第五节 肉品在加热过程中形成的有害物
一、多环芳烃
许多烟熏和糖熏食品中含有多环芳烃类致癌物质,严重危害食用者的健康,使得人们对烟熏食品产生了怀疑。在目前已查出的500多种主要致癌物中,有200多种属于多环芳烃类化合物。
(一)多环芳烃的一般物理化学特性
PAHs主要是由有机物的不完全燃烧产生的。大多数PAHs在常温下呈固态,沸点比相同碳原子数目的正构直链烷烃高。3环以上PAHs大都是无色或淡黄色晶体,个别颜色比较深。因其分子结构对称、偶极距小、分子量大,PAHs通常为非极性物质,在水中溶解度低,且具有高熔点和高沸点的特征。在常温下,PAHs是以气相和固相共存。一般而言,低环PAHs主要存在于气相中,5~6环PAHs则主要凝聚而吸附在颗粒物表面上,介于两者之间的含有3~4个苯环的PAHs以气相和颗粒相共存。1976年美国环保局提出的129种“优先污染物”中,多环芳烃化合物有16种,这16种优先控制的PAHs结构见图1-11,基本情况见表1-1。具有致癌作用的多环芳香烃一般为4~6环的稠环化合物,如苯并(a)蒽、苯并(b)荧恩、3,4-苯并芘等,其中3,4-苯并芘,又称为苯并(a)芘,是多环芳烃类化合物中最具有代表性的强致癌稠环芳烃,是首个被发现的环境化学致癌物,其分布广泛,性质稳定,致癌性强。3,4-苯并芘通常被用来作为多环芳烃类化合物总体污染的标志。
表1-1 美国国家环境保护局优先控制的16种多环芳香烃化合物基本情况
①Kow是正辛醇-水分配系数,越高越不溶于水。
②IARC是International Agency for Research on Cancer的缩写,表示国际癌症研究中心。
图1-11 16种优先控制的PAHs结构
(二)多环芳烃的来源及形成机理
1. 多环芳烃的来源
(1)自然来源 多种陆生植物(如小麦及裸麦幼苗)、多种细菌(如大肠菌等)以及某些水生植物都有合成多环芳烃(包括某些致癌性多环芳烃)的能力。生物体内合成、森林及草原自然起火、火山活动是环境中多环芳烃主要的天然来源。
(2)人为来源
①各类工业锅炉、生活炉灶产生的烟尘,如燃煤和燃油锅炉、火力发电厂锅炉、燃柴炉灶。
②各种生产过程和使用煤焦油的工业过程,如炼焦、石油裂解,煤焦油提炼、柏油铺路等。
③各种人为原因的露天焚烧(包括烧荒)和失火,如垃圾焚烧、森林大火、煤堆失火。
④各种机动车辆排出的尾气。
⑤吸烟和烹调过程中产生的烟雾是室内多环芳烃污染的重要来源。
食品在加工过程中,脂肪、蛋白质和碳水化合物等有机物质的高温(>200℃)受热分解是食品中多环芳烃的主要来源,尤其是脂肪在500~900℃的高温,最有利于多环芳烃的产生,并且产生量随着脂肪含量的增加而大幅增加。
2.不完全燃烧条件下多环芳烃的形成机理
根据Badger等(1959)的假说,熏烟生成(热解)过程中3,4-苯并芘的合成步骤如图1-12所示。首先有机物在高温缺氧条件下裂解产生碳氢自由基结合成乙炔(1),乙炔经聚合作用形成乙烯基乙炔或1,3-丁二烯(2),然后经环化生成乙基苯(3),再进一步结合成丁基苯(4)和四氢化萘(5),最后通过中间体(6)形成3,4-苯并芘(7)。但这并不意味着3,4-苯并芘一定要从两个碳原子的化合物开始,实验已证明,图中任一中间体均可在700℃下裂化生成3,4-苯并芘。发烟时3,4-苯并芘的生成量与烟熏木材的燃烧温度有很密切的关系。一般认为发烟温度在400℃以下时,只形成极微量的3,4-苯并芘,发烟温度在400~1000℃之间时,3,4-苯并芘的生成量随温度的上升急剧增加。
烧烤肉制品中3,4-苯并芘的含量与烤制方式(炭烤、木头烤、电烤等)、原料肉中的脂肪含量、烧烤温度、时间、肉样和火源的距离等因素有关。
图1-12 3,4-苯并芘形成过程
(三)多环芳烃的危害
1.直接致癌作用
