4.2.1　厌氧消化的原理

4.2.1.1　厌氧消化阶段理论

厌氧消化过程是一个非常复杂的生物处理过程，其中涉及的微生物种群颇多，因此厌氧消化过程可分为若干阶段，国际上比较流行的厌氧消化阶段理论可分为两阶段、三阶段和四阶段理论。

（1）两阶段理论

厌氧消化是一种在厌氧条件下的生物处理技术，有机物在厌氧消化中得到分解并产生CH₄和CO₂。“两阶段理论”流行于20世纪30～60年代，认为厌氧消化过程可分为产酸阶段和产甲烷阶段。在产酸阶段，有机物在产酸细菌的作用下，分解成脂肪酸及其他产物，并合成新细胞；在产甲烷阶段，脂肪酸在专性厌氧菌——产甲烷菌的作用下转化为CH₄和CO₂。但是，酸性发酵阶段的最终产物事实上不仅仅是酸，且发酵产生的气体也并不都是从甲烷发酵阶段产生的，因此，两阶段过程相对恰当的提法为非产甲烷阶段和产甲烷阶段。如图4-1所示。

1）非产甲烷阶段　在非产甲烷阶段，污泥中含有的淀粉、纤维素、烃类和多糖等大分子有机物在兼性厌氧菌胞外酶的作用下进行水解和液化，然后再进入细胞体内，在胞内酶的作用下转化为挥发性有机酸（甲酸、乙酸、丙酸、丁酸）和硫化物。在该阶段主要参与反应的微生物统称发酵细菌或产酸细菌，其具有生长速率快，对温度、pH值等环境条件适应性强等主要特点。在这一阶段，污染物会发生以下变化：

① 由于有机物酸化的作用而导致pH值降低；

② 在酸化过程中，发生有机物的脱氢反应，会有H₂产生；

③ 由于在水解酸化过程主要是有机物形态的变化，因此BOD和COD变化不明显；

④ 在兼性厌氧菌分解有机物的过程中，产生的能量几乎全部被消耗作为有机物发酵所需的能源，仅有少部分合成新细胞，细胞没有增殖。一般产酸菌能够很好地适应温度、pH值的快速变化。

2）产甲烷阶段　在产甲烷阶段，第一阶段产生的甲酸、乙酸、甲胺、甲醇等小分子有机物在经过产甲烷菌的作用下转化为CH₄，厌氧消化体系的pH值上升至7.0～7.5，因此，又称为碱性发酵阶段。该阶段主要参与反应的微生物是产甲烷菌（Methane producing bacteria），其具有生长速率慢，世代时间长，对温度、pH值、绝对厌氧、抑制物等环境条件极为敏感等主要特点。这一阶段具有以下特征：

① 由于第一阶段产生的中间产物和代谢产物均被产甲烷菌利用而分解成二氧化碳、甲烷和氨，导致pH值上升；

② 由于构成BOD或COD的有机物多以CO₂和H₂的形式逸出，所以BOD和COD明显降低；

③ 产甲烷细菌把甲酸、乙酸、甲胺、甲醇等基质转化为甲烷，其中最主要的基质为乙酸。产甲烷菌对环境条件要求较高且繁殖速度慢，因此产气阶段是厌氧消化的限速关键。

（2）三阶段理论

随着对厌氧消化微生物不断深入的研究，厌氧消化过程中产甲烷细菌和不产甲烷细菌之间的相互关系更加明确。1979年，根据微生物种群的生理分类特点，伯力特等提出了厌氧消化三阶段理论。

第一阶段，在水解与发酵细菌作用下，蛋白质、碳水化合物与脂肪等有机物经水解和发酵转化为单糖、脂肪酸、氨基酸、甘油、二氧化碳和氢等。

第二阶段，在产氢产乙酸菌的作用下，第一阶段的水解产物转化成氢、二氧化碳和乙酸。如戊酸的转化化学反应式，如式（4-1）所示：

CH₃CH₂CH₂CH₂COOH+2H₂OCH₃CH₂COOH+CH₃COOH+2H₂　　（4-1）

丙酸的转化化学反应式，如式（4-2）所示：

CH₃CH₂COOH+H₂OCH₃COOH+2H₂+ CO₂　　（4-2）

乙醇的转化化学反应式，如式（4-3）所示：

CH₃CH₂OH+H₂OCH₃COOH+2H₂　　（4-3）

第三阶段，在产甲烷菌的作用下，氢和二氧化碳转化为甲烷或对乙酸脱羧产生甲烷。产甲烷阶段产生的能量绝大部分用于维持细菌生存，只有少量用于合成新细菌，因此细胞的增殖很少。在厌氧消化的过程中，由乙酸转化形成的CH₄约占总量的2/3，由CO₂还原形成的CH₄约占总量的1/3，如式（4-4）和式（4-5）所示：

