第三节　核酸的检测方法

核酸分子无法用肉眼直接观察，在电泳后需染色或显色并采用一定的检测方法才能观察到核酸的带型。理想的核酸染色试剂应满足以下条件：吸收和发射光谱应在可见光区，以降低散射和荧光背景；应有很强的荧光强度，以获得高灵敏度；染料的存在不会严重改变电泳谱图；有些核酸还需要做进一步的实验，如连接、转化等，染料的存在不影响下一步的实验。根据实验目的和要求不同，核酸凝胶有多种染色、检测的方法，主要可以分为两类：一类是直接染色检测法，如溴化乙锭染色法和银染法；一类是标记物检测法，首先是让标记物和待测核酸结合或者掺入待测核酸，然后再通过检测标记物来检测待测核酸，常用的标记有同位素标记、地高辛标记和荧光标记。

一、溴化乙锭染色法

核酸电泳中最常用的染色剂是溴化乙锭。溴化乙锭全称为3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐（ethidium bromide,EB），是一种荧光染料，本身的荧光很弱。EB分子可嵌入核酸堆积配对的碱基对之间，在紫外线激发下，发出橙红色荧光。

EB激发荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收波长为260 nm的紫外线后，将能量传递给EB分子；二是EB分子本身主要吸收300和360 nm波长的紫外光能量，来源于这两个方面的能量最终激发EB分子发射出波长为590 nm的可见光谱中的橙红色荧光。同时EB-DNA复合物中EB发出的荧光比游离在核酸分子外EB分子发出的荧光强度要大几十倍，因此当核酸含量较高的时候，电泳后不需要对背景处理就可以直接观察核酸电泳的带型。如果核酸含量较低或者琼脂糖的质量较差，吸附较多的EB分子，会使EB的背景太深而看不清核酸的电泳条带，此时可将凝胶浸泡于蒸馏水中30 min以上，减少背景。也可以添加一定的荧光淬灭剂来加快和提高褪色效果，常用的淬灭剂有卤素粒子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。

在核酸电泳中常用1 mmol/L的MgSO4或10 mmol/L的MgCl2加快和提高褪色效果，但是使用荧光淬灭剂在时间上需要把握好，淬灭时间过长，背景降低的同时检测灵敏度也会下降。一般，1 mmol/L的MgSO4不超过1 h，10 mmol/L的MgCl2约5 min，这样可以检测到至少1 ng的DNA样品。在高离子强度的饱和溶液中，DNA大约每2.5个碱基插入一个EB分子，单链DNA、RNA分子中若有自身配对的双链区也可被EB分子嵌入，但嵌入量少，因而检出灵敏度较低，要大于100 ng才能检测到。

在紫外线照射EB-DNA复合物时，不同波长的紫外线出现不同的效应。当用254 nm的紫外线照射时，紫外线主要由核酸分子吸收后传递给EB分子，其检测灵敏度最高，但对DNA损伤严重，会造成核酸的断裂和嘧啶二聚体的形成。此外，用254 nm的紫外光照射时，核酸的荧光寿命（fluorescence life time）也短，照射时间较长时褪色严重。当利用360 nm紫外线照射时，紫外线主要由EB分子吸收，检测的灵敏度较低，但对DNA损伤小，长时间的照射仅有少量的核酸断裂，不会形成二聚体，几乎不褪色，所以适合对DNA样品的长时间观察和回收等操作。300 nm紫外线照射时，主要由EB分子吸收，对观测样品而言，有较高的检测灵敏度，且对DNA损伤不是很大，仅有轻微的褪色，所以成为核酸回收实验的最适合观察波长。

需要特别注意的是，如果电泳回收DNA将用于连接反应，需要用360 nm紫外线进行观察。有研究报道，用波长小于300 nm紫外线照射30s，就能使DNA片段的连接效率下降98%以上，而用360 nm紫外线照射2 min，不会对连接效率产生影响（图2-1）。

EB分子见光易分解，一般用铝箔或黑纸包裹容器在避光条件下室温保存，染色时也应避光。EB是一种强烈的诱变剂，有较强的毒性并被认为有致癌性，操作时需要小心，染色时需要戴乳胶手套，如果不慎接触应立即用水冲洗干净。实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免其污染环境和危害人体健康。对于污染EB的桌面和玻璃器皿可以使用商品化EB高效清除剂，它能有效破坏EB的结构，从而实现清除EB污染的目的。这种清除剂还可用于清除缓冲液、有机溶液和各种固体（玻璃、不锈钢、塑料、地板、设备等）表面的EB污染。

对于EB溶液的处理，一般可以用木炭过滤或用化学方法使其失活。在使用木炭过滤后，需将木炭焚烧使其失活。化学中和方法可以加等体积的漂白粉，搅拌4 h，静置4天，用NaOH调至pH 4～9，倒入排水沟的同时用大量水冲洗；也可以每100 mL的EB溶液加5%磷酸，加12 mL 0.5 mol/L的NaNO 3，搅拌并静置20 h，用NaOH调至pH 4～9，倒入排水沟。对于EB含量大于0.5 mg/mL的溶液也可以采用以下方法处理，将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5 mg/mL，加入等体积的0.5 mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25 mol/L HCl，混匀，置室温数小时，加入等体积的2.5 mol/L NaOH，混匀并废弃。

