强氧化活性的ONOO－及其质子化产物ONOOH，可对巯基、脂质、DNA及蛋白产生直接氧化作用，可介导硝化作用，修饰蛋白的氨基酸残基如半胱氨酸和酪氨酸，从而影响蛋白的磷酸化。

在细胞内，超氧阴离子主要通过线粒体和内质网膜上电子传递产生。在线粒体内，活性氧过量的产生是由于氧化磷酸化失调、缺血和衰老等病理状态，以及多不饱和脂肪酸的缺乏和脂质过氧化而引起的线粒体脂质的改变。在内质网内，NADPH－细胞色素P450还原酶能够放出电子，使氧分子变成超氧阴离子。过氧化氢主要是通过超氧化物的歧化反应产生的，而单线态氧是通过光敏作用而产生的，也可通过吞噬作用及超氧阴离子歧化作用而产生。

自由基的量可利用电子自旋共振法、化学发光法以及化学捕获法等进行测定。NO在大部分的体液包括血浆中迅速转变为稳定的亚硝酸盐和硝酸盐，测定血清中的亚硝酸盐和硝酸盐可反映NO的多少，因为血浆中这些化合物的半衰期约为1.5h，可迅速从尿中排泄，因而对结果的解释须谨慎，此外还须考虑肾功能。胆红素氧化代谢产物是胆红素发挥清除自由基活性后的产物，分析尿和血中的胆红素氧化代谢产物可能有助于评价体内的氧化应激水平。总的来说，因自由基的反应活性较强而寿命短暂，并且其浓度非常低，要对其直接进行检测非常不方便。

二、氧化应激的代谢产物

自由基主要氧化损伤DNA、脂质以及蛋白质等生物大分子，检测组织和生物体液中的氧化应激代谢产物对评价氧化应激状态显得尤其重要。

（一）脂质过氧化产物

生物膜脂质的磷脂中富含多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid, PUFA），在O2存在条件下，极易被自由基及其活性衍生物攻击，引发脂质过氧化链式反应，同时在脂质过氧化过程中产生的LO·、LOO·等也可产生链引发和链扩增反应。LOO·还可通过分子内双键加成，形成环过氧化物和环内过氧化物自由基，最后断裂为各种代谢产物。

脂质过氧化过程中发生的ROS自由基氧化生物膜的过程，即ROS自由基与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应，形成脂质过氧化产物如丙二醛（Malonaldehyde, MDA）、8－异前列腺素（8-isoprostane）和4－羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal，HNE）。它们对某些氨基酸残基具有修饰作用，可与蛋白质形成醛－蛋白加合物，引起蛋白质的变性，还可引起DNA的损伤。它们不仅是氧化应激的产物，还可介导氧化应激的发生，使生物膜的结构和功能发生改变，使膜的流动性改变、通透性改变、膜运输过程紊乱等，进而引起细胞毒性。可直接检测脂质过氧化物来评价氧化应激水平。

（二）蛋白质氧化产物

蛋白质广泛存在于细胞内外，极易受ROS自由基和RNS自由基攻击而使蛋白质的氨基酸发生氧化和硝化修饰。在氧化应激过程中，自由基对蛋白质的作用包括蛋白质肽链断裂、蛋白质分子相互间交联聚合，蛋白质氨基酸发生氧化脱氨反应、氧自由基攻击蛋白质还原性基团、脂类氧化裂解所产生的丙二醛与蛋白质上的氨基产生分子间的交联等。目前对于蛋白质氧化损伤的检测指标主要有两个，分别是蛋白羰基生成（羰基化）和硝基酪氨酸的生成（蛋白质中酪氨酸硝基化）。

蛋白质是ROS自由基攻击的另一个最广泛的靶标，ROS自由基既可以直接介导蛋白质氧化，也可以先诱导脂质过氧化和加速非酶糖基化，再利用其活性中间产物间接介导蛋白质氧化，从而导致蛋白主链断裂、侧链β－切除、蛋白质羰基化以及蛋白质－蛋白质交联，其中蛋白质羰基在体内的形成主要通过金属离子催化氧化（Metal ions in the catalytic oxidation, MCO）系统完成。ROS自由基攻击蛋白分子的侧链氨基酸，如赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苏氨酸，均可氧化产生相应的蛋白羰基衍生物。蛋白羰基在氧化应激早期即可形成，且有较高的稳定性，因而可采用羰基测定作为判断蛋白质氧化损伤的指标。此外，羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。由于羰基的生成具有普遍性，因此被广泛用作检测蛋白质氧化损伤的指标。