4H₂+ CO₂CH₄+2H₂O　　（4-4）

CH₃COOHCH₄+CO₂　　（4-5）

由上可知，在厌氧消化中产氢产乙酸细菌具有极为重要的作用，它在水解与发酵细菌及产甲烷细菌之间的共生关系中，起到了联系作用，通过不断地提供大量的H₂，作为产甲烷细菌的能源和还原CO₂生成CH₄的电子供体。

消化三阶段的模式如图4-2所示。

总之，厌氧消化过程中产生CH₄、CO₂与NH₃等的计量化学反应方程式为：

C_nH_aO_bN_d+H₂O

CH₄+dNH₃+CO₂+能量　　（4-6）

当d=0时，为不含氮有机物的厌氧反应通式，即伯兹韦尔（Buswell）和莫拉（Mueller）通式：

　　C_nH_aO_b+H₂O

　　　　CH₄+CO₂+能量　　（4-7）

（3）四阶段理论

“四阶段理论”与“三阶段理论”几乎同一时间出现，在该理论中参与厌氧消化过程的微生物可以分为五大类：水解酸化细菌（第一阶段）、产氢产乙酸菌（第二阶段）、同型产乙酸菌（第三阶段）、耗氢产甲烷菌（第四阶段）、耗乙酸产甲烷菌（第四阶段）。图4-3为厌氧消化反应的四阶段理论模式^［2］。

在“三阶段理论”的基础上，“四阶段理论”增加了同型产乙酸菌，可将产氢产乙酸细菌产生的H₂和CO₂合成乙酸。

总体来讲，“三阶段理论”和“四阶段理论”是目前公认的对厌氧消化机理较为全面的描述。

根据厌氧消化的特征，通常可以将厌氧消化分为部分厌氧消化和完全厌氧消化。如果产甲烷菌仅利用了第一阶段水解酸化产生的乙酸、甲酸、甲醇和甲胺等小分子有机物，则称为不完全厌氧消化或部分厌氧消化；如果产氢产乙酸菌继续将不能被产甲烷菌直接利用的乳酸、丙酸、丁酸、乙醇等有机物转化为氢气和乙酸，进而被产甲烷菌利用，则称为完全厌氧消化。

碳水化合物、蛋白质和脂肪这三大类有机基质厌氧消化过程分述如下。

1）碳水化合物的厌氧分解　所谓碳水化合物，是指淀粉、纤维素、葡萄糖等糖类，其分子式一般为C_m（H₂O）_n。在生活污水的污泥中，碳水化合物约占20%。在消化过程第一阶段，在胞外酶的作用下，碳水化合物（多糖）首先水解成单糖并渗入细胞，在胞内酶的作用下，进一步转化为乙醇等醇类和乙酸等酸类。第一阶段产生的醇类和酸类物质在第二阶段被分解成甲烷和二氧化碳。1g可分解的碳水化合物的产气约为790mL，其组成为50%CO₂和50%CH₄。

2）蛋白质的厌氧分解　在消化过程第一阶段，具有解朊酶（proteolytic）的菌能分泌出使蛋白质水解的酶，将蛋白质的大分子分解成简单的组分，形成各种氨基酸、二氧化碳、尿素、氨、硫化氢、硫醇等。尿素则在尿素酶的作用下迅速地全部分解成二氧化碳和氨。在第二阶段，氨基酸进一步分解成甲烷、二氧化碳和氨。1g蛋白质的平均产气量约为704mL，其成分为29%CO₂和71%CH₄。

在1963年，MeCarty和Jeris曾用原子示踪法研究了污泥消化过程中CH₄的形成，其形成的百分率如图4-4所示。

3）脂肪的厌氧分解　在脂肪分解的第一阶段，在解脂菌或脂酶的作用下，脂肪水解成为脂肪酸和甘油。随后在酸化细菌的作用下，进一步转化为醇类和酸类。在第二阶段二者进而分解成CO₂和CH₄。1g脂肪的平均产气量为1250mL，其主要成分为22%CO₂和68%CH₄。

4.2.1.2　厌氧消化微生物学原理

在厌氧消化过程中，参与反应的细菌分为两大类：一类是产氢产乙酸菌、水解酸化菌和同型产乙酸菌等非产甲烷菌；另一类是产甲烷菌。由于微生物种群之间的生态平衡关系是支配厌氧消化过程的本质规律，所以在本节中着重介绍厌氧消化过程微生物的种类、特性及其相互代谢关系。