3,4-苯并芘对人体健康可造成严重危害,其主要是通过食物或饮水进入机体,在肠道被吸收,进入血液后很快散布至全身。小剂量3,4-苯并芘就有可能引起局部组织癌变。有研究表明,3,4-苯并芘可引起大鼠肝细胞、肺细胞及外周血淋巴细胞 DNA损伤,对皮肤、眼睛、消化道有刺激作用,可以诱发皮肤、肺、消化道和膀胱等癌症,且具有胚胎毒性。
2.间接致癌作用
3,4-苯并芘还是一种间接致癌物,所谓间接致癌物是指在体内需经代谢活化才与大分子化合物结合的致癌物。在此代谢活化过程中,细胞色素酶系P450(简称CYP450)起到了重要作用。
3. 致畸致突变作用
3,4-苯并芘的毒性还远不止上述的致癌性,它还是一种很强的致畸、致突变和内分泌干扰物。3,4-苯并芘对兔、豚鼠、大鼠、鸭、猴等多种动物均能引起胚胎死亡或畸形及仔鼠免疫功能下降。
4. 神经毒性
3,4-苯并芘还具有一定的神经毒性。研究表明,以3,4-苯并芘为代表的PAHs具有一定的神经毒性,其中最为突出的是影响暴露者的学习记忆能力。研究认为,3,4-苯并芘可对神经元产生细胞毒性效应,脂质过氧化可能是细胞活力降低的原因之一。
5. 摄入限量标准
自2002年食品科学委员会提出的食品中PAHs对人体健康的危害后,欧洲委员会第一次对食品中的3,4-苯并芘进行了限量,包括烟熏肉制品和鱼肉制品。欧盟规定烟熏剂中3,4-苯并芘的含量不超过0.03μg/kg,德国对肉制品中3,4-苯并芘的残留限量为1μg/kg,随后,澳大利亚、捷克、瑞士、意大利等国也采用了同样的限量标准。我国食品卫生标准(GB 2762—2005)中规定,熏烤肉制品中3,4-苯并芘的残留量不得超过5μg/kg。
(四)多环芳烃的检测方法
3,4-苯并芘常用的检测方法有GB/T 5009.27—2003《食品中苯并芘的检测》中的荧光分光光度法和行业标准NY/T 1666—2008《肉制品中3,4-苯并芘的测定——高效液相色谱法》,前者要求试样量50g,检出限为1ng/g,该方法的缺点是试剂使用种类较多,且多为有机试剂,测定时间长,检测限较高,灵敏度较差;后者所用试剂较少,测定时间较短,分离效果好,检出限低,适用于烧烤、油炸、烟熏等肉制品中3,4-苯并芘的检测。3,4-苯并芘的检测方法还有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、薄层色谱法、纸层析法等,随着现代检测技术的快速提高,将会出现更加快速、准确、智能化的检测方法,能够更好地进行肉制品中3,4-苯并芘残留的安全检测。
(五)肉制品中多环芳烃产生的影响因素
1. 烧烤方式影响3,4-苯并芘的含量
炭烤、木柴烤、电烤等烤制方式影响烧烤肉制品中3,4-苯并芘的含量。Bonny等(1983)研究了炭、木柴和电烤三种加工方式对香肠中3,4-苯并芘残留量的影响,结果表明,使用电烤方式制作的香肠中3,4-苯并芘的残留量最少,为0.2μg/kg,炭和木柴加工的香肠中3,4-苯并芘的含量分别为0.3μg/kg、54.2μg/kg。Olatunde等(2008)检测了烟熏、烧烤和卤煮肉中多环芳烃的含量,结果表明三种加工方式中3,4-苯并芘的含量分别为6.52μg/kg、7.04μg/kg及0.07μg/kg。在熏制过程中,熏烟中的3,4-苯并芘等有害物质会附着在产品的表层,如熏肉制品表层黑色的焦油中就含有大量的3,4-苯并芘等多环芳烃类化合物。
2. 烧烤温度和时间、肉与火源的距离影响3,4-苯并芘的含量
脂肪在高温(>200℃)热解时可以产生3,4-苯并芘,500~900℃的高温,尤其是在700℃以上,其他有机物质如蛋白质和碳水化合物也会分解产生。食物在烘烤或烟熏过程中若出现烤焦、烤煳或炭化,食物中3,4-苯并芘的含量将明显提高。另外动物食品在烤制过程中滴下的油滴经检测,其中3,4-苯并芘的含量是动物食品本身的10~70倍。Kazerouni等(2001)研究表明,经过高温和低温处理的样品,3,4-苯并芘的含量分别为2.6μg/kg和0.13μg/kg。烧烤时间过长,或被烤焦的产品其含量显著增加。明火烧烤时烤制时间相同,肉样距离火源越近,其3,4-苯并芘残留量越高。