过氧亚硝基可使蛋白酪氨酸残基发生硝化而生成特异的3－硝基酪氨酸，因而检测生物体液和组织中的硝基酪氨酸可反映过氧亚硝基介导蛋白氧化损伤。二酪氨酸通常由次氯酸引起两个酪氨酸连接而成，因二酪氨酸有代谢稳定性，而且只是在蛋白被氧化修饰后才通过酶性途径释放，因而可将其作为蛋白氧化损伤的特异指标，可测量二酪氨酸排出量来反映蛋白质的氧化损伤。晚期氧化蛋白产物（Advanced oxidation protein products, AOPP）是由吞噬细胞生成的次氯酸引起血浆白蛋白氧化的产物，而Nt－羧甲基赖氨酸是糖化蛋白被氧化修饰形成的晚期糖基化终产物（Advanced glycationend products, AGEs）的天然结构，两者均可作为蛋白氧化损伤的标志物，以反映血液透析患者体内的氧化应激水平。

（三）DNA的氧化产物

ROS自由基可以直接攻击生物大分子DNA，诱发DNA氧化损伤。在各种氧化损伤中，以鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8－羟基脱氧鸟嘌呤（8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHdG）最为常见。引起DNA氧化损伤的ROS自由基主要是·OH－。·OH－可攻击脱氧核糖，使脱氧戊糖分解、磷酸二酯键断裂，引起DNA出现单链或双链断裂。此外，·OH－加到DNA碱基上，产生特异性的嘌呤和嘧啶碱基修饰物，受损的DNA可由核酸内切酶和转葡糖基酶修复，并释放出脱氧核苷酸和游离碱基，例如，鸟嘌呤（Guanine, G）被氧化而生成8-oxo-G，在修复酶的作用下以8-OHdG形式被切除，从尿排出。尿中8-OHdG是全身DNA受氧化损伤后经切除修复而排出的量，可反映对氧化损伤的修复程度，因而8-OHdG被认为是内源性氧自由基引起DNA氧化损伤的一种标志。·OH－攻击DNA时还可氧化胸腺嘧啶而形成胸腺嘧啶核苷乙二醇，因而检测尿中的胸腺嘧啶核苷乙二醇也有助于评价DNA的氧化损伤。

氧自由基也可以导致不同形式的DNA损伤，包括碱基断裂、碱基突变以及DNA双链断裂。DNA双链断裂是细胞内多种类型的DNA损伤中最危险、最严重的一种，DNA损伤是评价细胞氧化损伤的重要指标之一，检测DNA损伤的技术很多，单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）是检测DNA单链断裂的常用方法。

三、抗氧化系统

生物体内，除极微量的ROS自由基被机体利用外，几乎所有的ROS自由基都应当及时被清除。特定ROS自由基的生成过多又会引起机体产生相应的抗氧化物质消除多余ROS自由基。生物体内防御ROS自由基所致损伤的体系主要为抗氧化系统。抗氧化系统主要包括三类物质：第一类是酶抗氧化系统，主要包括过氧化氢酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxide, GSH-Px）等；第二类为目前日益受到重视的巯基还原缓冲体系，主要包括谷胱甘肽（Glutathione, GSH）、硫氧还蛋白（Thioredoxin, Trx）及谷胱甘肽硫氧还蛋白（Glutaredoxin, Grx）等；第三类为小分子物质，主要包括麦角硫因、维生素C、维生素E、褪黑素、α－硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素铜（Cu）、锌（Zn）、硒（Se）等。

（一）酶抗氧化系统

在抗氧化防护体系中，主要的抗氧化酶包括SOD、GSH-Px和CAT，可协助清除自由基，减轻和消除氧化损伤。

1．超氧化物歧化酶（SOD）

SOD是Super Qxide Dismutase缩写，含铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）的酶，主要催化歧化反应，SOD主要有含铜锌的CuZn-SOD和含锰的Mn-SOD的两种。CuZn-SOD中Cu参与酶分子的活性中心结构，并在催化反应中传递电子；Zn则不参与催化作用，但对活性中心有支持稳定作用。CuZn-SOD主要分布于细胞浆，细胞器中极少存在。Mn-SOD主要分布于线粒体基质中，因此是歧化线粒体生成的主要抗氧化酶。已经证明，线粒体是SOD生成的主要部位。两种SOD所催化的反应相同，催化反应速度常数接近。人体各种组织器官的CuZn-SOD含量相差较大，以肝与大脑灰质的含量最高。这种差异可能与该组织的耗氧量有关。

SOD是抗氧化体系中较为关键的酶，在抗氧化系统中有着非常重要的作用。SOD主要存在于细胞浆内，作为一种ROS自由基的清除剂，SOD可加速发生歧化作用，可以把歧化成过氧化氢（H2O2）和O2，清除，从而保护细胞不受毒性氧自由基的损伤；同时充足的SOD可通过防止启动链式氧化反应而降低·OH－的生成，并且可避免与NO间发生反应形成活性更强的ONOO－。它还可以清除其他自由基，能够使机体内的超氧阴离子自由基维持在正常水平，测定其活力可间接反映细胞内自由基清除的情况。