二、化学染料染色法

由于EB具有毒性和致癌性，会对环境产生一定的污染，所以寻找更安全的核酸染料成了实验者迫切需要解决的问题。目前市场上已经出现了不少可以代替EB的无毒核酸染料产品，它的作用机理及使用方法与EB相同。

市场上存在的多种不同商品名的新型核酸染料，它们其中一些可能在化学成分上是一样或相似的，常见的有SYBR-Green、Goldview和GelRed/GelGreen等。SYBR-Green和Sybrgold稳定性很差，易降解（怕光、怕水、怕热），在紫外灯下本底色较重，其毒性还存在争议。

Goldview被认为就是吖啶橙（acridine orange,AO）的衍生物，它灵敏度较差，本底色较重，对于大片段DNA的染色效果还凑合，但是对500 bp以下的片段染色效果不是很好，在紫外灯下不稳定，容易淬灭。

Goldview不仅能染DNA，也可用于染RNA，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。目前尚未发现Geneview有致癌性，但它有一定的刺激性，在使用过程还需要戴上手套。

Genegreen利用紫外线做激发光源，在效果上和EB有差距，可能是紫外线波长不一样。根据染料的特性，应使用相应的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

GelRed稳定性较好，灵敏度高，几乎没有底色，对核酸迁移的影响小于其他染料，可以用微波炉加热。在312 nm激发的UV凝胶成像系统中，GelRed染色效果和EB差不多，可以完美地替代EB，使用254 nm激发的UV凝胶成像系统或可见光激发的凝胶观察装置中，GelRed足以替代任意一种染料。GelRed在紫外线下不容易淬灭，可以用于胶回收，其毒性也是最低的，但其价格远高于其他的替代染料。

化学染料染色能满足一般DNA检测的要求，是比EB更安全的染料，但是有报道认为，有些化学染料存在稳定性差、难于保存的缺点，且在某些浓度低、片段短的染色中效果不及EB，故目前尚不能完全取代EB。此外，化学染料对不同DNA片段电泳影响具有不确定性，使用化学染料时最好电泳完成后再进行染色。

三、银染法

银染液中的银离子（Ag+）可以和核酸形成稳定的复合物，用还原剂（如甲醛）将Ag+还原成银颗粒并沉积在核酸条带上，形成黄色或黑褐色的条带。银染主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，其灵敏度比EB高200倍，在厚度小于0.5 mm的凝胶中，能检测出0.5 ng的RNA。银染法可用于分子标记和DNA测序，但银染色后核酸和银离子形成不可逆的稳定复合物，核酸的结构被破坏，不宜做核酸的回收，也不适用于制备电泳。银染法检测DNA虽然也可以用于琼脂糖凝胶染色，但不常用。

银染法存在专一性不强和重复性较差的缺点，银离子不仅能与核酸染色，也能与蛋白质、去污剂反应产生相似的颜色，形成较深的背景，如在检测PCR结果的电泳中，由于Taq酶也会被染成与DNA一样的颜色，使得泳道有与核酸电泳条带颜色一样的弥散条带状现象出现，上样量较大时颜色会更深，会覆盖较弱的电泳条带。银染DNA条带颜色的深浅与核酸含量不成正相关，而与核酸的碱性组成有关，因此银染法获得的DNA条带不能反映DNA的真实含量，不能用于核酸含量的比较。银染法对使用的各种试剂、水以及在染色过程的pH、温度及反应时间等要求较高，反应温度过高、时间过长及水和试剂的纯度太差，都会造成背景加深或影响到检测的灵敏度，不同厂家、不同批次的试剂或者反应时间的差异也可能会造成重复性差。此外，银染存在许多不同的显色方法，这些方法的操作时间和得到的染色背景都有很大差异。目前有很多商品化的银染试剂盒，这些试剂盒不仅操作方便，而且重复性也较好。

四、放射性检测法

放射性检测法是利用放射性同位素来检测目的核酸，可以把标记的NTP置换DNA末端核苷酸，或将带标记的dNTP掺入DNA序列中，电泳完成后检测凝胶中的核酸带型；也可以把完成电泳的凝胶上的DNA转移到相应的膜上（如硝酸纤维素膜或尼龙膜），然后与放射性同位素标记过的探针进行杂交，再检测膜上特定的核酸条带。结合了放射性同位素的核酸可以利用X光胶片曝光来检测核酸条带及其含量，或者是利用放射性成像设备来检测，如美国Amersham公司Typhoon多功能激光扫描成像系统，可以检测磷屏、多色荧光、化学发光，可用于同位素、荧光、化学发光标记的电泳凝胶、杂交膜、组织切片、生物芯片等多种样品的扫描，并用软件对得到的图像进行分析。