3. 原料肉种类和脂肪含量影响3,4-苯并芘的含量
肉中脂肪含量是影响3,4-苯并芘形成的另一个重要因素,脂肪含量与3,4-苯并芘的残留量呈正相关。Doremire(1979)等研究了牛肉脂肪含量对烤牛肉产品中3,4-苯并芘残留量的影响。结果发现,当脂肪含量从15%增加到40%时,烤牛肉样品中3,4-苯并芘的残留量由16.0μg/kg增加到121.0μg/kg。Chen(2001)指出,烤猪肉中多环芳烃相比牛肉和鸡肉含量多,原因可能是与猪肉中的脂肪含量有关,即脂质和脂质分解产物参与3,4-苯并芘的形成。
二、甲醛
许多生物代谢时可以产生甲醛,而熏肉制品表层的甲醛,则主要是木材或糖类在缺氧状态下不完全燃烧时形成并沉积和渗透在产品中的。甲醛具有一定的抗菌作用,可以一定程度上防止熏肉腐败,同时也给烟熏肉制品带来安全隐患。
(一)甲醛的基本特性
甲醛,又称蚁醛,化学式为HCHO,具有强烈的刺激性气味,溶于水、乙醇、乙醚,低温下呈透明可流动液体,400℃时分解成CO和H2。水溶液的浓度最高可达55%。
(二)食品中甲醛的一般来源
1. 内源甲醛
甲醛是许多生物体的代谢产物。鱼贝类食品、香菇、瓜果、蔬菜中均可检出天然存在的内源甲醛,鳕鱼类中的甲醛含量最高可达200mg /kg。香菇中甲醛是香菇菌酸的分解产物。鲜香菇中甲醛正常范围为4~54mg/kg,烘干后甲醛含量显著增加,一般为21~369mg/kg。
2. 加工过程中产生的甲醛
食品在加工过程中,除一些食物成分受机械、物理因素(光、热、高温、高压)、化学因素(酸、碱、盐、水解及酶解)、生物因素(微生物发酵)等影响,能够自动氧化分解为甲醛等物质外,美拉德反应、Strecker降解反应、糖类的脱水和热解反应均可能使碳-碳键断裂生成甲醛和其他挥发性物质。
发酵食品中的糖和氨基酸发生美拉德反应或某些成分自动氧化产生甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酮等多种羰基化合物;乳制品中乳脂肪的酶解反应,糖、氨基酸等水溶性物质发生的美拉德反应,不饱和脂肪酸在空气中氧的作用下发生氧化、裂解、生成甲醛;环境污染造成的水源污染,及用含氯药剂及臭氧消毒处理的饮用水都会含有不同浓度的甲醛。食品原辅料、环境、容器中也会存在不同浓度的甲醛。因此在食品加工过程中会不可避免地引入甲醛。
肉制品中甲醛主要来源于冷冻或熟化过程中脂肪组织的氧化,水溶性低分子化合物加热时发生非酶褐变反应和蛋白质、肽、氨基酸、糖的热分解反应中一次及二次生成物。干香肠、火腿、熏肉用木材熏制,木材在缺氧状态下干馏会生成甲醇,甲醇进一步氧化成甲醛,吸附聚集在产品表面;除烟熏成分中含有甲醛外,一部分物质由于熏制熟化过程中脂质的水解、氧化或脂肪酶的作用,最后也生成羰基物质和甲醛。
糖熏肉制品表面色泽好,有糖熏的独特气味,但糖熏过程中糖的不完全燃烧也会产生甲醛并沉积到鸡皮和鸡肉中。
(三)甲醛的危害
甲醛是一种高毒性物质,具有致癌、致畸性,还会导致新生儿染色体异常、白血病,以及引起青少年记忆力和智力的下降等严重后果。甲醛的危害主要表现在三大方面:刺激作用、毒性作用、致癌及致突变作用。
1. 刺激作用
相关研究表明,甲醛对人体免疫系统和呼吸道均有较大影响。甲醛通过使细胞中的蛋白质凝固变性,抑制细胞机能,其蒸汽及其溶液对鼻腔、眼睛、呼吸系统黏膜和皮肤有强烈的刺激作用,甲醛溶液滴入眼睛会造成不可逆转的永久损伤,甚至引发失明。甲醛对呼吸系统的刺激会引起鼻敏感、咳嗽、打喷嚏,引发呼吸道炎症及肺功能损害等。由于其高度的水溶性,甲醛极易被鼻、鼻窦以及气管、支气管黏膜中富含水分的黏液吸收,并与其中的蛋白质、多糖物质结合,破坏黏液及纤毛的运输机制,表现出明显的局部刺激症状。