2．谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）

GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化物分解的酶，GSH-Px在抗氧化系统中有着非常重要的作用。它能特异性催化谷胱甘肽对过氧化物的还原反应，把过氧化物转化为水或相应的醇类，能消除有害的过氧化代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，GSH-Px酶活性的高低间接反映了机体抗氧化能力。

GSH-Px家族包括4种含硒的蛋白，分别是胞质溶胶GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px、血浆GSH-Px以及胃肠道GSH-Px。它们均可利用GSH作为底物，还原H2O2和烷烃氢过氧化物，但具有底物特异性。·OH－可诱发脂质过氧化链式反应，但在GSH存在时，GSH-Px可催化几乎所有的有机氢过氧化物（ROOH）转变为ROH，减轻对机体的损伤。GSH-Px还可在CAT含量少或H2O2产量很低的组织中可代替CAT清除H2O2。CAT存在于微体，GSH-Px位于胞浆或线粒体的基质，两者可协同清除整个细胞的H2O2。

在血浆、全血红细胞或血小板以及组织中有一种不含硒的GSH-Px，又称谷胱甘肽转硫酶（Glutathione S-transferase, GST），可催化ROOH转变为ROH，协助GSH-Px清除体内的ROOH。此外，谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase, GSH-Re）可借助NADPH提供电子促进氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione, GSSG）再生为还原型谷胱甘肽（GSH），因而在机体抗氧化作用中也有重要作用。

3．过氧化氢酶（CAT）

CAT是一种普遍存在的抗氧化酶，CAT在抗氧化系统中有着非常重要的作用。其功能是催化H2O2转变为H2O和O2，从而防止H2O2在过渡金属离子的作用下转变为·OH－。过氧化氢在真核细胞内以多种氧化酶和超氧化歧化酶的副产物形式存在。过氧化氢在细胞内的聚集会引发细胞内DNA，蛋白质和脂质的氧化，从而导致基因突变和细胞死亡。CAT可去除细胞内的H2O2，保护活细胞免受氧化损伤，过氧化氢酶在氧化胁迫相关疾病中的作用已得到了广泛研究。

过氧化氢酶、过氧化物酶是含铁的酶，它们能不断清除体内生成的主要的氧化产物，即过氧化氢（H2O2）和过氧化物，阻止它们进一步产生氧化性质更强的·OH－。

各种抗氧化酶从不同角度协助清除体内的ROS自由基，在抗氧化过程中起着不同的作用，因而常测定血液中SOD、CAT、GSH-Px以及GST的量及活性来反映机体抗氧化活性，其中以SOD以及GSH-Px最受重视。

（二）非酶抗氧化系统

非酶抗氧化系统又称巯基还原缓冲体系，主要是指可清除自由基的巯基还原缓冲体系和低分子量物质，巯基是体内主要的非酶性抗氧化剂，包括蛋白巯基和非蛋白巯基。主要有谷胱甘肽、抗氧化维生素、泛醌还原物、金属硫蛋白及硫氧还蛋白等。

1．谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是一种低分子清除剂，是细胞内主要的抗氧化物，其量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素，可间接反映细胞的抗氧化能力。GSH是细胞中普遍存在的小分子三肽化合物（Glu-Cys-Gly），是需氧生物中主要的非蛋白巯基，细胞内其浓度在mmol水平。通过直接作用和参与某些抗氧化酶的酶促反应，协调内源性与外源性抗氧化剂的作用，维持自由基的产生和清除，保护细胞免受ROS的氧化损伤，并使内环境处于稳定的还原态。GSH是一种抗氧化剂，而且GSH是多种酶，如GSH-Px的辅酶，涉及多种生物学过程，参与清除·OH－、ONOO－、LO·、LOO·、和H2O2等ROS自由基，防止氧化应激对机体产生的损伤。在GSH-Px的酶促反应中，GSH被氧化为GSSG，在谷胱甘肽还原酶的作用下重新转变为GSH，发挥抗氧化作用；GSH还可直接或通过谷胱甘肽转硫酶（GST）的催化作用与亲电子化合物结合，使各种亲电子化合物，如脂质过氧化代谢产物等通过与GSH结合而解毒。因此，细胞内GSH含量的改变可反映机体的抗氧化能力及细胞的氧化应激状态。

2．金属硫蛋白

金属硫蛋白（Metallothionein, MT）能被各种应激因素诱导生成，对·OH－、、NO及苯氧基自由基等都有清除作用，具有广泛的非特异性的细胞保护作用。MT清除自由基的作用主要与其巯基（—SH）有关，MT中20个半胱氨酸上的—SH基均处于还原状态，在与·OH－反应过程中，—SH被氧化成—S—S—，并将金属离子释放，使·OH－还原降解。