（1）厌氧消化过程微生物种类

1）非产甲烷菌

① 水解发酵菌（产酸细菌）。主要的发酵产酸细菌包括梭菌属、拟杆菌属、丁酸弧菌属、双歧杆菌属等。其主要功能是水解和酸化作用。水解——在胞外酶的作用下，将不溶性大分子有机物水解成可溶性有机物；酸化——将可溶性大分子有机物转化为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有机酸及醇类等。水解发酵细菌的水解过程较缓慢，并受SRT、pH值、有机物种类等多种因素的影响，但产酸反应的速率较快。发酵产酸细菌可以按功能分为蛋白质分解菌、半纤维素分解菌、淀粉分解菌、纤维素分解菌、脂肪分解菌等。

② 产氢产乙酸菌。该类细菌的主要功能是将各种高级脂肪酸和醇类氧化分解为乙酸、CO₂和H₂，为产甲烷阶段提供合适的基质，在厌氧系统中常常与产甲烷细菌处于共生互营关系。主要的产氢产乙酸反应有：

乙醇　　　　　　　CH₃CH₂OH+H₂OCH₃COOH+2H₂　　（4-8）

丙酸 　　　　　CH₃CH₂COOH+2H₂OCH₃COOH+3H₂+CO₂　　（4-9）

丁酸 　　　　CH₃CH₂CH₂COOH+2H₂O2CH₃COOH+2H₂　　（4-10）

只有在乙酸浓度和系统中氢分压很低时上述反应才能顺利进行，因此，产氢产乙酸反应的顺利进行，常常需要后续产甲烷反应能及时将其主要的两种产物乙酸和H₂消耗掉。主要的产氢产乙酸细菌多数是专性厌氧菌和兼性厌氧菌，包括互营杆菌属、互营单胞菌属、梭菌属、暗杆菌属等。

③ 同型产乙酸菌。在“三阶段理论”的影响下，人们将注意力集中在产氢产乙酸菌与产甲烷菌等的互营作用上，并将其归入产甲烷相进行研究，却忽略了产酸菌、产氢产乙酸菌与同型乙酸菌之间的相互作用。值得一提的是，同型产乙酸菌在厌氧产酸过程中，具有特殊作用，它可以将二氧化碳和氢气转化为乙酸，在氢分压高时，它的作用增强；在氢分压低时，它的作用减弱，起到了一个平衡器的作用。但在一般厌氧消化器中，同型产乙酸菌所产的乙酸不到4%。尽管人们对自然生态系统中同型产乙酸菌对碳循环的重要贡献有较深入的认识，但却没能在人工厌氧产酸系统中充分发挥同型产乙酸菌的作用。

2）产甲烷菌（Methanogens）　产甲烷菌是产甲烷阶段的主要细菌，属于严格的厌氧菌，主要代谢产物是甲烷。主要可分为两大类：乙酸营养型产甲烷菌和H₂营养型产甲烷菌。

产甲烷细菌的主要功能是将产氢产乙酸菌的产物——乙酸和H₂/CO₂转化为CH₄和CO₂，使厌氧消化过程得以顺利进行。一般来说，在自然界中，乙酸营养型产甲烷菌的种类较少，只有产甲烷八叠球菌（Methanosarcina）和产甲烷丝状菌（Methanothrix），但这两种产甲烷细菌在厌氧反应器中居多，特别是后者，因为在厌氧反应器中，乙酸是主要的产甲烷基质，一般来说，有70%左右的甲烷是来自乙酸的氧化分解^［2］。

典型的产甲烷反应有：

CH₃COOHCH₄+CO₂　　（4-11）

　4H₂+CO₂CH₄+2H₂O 　　（4-12）

　4CO+2H₂OCH₄+3CO₂ 　　（4-13）

　　　　　　4CH₃OH3CH₄+HC+H⁺+H₂O 　　（4-14）

CH₃OH+H₂CH₄+H₂O 　　（4-15）

根据产甲烷菌的形态和生理生态特征，可将其进行分类，如图4-5所示。

迄今为止，可分离鉴定的产甲烷菌达到70余种，分属于3个目，7个科，19个属。产甲烷菌有各种不同的形态，我们常见的产甲烷菌有产甲烷杆菌、产甲烷球菌、产甲烷螺旋菌、产甲烷八叠球菌四类。表4-4列示了几种主要产甲烷菌种属及其分解的底物。

厌氧消化过程中产甲烷菌的生长情况直接关系到甲烷的产量，其能分解的物质均是由大分子有机物分解生成的小分子中间产物，本身并没有直接分解大分子有机物的能力。

产甲烷菌是通过细胞分裂进行繁殖。下面两种物质可以大大促进这一细胞分裂作用，有助于产甲烷菌的繁殖，但是，这二者之间又存在着相互排斥的作用。

① 滤泡激素（follicular hormone，follikehoron）：公马或妊娠的母马尿中得到的激素。

② 细菌酶（bacteriozym）：从酶细胞中得到的植物性提取物。

无论哪一种产甲烷菌的生存时间都不少于几个星期，因此，一个新建或者一度停用的消化池，会需要很长的启动时间。但是，通过良好的消化污泥进行定期接种，也可在短时间内最大限度地发挥细菌的作用。