2. 毒性作用
人们通过皮肤或者呼吸道与甲醛接触而受到毒害。甲醛引起的中毒可以分为急性中毒和慢性中毒。其中急性中毒的症状为流泪、咳嗽、恶心、呕吐、头痛、昏厥、肺气肿以及肾损害等。慢性中毒的症状表现为视力下降、免疫力下降、皮肤变硬、手指变色以及智力发育产生障碍等。
甲醛的基因遗传毒性已在人工培养的哺乳动物细胞的体内实验与动物实验被证实。吸入甲醛将导致机体的免疫功能受损,并出现不同症状。甲醛对小鼠的动物实验表明,甲醛对小鼠淋巴组织具有抑制作用。不同剂量的甲醛均能引起小鼠脾脏和胸腺重量的下降,而免疫器官重量的变化是判定机体损伤的一项主要生物指标。低剂量甲醛能引起细胞轻度的脂质过氧化,而不影响其功能;但高剂量的甲醛可引起蛋白质、DNA等大分子损伤,最终导致细胞坏死。另据报道,工人接触高浓度的甲醛除了抑制细胞免疫,同时会增强体液免疫的异常性。
甲醛通过危害人类的中枢神经系统,引起人的神经行为的改变,导致神经系统紊乱甚至变性坏死。研究显示,甲醛可通过降低细胞能量代谢抑制神经元正常生理活动,进而导致整个神经系统功能的损伤。
3.致癌及致突变作用
甲醛与人类肿瘤之间的因果关系已经引起了人们的广泛关注。动物实验研究发现,接触甲醛与口腔癌和鼻咽癌的发生相关性最大,另外接触甲醛可以增加白血病、肺癌及脑癌的发病率。甲醛致癌的机理除了与甲醛会导致基因的突变和染色体的损伤有关之外,更为重要的是甲醛可导致淋巴细胞损伤或功能失调,以及引起免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显降低,从而引起机体对突变细胞免疫监视功能的障碍。
(四)甲醛的限量
通常情况下,当空气中甲醛含量为0.8×10-6mg/m3时,通过气味即可感知到甲醛的存在;环境空气中甲醛含量大于0.05mg/m3即对人体产生危害;当甲醛含量为0.05~0.5mg/m3时,眼睛即会受到刺激。美国环境保护署公布的甲醛每天最大参考剂量(RfD)为0.2mg/(kg·d),当人们接触环境中甲醛含量超过RfD时,就会对人体健康带来危害。我国规定,车间空气中的甲醛含量必须小于0.5mg/m3,地面水中的甲醛含量必须小于0.5mg/m3,居民区范围内空气中甲醛含量必须小于0.05mg/m3。我国《室内空气质量标准》规定室内空气中甲醛的限值为0.08mg/m3;《乘用车内空气质量评价指南》规定车内甲醛的浓度标准不超过0.10mg/m3。当人们在甲醛浓度达到50~100mg/m3的环境下暴露5~10min时,会造成很严重的伤害。
所以在甲醛的工业生产与消费的过程中,要做好防范工作:降低环境空气中甲醛的浓度,避免甲醛与皮肤的直接接触,避免甲醛蒸汽经由呼吸道进入体内等。
(五)甲醛的测定方法
啤酒、水产品等产品中的甲醛测定方法已有很多研究,但是关于肉制品中甲醛检测方法的研究却很罕见。若将现有的水产品中甲醛含量检测的方法直接运用到肉制品的检测中去,会造成样品提取液浑浊,进而会对方法的回收率、测定的准确性造成不利的影响。因此建立一套稳定可行的肉制品中甲醛含量的测定方法已刻不容缓。
1. 分光光度法
分光光度法测定的原理是通过甲醛与某种化合物反应,进而产生某种带有颜色的物质,然后在特定波长下进行测定。
笔者采用改良的水蒸气蒸馏装置(图1-13)测定了不同产地、不同种类烟熏腊肉中的甲醛含量。
图1-13 改良的水蒸气蒸馏装置
取2g粉碎后的熏肉样品,加蒸馏水定容至10mL,用分散机在5000r/min转速下分散20s。将分散均匀的肉糊加入到水蒸气蒸馏器中,再加入3mL磷酸溶液后立即通水蒸气蒸馏,接收管下口事先插入盛有10mL蒸馏水且置冰浴的接收装置中,蒸馏50min后将馏出液稀释到200mL,同法蒸馏空白。