3．硫氧还蛋白

硫氧还蛋白（Trx）是一类分布广泛的多功能小分子蛋白，TRX基因的增强子区域有一个对氧化应激起反应的顺式作用元件，从而受到氧化应激（如各种氧化剂、紫外线照射及缺血再灌注等）的诱导调节。TRX有一个保守的有氧化还原活性的Cys-Gly-Pro-Cys氨基酸序列，通过两个半胱氨酸残基上的—SH的氧化还原状态的改变而调节细胞的多种功能。TRX可直接还原氧化损伤形成的蛋白中的二硫键，使对氧化还原敏感的蛋白维持其正常的硫醇－二硫化物氧化还原状态，保护细胞抵御氧化应激及其相关的外界环境。

（三）非酶抗氧化系统

非酶抗氧化系统主要是小分子物质，最常见的是抗氧化维生素。抗氧化维生素包括维生素C（Vitamin C）、维生素A（Vitamin A）及β胡萝卜素（Beta carotene），其中以维生素E（Vitamin E）和维生素C最为重要。维生素E是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚。维生素E是人体主要的脂溶性抗氧化剂，可在脂蛋白和膜中通过阻断PUFA脂质过氧化的链式反应而表现出其抗氧化效应。维生素E的抗氧化剂作用需要抗坏血酸等的协同，维生素E在清除脂质过氧化过程中产生的过氧自由基（ROO·）时形成生育酚自由基，还原型GSH、维生素C以及泛醇又可使α生育酚得以再生。维生素C（又称抗坏血酸）是最有效的内源性和外源性抗氧化剂，可清除·OH－、和过氧自由基，可还原氧分子、硝酸酯、Cyt a和Cyt c等化合物，可与次氯酸（盐）和反应。测量血浆中的维生素C应当谨慎，因为维生素极易被氧化成脱氢抗坏血酸，而脱氢抗坏血酸不稳定。β胡萝卜素可促进体内维生素A的形成，又被称维生素A原，可通过其共轭的烷基结构来稳定有机过氧自由基，其主要功能是熄灭单线态氧。泛醌，或称CoQ10，是氧化磷酸化过程中线粒体呼吸链中必需的辅因子，其还原形式称为泛醇（CoQ10H2），可与维生素E协同中止脂质过氧化链式反应，抑制脂质过氧化的启动和传播，还可防止血浆中脂蛋白以及生物膜中脂质过氧化。

其他抗氧化剂还包括如尿酸、α－硫辛酸、胆红素以及血浆铜蓝蛋白。每一种抗氧化物都具有特异性，它们从不同方面直接清除体内的ROS自由基，其作用不能互相替代，但相互之间可协同作用，从而达到对细胞的全面保护。通过对血浆中抗氧化物质的测定，其多少可作为机体抗氧化能力的指标，但不宜单独使用某种抗氧化物质来反映整体的抗氧化能力。

四、抗氧化物间相互关系

各种抗氧化酶与各种抗氧化物之间存在相互补充、相互依赖的协调平衡关系，因而可能存在比较完善的防御体系。

相互补充作用对于ROS自由基生成、清除、过氧化链式反应的终止等不同环节，都有相应的抗氧化剂起作用。如由SOD催化反应生成的过氧化氢，有过氧化氢酶进而分解，并有铜蓝蛋白催化亚铁氧化，从而减少过渡金属通过产生ROS自由基引发及促进ROS自由基损伤；细胞内有脂溶性抗氧化剂维生素E与作用于膜脂质的磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx），同时有水溶性的维生素C和含硒谷胱甘肽过氧化物酶（SeGPx），维生素C和维生素E能互相偶联，虽然SeGPx只能催化游离的脂氢过氧化物分解，PHGPx则能催化膜上的脂氢过氧化物分解；此外，磷脂酶A2能水解磷脂中的过氧化脂质，糖苷酶能识别与切下脱氧核糖核酸双螺旋中被氧化的碱基等，这既是一种防御的补充，又是一种修复功能。

相互依赖关系是指抗氧化剂或酶之间互有联系，如维生素C与维生素E在清除自由基过程中互相支持；当它们自身均被氧化后，要恢复还原状态，需有其他还原剂，并有催化还原反应酶参与；又如，还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内主要的、直接的还原剂，它也是GSH-Px催化过氧化物还原的必需底物，故细胞内GSH的浓度通常为氧化型谷胱甘肽的10倍左右。维持GSH的高水平则有赖于谷胱甘肽还原酶催化的辅酶（NADPH）的氧化反应，而充足的NADPH又依赖葡萄糖代谢的磷酸戊糖途径，谷胱甘肽的合成还必须有充足的含硫氨基酸与合成酶的参与等。此外，抗氧化物间可互相代偿，如动物缺硒时，SeGPx活力降低，其同功酶——谷胱甘肽硫转移酶的活力则升高。