常用于核酸标记的同位素有32P、33P和35S，它们都属于β衰变释放出的β粒子，但是它们在能量上有差别。32P释放的β粒子能量高，穿透力较强，因此灵敏度较高，放射自显影所需的时间也短。32P的缺点是半衰期较短，射线的散射较严重，导致X胶片上的带型会变得肥大而且轮廓不够锐利，因而影响到分辨率。当遇上对分辨率要求较高的实验（如原位杂交的实验），则会影响到对实验结果的分析。35S释放的β粒子能量较32P低，检测的灵敏度也较32P低，但其射线的散射作用较弱，在X胶片上显影的带型较锐利，分辨率高，适用于对分辨率要求较高的原位杂交实验。33P检测的灵敏度介于32P和35S之间，其散射作用小于32P，检测灵敏度较35S高，但其价格较昂贵，也很少厂家生产，因而很少使用。

需要注意的是，32P标记的商业产品有核苷酸（32P-NTP）和脱氧核苷酸（32P-dNTP），其剂型有水溶液型和乙醇溶液型，前者可以直接使用，后者需要离心、干燥，重新溶解后再使用。此外，还要特别注意32P在三磷酸核苷酸分子上的标记位置，有些方法需要α位标记，如缺口平移和随机引物标记法使用[α-32P]dNTP；有些方法需要γ位标记，如利用多核苷酸激酶的末端标记法使用是[γ-32P]NTP。

用放射性同位素标记检测核酸有以下优点：第一，灵敏性高，一般可达到0.5～5 pg或更低浓度核酸的检测水平。延长曝光时间，采用增敏屏增敏（一种专门的X曝光盒），可以检测极少量或拷贝数少的基因组。第二，特异性高。用放射自显影法，样品中存在的无关核酸或非核酸成分不会干扰检测结果，准确率高，假阳性率低。第三，方法简便。用放射自显影法只对实验环境有一定的要求，不需要专门的设备，所以放射性同位素标记核酸探针在一些有条件的单位作为主要的标记方法仍在使用。

放射性同位素标记技术也存在以下缺点：第一，半衰期短，标记的探针不能长期保存，如32P和33P半衰期只有14.3天，放射强度逐日变化。35S的半衰期可达88天，但衰变能量只有32P的1/10，所以灵敏度比32P低。第二，检测时间长，用放射自显影需要较长的曝光时间（1～15天），35S的曝光时间更长，所以为了防止凝胶中的核酸扩散，一般放置-70℃的冰箱中曝光。第三，能生产的单位少，价格较昂贵，特别是α-32P标记的dATP（400 Ci/mmol）。第四，放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染，放射性废物处理困难，因此，推广使用受到限制。放射性检测现多用于DNA分子杂交（Southern杂交和Northern杂交）、分子标记、文库筛选和DNA测序，也可以进行回收制备。

五、地高辛检测法

地高辛（Digoxigenin,DIG）是一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇物质。由于该植物的花和叶片是DIG在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。DIG分子是通过自身一个含有11个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸上的C5位置相连，DIG标记的核苷酸可以通过末端标记法、缺口平移标记法、随机引物标记法或者PCR方法掺入到核苷酸探针中，然后利用探针去检测转移到膜上的特定核酸。

对于DIG标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）、过氧化物酶（peroxidase）、荧光素（fluorescein）、若丹明（rhodamine）或是胶体金（colloidal gold）等高亲和性的抗DIG抗体共轭物，也可选用不带任何共轭连接的抗DIG抗体和二级抗体。

检测的灵敏度主要依赖于对不同抗DIG抗体共轭物显示方法的选择，以连接有碱性磷酸酶的抗DIG抗体为例，既可以使用NBT或BCIP做底物的显色法，也可以使用HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到0.1 pg（Southern杂交）。

利用DIG标记的dNTP嵌入DNA序列，然后利用免疫化学显色，或利用X光片通过发光法来检测DNA，检测效果与放射性效果一样，安全无放射性污染，灵敏度高，但成本较高，一般用于分子标记和文库筛选。

与放射性标记和检测技术相比较，DIG灵敏度高，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性标记的灵敏度相媲美。此外，DIG标记还有如下优点：曝光时间短，结果显示的时间是以分钟计算，无须几小时甚至几天的自显影过程；安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染；探针可重复使用，最少可以稳定储存一年；可轻松进行探针剥离和重探。

六、荧光标记法

利用荧光染料标记的核苷酸掺入到核苷酸链中，然后利用特定波长的激光激发荧光来检测DNA。荧光检测一般需要专门的检测设备，所以荧光标记法主要用于荧光定量PCR和DNA自动化测序。荧光标记法还可以把4种核苷酸标记成4种不同的颜色，以更好识别不同的核苷酸，例如在自动化测序中，4种双脱氧核苷酸标记成4种不同的颜色，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。