吸取10mL馏出液,于25mL具塞比色管中加入2.0mL乙酰丙酮溶液,摇匀,在沸水中加热10min,取出冷却,倒入1cm比色皿中,在波长415nm处,以空白溶液为参比测量吸光度。
不同熏肉制品中甲醛的含量见表1-2。
表1-2 不同熏肉制品中甲醛的含量
所检测的熏肉制品中甲醛含量均较高,最高甚至达到了124.31910mg/kg。应用改良的水蒸气蒸馏,分光光度法测定,操作简单,测定迅速。此法检出限为1.0mg/kg,定量限为3.0mg/kg,回收率85%以上,准确率较高。
2.气质联用色谱法(GC-MS)
气相色谱法(GC)有顶空气相色谱及衍生化气相色谱,顶空法只对甲醛浓度较高的样品适用,而衍生法则可检测低浓度甚至痕量的甲醛。
用气质联用色谱法测定市售5个公司的腊肉中的甲醛含量:采用0.3mL 2,4-二硝基苯肼(醛类物质可在酸性介质中与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙),衍生化温度60℃,衍生化时间30min,用二氯甲烷萃取熏肉表层中的甲醛,萃取2次;用DB-5弹性石英毛细管柱进行检测。条件如下:柱温60℃;进样口温度260℃;程序升温以10℃/min升温速度升至150℃,然后升温至260℃,恒温5min;载气He;柱前压40kPa;分流比10∶1;溶剂延迟5min;进样量1μL。电子电离源;电子能量70eV;四极杆温度150℃;离子源温度230℃;电子倍增器电压1.02kV;接口温度250℃;选择离子检测m/z 79、210。
2,4-二硝基苯腙质谱图见图1-14,总离子流和特征离子色谱图见图1-15。
图1-14 2,4-二硝基苯腙质谱图
图1-15 总离子流和特征离子色谱图
1—总离子流图;2—m/z 79;3—m/z 210
不同样品腊肉中甲醛的含量见表1-3。
表1-3 不同样品腊肉中甲醛的含量
市售的5种腊肉表层与内部均存在着一定量的甲醛,最高甚至达到了254.52mg/kg。
在不含甲醛的样品本底中添加一定量的甲醛标准进行实验,最低检测质量浓度0.01mg/L,以取样量2.0g计,本法对样品的检出限为0.50mg/kg。该方法简便快速、结果准确、灵敏度高,可作为测定烟熏肉制品中甲醛的有效方法。
3. 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法直接测定甲醛含量灵敏度低,对于低浓度甲醛的测定多采用甲醛与衍生剂2,4-二硝基苯肼(DNPH)在一定温度条件下,反应生成2,4-二硝基苯腙,提取液经液相色谱分离,二极管阵列检测器或紫外检测器检测,外标法定量测定。
有研究者用高效液相色谱(HP1100)带紫外检测器(DAD),Hypersil ODS-C18色谱柱,甲醇∶水(60∶40)为流动相,流速0.5mL/min,338nm波长下测定18份水产品中的甲醛含量,17份中甲醛含量为0.45~192.94mg/kg,1份样品甲醛含量低于0.20mg/kg。此法的检出限为7.20μg/L,相当于样品中甲醛的检出限为0.20mg/kg。甲醛高效液相色谱法吸收图谱见图1-16。
图1-16 甲醛高效液相色谱法吸收图谱
应用高效液相色谱法测定甲醛含量,重复性好,专一性强,是一种灵敏、准确的甲醛含量测定方法。目前标准SC/T 3025—2006、GB/T 21126—2007、SN /T 1547—2011中均采用此方法。
三、杂环胺
杂环胺(heterocyclic amines,HCAs)是在肉品热加工过程中由于蛋白质、氨基酸热解而产生的一类杂环类化合物,这些杂环化合物有些具有芳香性,所以又称杂环芳香胺。至今已经发现有30多种杂环胺类化合物,其中有些杂环胺具有致癌、致突变作用。