产甲烷菌由于具有某种性质的生物排他性，因此，在产甲烷菌大量繁殖的地方，其他微生物的种类和数量就受到抑制。

细菌的生长和繁殖，通常是依靠同化作用和异化作用这两种不同的代谢活动来维持的。与其他植物一样，细菌对养分的吸收与代谢产物的排出，是通过细胞膜的渗透作用进行的。一般来讲，细菌体内的代谢产物浓度高于周围液体的浓度时，由于渗透压的作用，细菌将从周围吸收水分。但是，细胞膜弹性产生的渗透压与反渗透压达到平衡时，细菌便膨大而处于正常状态。但是，随着代谢产物的增加，细菌体内的浓度低于周围液体的浓度时，渗透压则起反作用，从细菌体内夺走水分，导致原生质（protoplasm）萎缩，即使周围还有水，细菌的生命也将就此终止，为促进消化过程而进行的搅拌就是要避免产生这种情况。只要存在养分并具备必要的生活条件，细菌就能不断地进行吸收养分与代谢作用。

对于产甲烷菌来讲，最重要的养料是碳和氮，但其他有机物和无机物对其生存也有影响。有机的有效物质是酶和维生素。酶大致可以分为以下几种。

① 氧化还原酶类　氧化还原酶类大致可以分为脱氢酶和氧化酶两种。脱氢酶可以活化底物上的氢，并使它转移到另一种物质上，使底物因脱氢而氧化，不同的底物将由不同的脱氢酶进行脱氢作用。氧化酶能将分子氧（空气中的氧）活化，从而作为氢的受体而形成水或催化底物脱氢，并氧化生成过氧化氢。

② 转移酶类　转移酶类能催化一种化合物分子的基团转移到另一种化合物分子上。

③ 水解酶类　水解酶类能催化大分子有机物的水解作用及其逆反应。

④ 裂解酶类　裂解酶类能催化有机物碳链的断裂，产生碳链较短的产物。

⑤ 异构酶类　异构酶类能催化同分异构化合物之间的相互转化，即分子内部基团的重新排列。

⑥ 合成酶类　合成酶类能催化有三磷酸腺苷参加的合成反应，这类酶关系着很多重要生命物质的合成。

在无机的有效物质中，在数量上比较主要的是磷酸（P₂O₅）和钾（灰分）（K₂O）。此外，铁、钠、镁、铜、硫、钼、钴、锡、钯等痕量元素对产甲烷菌的生长也有影响。少量的硫化氢有助于细菌繁殖，但浓度一高就成为有害物质。

另外，必须创造一个弱碱环境，最佳pH值应保持在7.0～7.5，有机酸浓度应在2000～3000mg/L以下。这一容许浓度将根据氨和其他阳离子存在的情况稍有变动。有机酸浓度是通过迪克洛（Duclaux）法以乙酸的含量测定的，其值与pH值无关。有机酸浓度如果在2000～3000mg/L以上，产甲烷菌的活动能力将逐渐减弱，消化速度也慢了。可通过停止供给生污泥、降低污泥含固率、投入消石灰等方法予以解决；但是，如果适应产甲烷菌生活的条件不能恢复，污泥就将开始酸性发酵。当有机酸浓度在5000mg/L以上，这些处理措施几乎无效。另一方面，最佳碱度的上限，换算成CaCO₃为2000mg/L左右。

在生物分类学上，产甲烷菌（Methanogens）属于古细菌（Archaebacteria），大小、外观上与普通细菌（Eubacteria）相似，但实际上，其细胞成分特殊，特别是细胞壁的结构较特殊。产甲烷菌在自然界的分布，一般可以认为是栖息于一些极端环境（如地热泉水、深海火山口、沉积物等）中，但实际上其分布极为广泛，如污泥、瘤胃、昆虫肠道、湿树木、厌氧反应器等。产甲烷菌是严格的厌氧细菌，氧和氧化剂对其有很强的毒害作用，要求氧化还原电位在-400～-150mV。产甲烷菌的增殖速率很慢，繁殖世代时间长，可达4～6d。产甲烷菌的生存温度为0～80℃，低温、中温、高温细菌的最佳温度分别为15℃、30℃、55℃左右。与兼性厌氧菌比较，产甲烷菌更为敏感。但是，如果给产甲烷菌创造了最佳生活条件，就会得到良好的消化污泥。图4-6为非产甲烷菌与产甲烷菌群理论。

