第一节 核酸电泳的原理
核酸在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移，迁移速度称为电泳速率。
一、核酸电泳的原理
组成核酸大分子的核苷酸分子含有一个带氨基基团的碱基和三个磷酸基团，因而核酸分子是一种两性解离分子，在溶液的pH为3.5时碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸基团解离，此时分子相当于带正电的阳离子，在电场中向负极泳动；而当溶液的pH为8.0～8.3时，核酸分子碱基上的氨基几乎不解离，而三个磷酸基团完全解离，此时核酸分子相当于带负电的阴离子，因此在电场中它就会向正极移动，所以核酸电泳中常用中性或偏碱性的缓冲液进行电泳。
带电分子在电场中的移动速率与样品分子电荷密度、电场的电压和电流成正比，与样品的大小、介质的黏度及电阻成反比。核酸是带均匀电荷的生物大分子，不同大小和分子构象的核酸分子电荷密度大致相同，因而在自由电泳的条件其对移动速率影响不大，分子大小和构象不同的核酸分子的迁移率差异很小，难以分开。当以适当浓度的凝胶作为电泳支持介质，凝胶具有分子筛效应，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子电泳速率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段，检测其大小的目的。
在一定强度的电场条件下，DNA分子的迁移速率取决于核酸分子的大小和本身的构型。相对分子质量小的移动速率快，具有紧密构型的分子比松散构型的移动速率快，但在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的移动速率大致相同。若将带静电荷Q的离子置于电场中，它的受力简单分析如下：
电荷引力：F引=EQ
根据Stokes公式，运动中的颗粒在溶液中受到阻力：F阻=6πrην
平衡时有F引=F阻，即EQ=6πrην
整理后得：ν=EQ/（6πrη）
式中：E，电场强度；r，球形粒子的半径；η，溶液的黏度系数；ν，带电粒子运动速度。
由上式可知，相同带电颗粒在不同强度的电场里泳动速度是不同的，为了便于比较，常用迁移率代替泳动速度表示粒子的泳动情况，迁移率为带电粒子在单位电场强度下的泳动速度。若以m表示迁移率：上式两边同时除以电场强度E，则得：m=Q/（6πrη）。
由于核酸、蛋白质和氨基酸等生物大分子的电离度α受溶液pH影响，所以常用迁移率m和当时条件下电离度α的乘积，即有效迁移率U表示大分子的泳动情况：
U=mα
代入m得：U=αQ/（6πrη）。
从上面公式可以看出，影响分子带电量Q及电离度α的因素如溶液的pH、影响溶液黏度系数的因素如温度、分子的半径r等，都会影响有效迁移率，因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行，并选用一定pH的缓冲液，所选用的pH以能扩大各种被分离组分所带电荷量的差异为好，以利于各种成分的分离。
二、核酸电泳的载体
核酸电泳中常用的电泳介质是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶电泳方便快速，用于检测和分离纯化，分辨力在0.1～50 kb之间；聚丙烯酰胺凝胶，分辨率高，可以用于测序，分辨力在1 bp～1 kb之间。
琼脂糖（agarose,Gel）是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖连接而成的一种多糖。琼脂糖凝胶是一种大网孔型凝胶。总的说来，琼脂糖凝胶具有以下特点：含水量大，最高可达99%以上，使被电泳的核酸分子近似于自由电泳，但是分子的扩散度比自由电泳小；琼脂作为支持体，凝胶的制备简便，电泳条带均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好；电泳速度快，电泳时间较短；透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定；对蛋白质的吸附极微，区带易染色，样品易回收，有利于制备。
琼脂糖凝胶的制作是将琼脂糖粉悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%～3%，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些羰基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。
琼脂糖凝胶电泳操作简单，但琼脂糖凝胶垂直式电泳应用得相对较少，通常是制成水平式板状凝胶，在强度和方向恒定的电场下电泳，一般也多为实验室采用。在核酸电泳中使用低浓度的荧光嵌入染料染色，在紫外线下至少可以检出1～10 ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。琼脂糖凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，分离DNA片段大小的范围也不同，不同浓度琼脂糖凝胶可分离DNA片段长度从100 bp至约50 kb，而在脉冲电场下可以分离10000 kb以上的DNA分子。
由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用形成的，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，如NaI或者NaClO4能够将凝胶的溶解，有些凝胶回收试剂盒就是利用这一原理来将凝胶溶化，因此不必使用低熔点的琼脂糖来进行DNA的回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般来说，琼脂糖凝胶不适用于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）是一种人工合成的大分子物质，由丙烯酰胺（Acr）在N,N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小主要由Acr与Bis的相对比例决定。
聚丙烯酰胺用于DNA电泳的原理和琼脂糖电泳相似，和琼脂糖适合分离大片段DNA分子相比，聚丙烯酰胺凝胶对于5～500 bp小片段的DNA分子分离效果最好。核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置，用于测序和分子标记。
和琼脂糖相比，聚丙烯酰胺凝胶分辨率更高，变性聚丙烯酰胺凝胶能将相差1 bp的DNA片段电泳分开，可用于分析和制备小于1 kb长度的DNA片段，也可用于DNA测序和AFLP、微卫星等分子标记等检测。聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA样品纯度高，可用于严格的实验，如引物合成和转基因动物实验时回收样品。此外，聚丙烯酰胺凝胶机械强度高于琼脂糖，不容易损坏；其电泳速度很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶烦琐。
三、核酸电泳的指示剂
核酸分子无法直接肉眼观测，所以电泳过程中常使用有颜色的指示剂来指示样品的迁移过程，通过指示剂和相应核酸分子的关系来判断电泳的进程。核酸电泳常用的指示剂有溴酚蓝和二甲苯青FF，溴酚蓝呈蓝紫色，相对分子质量为670；二甲苯青FF呈蓝色，相对分子质量为554.6，其荷电量比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢。两种指示剂都较小，凝胶中对它们分子筛效应小，近似于自由电泳，因此在不同浓度的凝胶中，它们迁移速度基本相同。以0.5×TBE为缓冲液，在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1.0、0.6、0.15 kb的双链线性DNA片段大致相同。以0.5×TBE为缓冲液，在0.1%琼脂糖凝胶电泳中迁移率相当于4 kb的双链线性DNA片段。在5%的PAGE迁移率相当于260 bp的双链线性DNA的迁移率，在5%含7～8 mol/L尿素聚丙烯酰胺中相当于130 bp单链DNA的迁移率。指示剂在凝胶的迁移率可以参照表2-1，表2-2。
表2-1 各指示剂在不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的迁移率
表2-2 各指示剂在不同浓度琼脂糖凝胶的迁移速率