对于肉中致癌致突变物质的报道最早可追溯到1939年,当时瑞典Lund大学教授Widmark发现用烤马肉的提取物涂布于小鼠的背部可以诱发乳腺肿瘤,但这一重要发现在当时并没有引起人们的重视。20世纪70年代,人们建立了以Ames试验为代表的一系列有效方法,用于致癌、致畸、致突变性物质的筛选。1977年,日本科学家发现,以明火或炭火炙烤的鱼和牛肉的烤焦表面及烟气具有强烈的致突变性;紧接着,Commoner(1978)在小于200℃的正常家庭烹调条件下的牛肉饼和牛肉提取物中也同样检出强烈的致突变性。由此,人们对氨基酸、蛋白质热解产物产生了浓厚的研究兴趣,至今已经发现了30多种杂环胺类化合物。
目前许多国家对杂环胺的各个方面展开了广泛研究,如生物毒性的监测、提取鉴定方法的优化、在不同食品中含量的测定、不同加工方式和条件的影响、生物利用效率和代谢方式等,从而为评估其对人类健康的影响提供依据和指导。我国对杂环胺的研究始于20世纪80年代后期,至今仍比较少。随着人民生活水平的不断提高和对自身健康的广泛关注,食品安全问题已在全球范围内掀起了一股热潮,而加工肉制品中的杂环胺更已成为这股热潮中的焦点。
(一)杂环胺的发现
杂环胺源于日本科学家Sugimura Takashi在20世纪70年代后期一个假日期间的偶然发现。当他的妻子在厨房烤鱼时,烟气引起了这位环境致癌物研究专家的注意。他将烤鱼的烟气与含有许多致突变物的烟草烟气联系起来,提出了烤鱼烟气中是否同样存在致突变物的疑问。带着这样的疑问,他在实验室中用玻璃纤维滤膜收集烤鱼烟气并将其溶解在二甲基亚砜中,结果发现其对鼠伤寒沙门菌TA98菌株具有强烈的致突变性。紧接着,烤鱼和烤肉的烧焦部分也被检测出相同的致突变性。通过加热色氨酸、谷氨酸等氨基酸和大豆球蛋白等其他蛋白质,2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AαC)、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-1)和2-氨基-6-甲基二吡啶并[1,2-α:3',2'-d]咪唑(Glu-P-1)等杂环胺被从中分离出来并进行结构鉴定。1980年后,研究者又陆续从炸牛肉、烤沙丁鱼等加工肉制品中分离出了IQ、MeIQ、IQx、PhIP等杂环胺。Harman和Norharman最初是从蒺藜科多年生草本植物骆驼蓬分离出来的,在骆驼蓬碱、烟草烟气及加工肉制品中均有分布;其形成与色氨酸的热解密切相关。
(二)杂环胺的结构与特性
杂环胺通常具有平面结构,其结构中含有2~5个(通常为3个)缩合芳香环,环中包含至少一个氮原子,环外通常有一个氨基和1~4个甲基作为取代基团。从化学结构上来看,杂环胺可以进一步分类为氨基咪唑氮杂芳烃(aminoimidazo azaren,AIA)和氨基咔啉(amino-carbolin congener)两大类。
1.氨基咪唑氮杂芳烃
AIA包括喹啉类(IQ、MeIQ)、喹喔类(IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx)和吡啶类(PhIP)与呋喃吡啶类(IFP)。AIA一般形成于100~300℃,由肉中的氨基酸、肌酸、肌酸酐和己糖生成。AIA均含有咪唑环,其上的α位置有一个氨基,在体内可以转化成N-羟基化合物而具有致癌、致突变活性。由于AIA上的氨基均能耐受2mmol/L的亚硝酸钠的重氮化处理,与最早发现的IQ性质类似,并且其形成温度较低,因此AIA又被称为IQ型杂环胺。
2.氨基咔啉
氨基咔啉包括α-咔啉(AαC、MeAαC)、β-咔啉(Norharman、Harman)、γ-咔啉(Trp-P-1、Trp-P-2)和ζ-咔啉(Glu-P-1、Glu-P-2),一般是在加热温度高于300℃,由氨基酸和蛋白质的热解反应产生。由于氨基咔啉类环上的氨基不能耐受2mmol/L的亚硝酸钠的重氮化处理,在处理时氨基脱落转变成为C-羟基,失去致癌、致突变活性,因此称为非IQ型杂环胺。常见杂环胺的化学名称、结构式以及性质见表1-4。