（2）厌氧消化过程中微生物的代谢关系

厌氧消化是一个多菌群共同代谢的过程，各类菌群之间的代谢作用相辅相成。在整个厌氧代谢过程中，产甲烷菌并不是孤立进行的，它周围众多的菌群先于产甲烷菌代谢，以此提供产甲烷菌正常代谢的条件。从物质代谢转化的角度来看，首先，有机物的大分子水解，把纤维素、半纤维素、果胶、淀粉、脂类和蛋白质等物质，经水解发酵生成水溶性糖、醇、酸等分子较小的化合物；然后，微生物进一步把较小分子的化合物降解形成产甲烷菌可直接利用的底物，主要是乙酸盐、H₂和CO₂等；最后，产甲烷菌才能利用极简单的小分子化合物代谢产生CH₄和CO₂。有机物质在经过厌氧生物转化为甲烷的过程中，涉及一系列微生物菌群代谢，它们的底物和特性完全不同。整个转化过程可以描述为许多种不同微生物类群的直接和间接的共生联合关系。确定的9个步骤分别由专门的菌群调节代谢，这9个步骤分别为：a.有机聚合物水解成有机单体，如糖、有机酸和氨基酸等；b.有机单体转化成氢、重碳酸盐、乙酸、丙酸和丁酸以及其他有机产物如乙醇、乳酸等；c.产氢产乙酸菌对还原性有机物具有氧化作用，能生成氢气、重碳酸盐和乙酸；d.同型乙酸菌对重碳酸盐的产乙酸呼吸作用；e.硝酸盐还原菌（NRB）和硫酸盐还原菌（SRB）对还原性有机物的氧化作用生成重碳酸盐硼乙酸；f.NRB和SRB对乙酸的氧化作用，生成重碳酸盐；g.NRB和SRB对氢气的氧化作用；h.裂解乙酸的甲烷发酵；i.重碳酸盐的产甲烷呼吸作用。

在厌氧消化过程中，微生物的相互作用实质上是各类微生物在代谢上的相互影响。每一种微生物都有其自身的代谢途径，它们可以在特定的环境中单独行使其代谢功能。因此，研究它们的代谢条件和代谢途径是非常有用的。但在厌氧消化反应器这样一个杂居的环境中，各类型的微生物生活在一起，各自进行自身特有的代谢，并形成各自的代谢产物，彼此之间的相互作用，使它们能正常进行生命活动，然而它们所形成的代谢产物可能引起如下后果：a.产物累积引起的反馈抑制效应；b.代谢产物被其他菌群利用，促进其生长；c.抑制其他菌群；d.造成有利或不利于其他菌群的生态环境。

这些问题在厌氧消化反应器中都有可能出现，而在厌氧消化正常运行或运行失败时，代谢产物的种类及其浓度都有很大的差别，代谢产物引发的问题和后果也完全不同。在正常的厌氧消化过程中，各种微生物代谢过程发生相互偶联，产物得到协调，整个消化过程达到平衡。相反，任何一个代谢过程的失调都有可能引发整个过程的破坏，使厌氧消化过程失衡。因此，研究厌氧消化微生物的相互关联性是一个重要且复杂的内容。

（3）甲烷发酵过程微生物的代谢关联性

对厌氧消化过程中发酵液和气体成分进行分析，特别是将一些功能菌的代谢产物进行分析，就不难发现微生物之间的代谢关系。

1）水解酸化菌与产甲烷菌之间的相互关系　图4-7所示为某反应器内污泥厌氧消化过程中挥发酸和日沼气产量的关系。在厌氧消化开始后的初期阶段，反应器内大量产酸，挥发酸的浓度最高可达4000mg/L，此时反应器内以水解酸化过程为主，此后，反应过程逐渐过渡到产甲烷阶段。反应器内水解酸化阶段和产甲烷阶段是两个无法在绝对意义上分开的过程，这主要是由产酸过程和产甲烷过程没有达到代谢平衡所致。由于产酸菌的繁殖速率较高，在厌氧消化开始初期就大量繁殖，产生较大量的挥发酸，而产甲烷菌的繁殖速率较慢，因此，水解酸化细菌代谢产生的挥发酸不能及时地被产甲烷菌利用，故此阶段主要表现为挥发酸的积累。当产甲烷菌数量增加、微生物区系相对完善后，挥发酸很快被消耗，产甲烷则成为主要特征。由于在挥发酸增强的同时，产甲烷菌的数量不断增加，沼气产量也随之增加，此时水解酸化阶段和产甲烷阶段构成一个连续的过程。因此可以采用增加接种物的办法缩短这两个阶段之间的时间差，使产甲烷阶段提前。研究人员曾在污泥厌氧消化试验中，在反应器内接种容积量35%的厌氧消化液作为启动微生物，此时反应器在第2日即可正常产气，第4日即可达到产气高峰，而接种反应器容积量15%的厌氧消化液时，产气高峰出现在第9日，这说明增加接种物的用量可以较好地保证反应器的正常启动，也说明水解酸化阶段和产甲烷阶段是可以人为调控的^［2］。

2）水解酸化菌之间相互关系　在污泥厌氧消化过程中，运行正常的消化罐内挥发酸的乙酸浓度最高，为200～1500mg/L；丙酸浓度较低，为300～1000mg/L；丁酸浓度最低，在100mg/L以下，有时其浓度低于检测线。这几种挥发酸中乙酸的浓度波动是最明显的。当乙酸浓度降到比丙酸低的时候，特别是乙酸浓度低于200mg/L时，丙酸、丁酸的浓度均有明显的下降。在中温发酵过程中，挥发酸的变化趋势也较为近似。上述这些结果表明，在厌氧消化过程中，产酸菌主要以产乙酸菌为主，产丙酸菌次之，产丁酸菌最少。丙酸、丁酸不能被产甲烷菌直接利用，它们在被进一步降解为乙酸后才能转化为甲烷。因此，丙酸和丁酸浓度的下降显然说明了与产乙酸菌的密切关系，这充分说明它们之间有相互依赖的关系和种群消长关系，这种关系无论在常温还是中温消化过程中都比较稳定。

3）产氢和产甲烷菌的相互关系　自20世纪80年代奥氏甲烷杆菌被分离后，产氢菌和产甲烷菌之间的共生关系才为人所知。此后，这一关系又为其他许多学者所证实。在餐厨垃圾与污泥的混合消化过程中也发现这一现象^［2］。在污泥的厌氧消化过程中，当产甲烷过程进行正常（甲烷浓度60%～70%）时，向反应器中加入反应器容积20%的餐厨垃圾，当pH值降低至6.0时，氢气浓度出现明显上升，当pH值降低至5.0时，氢气浓度达到最大，浓度峰值为50%～55%。氢气浓度在达到峰值后出现下降的现象，此时pH值也随之上升，甲烷浓度也逐步上升。由此可看出，产氢微生物和产甲烷菌两者间有明显的共生关系，沼气中氢气浓度的上升和下降反映了厌氧消化过程中产氢菌和产甲烷菌在代谢上的相互偶联。当反应器的环境更有利于产氢菌繁殖时，产甲烷菌的活性则不断下降，此时氢气浓度最高时可达60%。

4.2.1.3　厌氧微生物的产能代谢

厌氧微生物的产能代谢主要包括两种类型，即发酵和无氧呼吸。

（1）发酵

发酵（fermentation）是某些厌氧微生物在生长过程中获得能量的一种方式，以有机物氧化分解的中间代谢产物为最终电子受体的氧化还原过程。在发酵过程中，可被利用的底物通常为单糖或某些双糖，亦可为氨基酸等。其最终产物是有机酸、醇、CO₂、H₂及能量^［3］。

1）糖酵解途径　糖酵解（embdem-meyerhof-parnas，EMP）主要分为2个步骤。步骤1包括一系列不涉及氧化还原反应的预备性反应，主要是通过加入能量使葡萄糖活化，并将六碳糖分解为三碳糖，其结果是生成一种主要的中间产物3-磷酸甘油醛，并消耗2molATP；步骤2是通过氧化还原反应，产生4molATP、2molNADH+H⁺和2mol丙酮酸。

糖酵解途径具有以下重要意义。

① 微生物发酵产能

Ⅰ.其产能方式称为底物水平磷酸化，分别发生在1，3-二磷酸甘油酸与2-磷酸烯醇式丙酮酸两处。所谓底物水平磷酸化是指底物被氧化过程中，在中间代谢产物分子上直接形成比高能焦磷酸键含能更高的高能键，并可直接将键能交给ADP使之磷酸化，生成ATP的这一过程。底物水平磷酸化是进行发酵的微生物获取能量的唯一方式。1mol葡萄糖经酵解后净产2molATP。

Ⅱ.微生物通过发酵可将葡萄糖转变成乳酸、丙酸、乙醇、丁醇等多种代谢产物，糖酵解是产能的主要途径，产生的能量作为各种发酵产物产生的主要甚至唯一的能量来源。

② 丙酮酸是重要的中间代谢物　糖酵解的终产物是丙酮酸，通过丙酮酸的进一步发酵，可产生各种发酵产物，并可通过NADH+H⁺的氧化，使机体内NADH+H⁺含量保持在一定范围内，从而保证发酵的正常进行。