表1-4 杂环胺结构性质表
(三)杂环胺的生成机制
如前所述,杂环胺从化学结构上可分为氨基咪唑氮杂芳烃类和氨基咔啉类,这两类化合物的生成方式各不相同。
1. IQ型杂环胺的生成机制
IQ型杂环胺的研究较多,形成机理也更为清晰。1983年,Jägerstad 等在拉斯维加斯举办的第二届世界美拉德大会上就提出了IQ型杂环胺的形成假说:三种肌肉中天然存在的前体物质,即肌酸、特定氨基酸和糖,参与了杂环胺的形成过程。肌酸在温度高于100℃时通过自发的环化和脱水而形成2-氨基咪唑部分,而喹啉或者喹喔啉部分则通过吡嗪或者吡啶和乙醛缩合而形成。这个假说已经在部分IQ型杂环胺的合成和鉴定中得到验证。
关于IQ型杂环胺中的PhIP形成机制的报道较多,肌酸与亮氨酸、异亮氨酸和酪氨酸加热可以形成PhIP;肌酐与苯丙氨酸、葡萄糖加热也可以形成PhIP。有研究者通过同位素标记证明,来自于苯丙氨酸的苯环、3-C原子和氨基上的N原子都参与了PhIP的形成。目前多数学者比较认可的PhIP形成机制是,苯丙氨酸的Strecker降解产物苯乙醛与肌酸酐反应形成羟醛加合物,羟醛加合物通过脱水形成羟醛缩合物,最后羟醛缩合物与一个含有氨基的化合物经过包括环化和裂解在内的一系列反应而形成PhIP。
2. 氨基咔啉类杂环胺的生成机制
对于氨基咔啉类杂环胺的形成机制目前研究较少,通常认为这类杂环胺是在300℃以上的高温下由蛋白质或者氨基酸直接热解而来。的确,AαC和MeAαC最初来源于大豆球蛋白的热解,Trp-P-1和Trp-P-2以及Glu-P-1和Glu-P-2则分别来源于色氨酸和谷氨酸的热解,但Skog(2000)等发现肉汁模型在200℃加热30 min下就能产生Harman、Norharman、AαC和微量的 Trp-P-1 、Trp-P-2,同时,许多文献报道在200℃以下加工条件下诸多肉类可产生含量水平较高的Norharman和Harman。因此300℃不是形成氨基咔啉类杂环胺所必须达到的温度,氨基咔啉类杂环胺也可能并非由简单的蛋白质或者氨基酸裂解而成。
3.杂环胺的生物毒性
(1)杂环胺的致突变性 Ames试验显示杂环胺具有很强的致突变能力。除诱导细菌突变外,它还可在哺乳动物体内经过代谢活化产生致突变性,引起DNA损伤。在人体中,杂环胺通过细胞色素氧化酶P450IA2激活而形成N-羟基衍生物,N-羟基衍生物在肝脏以及其他靶器官中经N-乙酰转移酶NAT2作用而形成芳胺基-DNA加合物,导致DNA损伤。
(2)杂环胺对试验动物的致癌性 大多数杂环胺对啮齿动物均有致癌性,可诱发多种部位的肿瘤,但主要靶器官是肝脏。其中,Glu-P-1、Glu-P-2、AαC和MeAαC均能诱导肩胛间及腹腔中褐色脂肪组织的血管内皮肉瘤,而Glu-P-1、Glu-P-2、MeIQx和PhIP则能诱导大鼠结肠腺癌。Rohrmann等(2009)发现,如果杂环胺的每天摄入量超过41.4ng,患直肠癌的风险将大大提高。Archer(2000)通过试验证明,长期摄入杂环胺会诱发直肠癌、胸腺癌和前列腺癌。鉴于众多研究结果,1993年国际癌症研究中心(IARC)将IQ归类为“对人类很可疑致癌物(2A级)”,将MeIQ、MeIQx、PhIP、AαC、MeAαC、Trp-P-1、Trp-P-2和Glu-P-1归类为“潜在致癌物(2B级)”。
(四)杂环胺的测定方法
每克肉制品的杂环胺含量通常在纳克量级,并且由于肉制品基质的复杂性,其提取与检测手段一直是研究的热点与难点。
1. 杂环胺的提取方法