2）主要发酵类型　微生物发酵形式多样，普遍存在的是以糖酵解为主体的分解代谢，其末端产物则各不相同，发酵类型是根据主要末端产物命名的。微生物机体内调控某一发酵类型中末端产物种类及数量的原因主要有两点。其一，氧化反应必须与另一个还原反应相偶联，从而维持NADH+H⁺/NAD⁺在一定范围内，这种偶联是通过辅酶在两者之间反复地还原和氧化，不断周转而完成的；其二，发酵产能是微生物的目的所在，微生物可根据能量需求状况来调整高产能发酵产物的转化率。表4-5为碳水化合物发酵的主要类型。

发酵在废水和污泥厌氧消化过程中起着非常重要的作用，甚至此过程比产甲烷过程更为关键。国内外的研究表明，在厌氧消化过程中主要存在丙酸型发酵和丁酸型发酵两种类型。这两种发酵类型的分类与生物化学中的分类有一定联系，但也有所差别。

① 丙酸发酵。丙酸发酵以糖酵解产生的丙酮酸为起点，其中包括部分TCA循环。主要参与的细菌是丙酸杆菌属。此类型发酵的特点是气体（CO₂）产量很少，甚至有时无气体产生，主要发酵末端产物为丙酸和乙酸。总反应式如式（4-16）所示：

1.5葡萄糖2丙酸+乙酸+CO₂+6ATP　　（4-16）

在废水厌氧处理过程中，含氮有机化合物（如明胶、酵母膏、肉膏等）和难降解碳水化合物（如纤维素）常呈丙酸型发酵（末端产物与丙酸型发酵类似）。丙酸型发酵在厌氧生物处理过程中不够理想，这是因为末端产物丙酸不易转化为可被产甲烷菌利用的底物，易出现丙酸积累。当丙酸出现大量的积累，会导致厌氧反应器内的pH值的大幅度下降，从而因产甲烷菌失去活性而导致厌氧反应器的运行失败。

② 丁酸发酵。丁酸的循环机制起着重要作用，一方面使糖酵解途径及产乙酸过程中释放的NADH+H⁺通过与丁酸产生相偶联而得以氧化；另一方面还可以减少酸性末端。解糖梭状芽孢杆菌进行此类反应。总反应式如式（4-17）所示：

2.5葡萄糖2丁酸+乙酸+5CO₂+5H₂+8ATP　　（4-17）

尽管如此，当pH值降至4.5以下时，丁酸循环机制被阻断，转为形成中性末端产物的丙酮丁醇发酵。

该发酵类型与废水厌氧生物处理过程中的丁酸型发酵类似，许多研究结果表明，含可溶性碳水化合物（如葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖等）废水的发酵常出现丁酸型发酵，发酵中主要的末端产物为丁酸、乙酸、二氧化碳、氢和及少量丙酸。当运行管理不当时，丙酸含量显著增加，甚至有可能转化为丙酸型发酵。

③ 混合酸发酵。由于在发酵产物中存在许多有机酸，因此称为混合酸发酵。进行该类型发酵的主要是一些肠道细菌，如志贺菌属、埃希菌属等。这些细菌是一些兼性厌氧菌，在有氧情况下进行呼吸，在缺氧情况下进行发酵。

埃希菌由于存在甲酸氢解酶，可将甲酸分解为氢和二氧化碳，因此，大肠杆菌可以产气，而志贺菌等由于不存在甲酸氢解酶，故不能将甲酸分解为氢和二氧化碳，因此不产气。可以通过产酸产气试验将一些不产酸以及产酸不产气的细菌区分开来。

有些细菌如产气肠杆菌在发酵时，除了将一部分丙酮酸按混合酸发酵的类型进行外，大部分丙酮酸先通过两个分子的缩合成为乙酰乳酸，再脱羧为3-羟基丁酮，然后再还原为丁二醇。

3-羟基丁酮在碱性条件下被空气中的氧气氧化为乙二酰。根据乙二酰能与胍基作用生成红色化合物的特点，可以测定3-羟基丁酮的存在，这就是V.P.试验为阴性，而产气肠杆菌V.P.试验为阳性。此外，大肠杆菌由于产酸较多，所以pH值低于4.5，用甲基红作指示剂可显出，而产气肠杆菌的产物丁二醇是中性化合物，因此通过V.P.试验和甲基红试验可对两种细菌进行鉴别。

④ 乙酸发酵　进行乙酸发酵的微生物主要是酵母菌，如酿酒酵母，其发酵葡萄糖的末端产物仅有乙醇和CO₂。

有些厌氧细菌亦可进行乙酸发酵，但其代谢途径和酵母菌不同。例如螺旋体属发酵碳水化合物，在代谢中与梭状芽孢杆菌属类似。发酵葡萄糖生成的主要末端产物为乙酸、乙醇、氢和二氧化碳。螺旋体属为专性或兼性厌氧微生物，存在于废水和活性污泥中。

乙醇型发酵与细菌性乙醇发酵相似，主要终产物为乙酸、乙醇、丁酸、氢、二氧化碳及极少量的丙酸，其试验结果的总反应式如式（4-18）所示：

葡萄糖乙醇+乙酸+2CO₂+2H₂+3ATP　　（4-18）

乙醇型发酵的末端产物极为理想，丙酸产物很少，且乙醇很容易转化为产甲烷菌可利用的底物（乙酸、CO₂和H₂）。

（2）无氧呼吸

进行无氧呼吸的厌氧微生物生活在河、湖、池塘底部淤泥等缺氧环境中，以N、C、S等作为最终电子受体的氧化还原过程，进行有机物的生物氧化。最终产物是N₂、H₂S、CH₄、CO₂、H₂O及能量^［3］。

1）硝酸盐呼吸　硝酸盐呼吸也称异化型硝酸盐还原。缺氧条件下，有些细菌能以有机物为供氢体，以硝酸盐作为最终电子受体，这类细菌称为硝酸盐还原菌。不同的硝酸盐还原菌将N还原的末端产物不同，如N₂（包括N₂O、NO）、NH₃和N。

通过硝酸盐呼吸将N还原为气态N₂（包括N₂O、NO）的过程称为反硝化作用。能够进行反硝化作用的细菌称为反硝化细菌，主要有反硝化假单胞菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、地衣芽孢杆菌、反硝化副球菌等，其中某些菌可兼性好氧。这些细菌可将有机底物彻底氧化为CO₂，同时伴随脱氢反应，如式（4-19）所示：

CH₃COOH+2H₂O+4NAD⁺2CO₂+4NADH+H⁺　　（4-19）

NADH+H⁺经电子传递体系将最终电子受体N还原为N₂，同时伴随能量的产生。因而有式（4-20）：

5CH₃COOH+8N10CO₂+6H₂O+4N₂+8OH^-+能量　　（4-20）

亚硝酸对细菌来说是毒性物质，因此它的积累不利于细菌生长。对于大多数细菌来说，亚硝酸盐还原酶是一个诱导酶，亚硝酸盐的产生将诱导产生亚硝酸盐还原酶，并迅速将亚硝酸盐还原产生末端产物，如反硝化副球菌将N转化为N₂；而大肠埃希菌将N转化为NH₃。对于无亚硝酸盐还原酶合成机制的硝酸盐还原细菌则只能在有限的亚硝酸盐浓度范围内利用硝酸盐。

硝酸盐还原作用给农业生产带来较大的损失。一般情况下，施入水稻田里的氮肥由于硝酸盐还原作用而损失1/2。但是，从自然界物质循环角度考虑，硝酸盐还原作用是有利的。在废水处理中，为降低水中含氮量所采取的生物脱氮法就是基于反硝化作用原理。

2）硫酸盐呼吸　硫酸盐呼吸常称为异化型硫酸盐还原或反硫化作用。参与细菌主要为无芽孢的脱硫弧菌属和形成芽孢的脱硫肠状菌属，均为专性厌氧、化能异养型细菌。大多数硫酸盐还原菌不能利用葡萄糖作为能源，而是利用丙酮酸和乳酸等其他细菌的发酵产物。乳酸和丙酮酸等作为供氢（电子）体，经无NAD⁺参与的电子传递体系将S还原为H₂S。

3）碳酸盐呼吸　碳酸盐呼吸即异化型碳酸盐还原，亦可称作产甲烷作用，过去人们常误称作甲烷发酵。进行碳酸盐还原的细菌称为产甲烷细菌。

产甲烷菌专性厌氧，仅能以甲酸、甲醇、甲胺、乙酸和H₂/CO₂作为底物（供氢体）。产甲烷菌不含N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的肽聚糖，对青霉素（可阻止细胞壁合成）不敏感。因而在产甲烷菌的分离中，可利用这一特性抑制非产甲烷菌的生长，达到分离产甲烷菌的目的。

产甲烷菌除存在于缺氧的沼泽地以及河、湖、池塘的淤泥中外，在反刍动物的瘤胃中也含有。产甲烷菌在废水、污泥厌氧生物处理中起重要作用，底物经发酵细菌转化为乙酸、甲酸、甲醇、甲胺及H₂/CO₂后，在产甲烷菌的厌氧呼吸下生成CH₄和CO₂。在废水厌氧生物处理中常见的产甲烷菌有产甲烷八叠球菌属、产甲烷杆菌属、产甲烷短杆菌属、产甲烷球菌属、产甲烷螺菌属及产甲烷丝菌属等。