肉制品基质成分复杂,包括蛋白质、脂肪等多种物质,这些物质的存在严重干扰了杂环胺的分离提取。因此,液液萃取、固相萃取、超临界流体萃取等许多分离富集杂环胺的方法被应用于样品的前处理。由Gross等于1992提出的样品前处理方法已经成为经典,近年来肉制品中杂环胺的提取方法大多是在此方法基础上稍做修改。
经典的样品前处理方法可概括如下。第1步,沉淀蛋白,采用氢氧化钠溶液溶解、均质样品,并通过离心或过滤去除蛋白质;第2步,液液萃取与使用吸附剂萃取结合使用,通常使用硅藻土作为吸附剂,水相以薄层的形式在化学惰性基质上分散,用二氯甲烷将杂环胺洗脱下来;第3步,两个固相萃取过程,使用丙基磺酸柱(PRS)以及反相C18柱来实现;第4步,通过氮气吹干洗脱液后用甲醇定量。
2. 杂环胺的检测方法
表1-5总结了加工肉制品中杂环胺检测的常用方法。其中,高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)是定性定量分析杂环胺的最常规的方法。通过比较实际样品与标准样品保留时间可初步对目标物进行定性,而通过比对二极管阵列检测器产生的特征紫外吸收光谱,可对样品中的目标物进行进一步定量。由于荧光检测器与紫外检测器相比具有更高的灵敏度,因此对于具有荧光的非极性杂环胺,通常采用两种检测器串联的方法以排除干扰,提高定性分析的准确性。Y.Yao等(2013)通过乙酸乙酯提取酱牛肉中的杂环胺,经过固相萃取操作后上样于装配有紫外和荧光检测器的高效液相色谱仪,结果表明,12种杂环胺的检出限(LOD)在0.01~2.97ng/g,加标回收率在68.69%~101.81%,可以很好地满足酱牛肉中杂环胺检测的要求。
表1-5 加工肉制品中杂环胺检测和定量杂环胺的方法比较
酶联免疫吸附法(ELISA)、气相色谱法(GC)和气相色谱串联质谱法(GC-MS)也可用于杂环胺的检测。但是,由于大部分杂环胺难以挥发,只有少数杂环胺经复杂的衍生化后才能在气相色谱仪中进行检测;对于ELISA法只有PhIP等少数杂环胺的单克隆抗体被合成,并没有实现商品化,因此这些方法的应用范围较小。
近年来迅速发展的液相色谱串联质谱(LC-MS)技术,很好地结合了色谱良好分离能力和质谱的高灵敏度和高选择性,是目前检测肉制品中杂环胺的最佳方法。GB 5009.243—2016用氢氧化钠/甲醇提取肉样中杂环胺,经固相萃取柱净化后用液相色谱串联质谱检测5种杂环胺,该方法检出限低,5种杂环胺检出限在0.1~0.3ng/g,不足之处是LC-MS需要繁杂昂贵的仪器,许多实验室达不到要求,因此也在一定程度上限制了其应用范围。
随着超高效液相色谱(UPLC)这种强有力的分离技术的发展,超高效液相色谱串联二级质谱(UPLC-MS-MS)也被应用于杂环胺的检测。UPLC借助于传统的HPLC的理论和方法,通过采用1~2μm的细粒径填料和细内径色谱柱而获得很高的柱效。UPLC不仅缩短了检测时间,而且相比传统的HPLC-MS,其检测限也降低了10倍。Barceló-Barrachina等(2006)采用超高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(UPLC-ESI-MS-MS)技术分析复杂食品体系中的杂环胺含量,仅在2min内就完成了16种杂环胺的分离和分析。
四、胆固醇氧化物
胆固醇经过光、热、氧等条件的作用,自身发生一系列氧化反应,最终能形成多种氧化产物,统称为胆固醇氧化物(cholesterol oxidation products, COPs)。目前研究表明,COPs可能有70余种,但大多数由于自身极不稳定,因此并不常见。食品中常见的COPs有7-酮基胆固醇、7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5α,6α-环氧化胆固醇、5β,6β-环氧化胆固醇、胆甾烷-3β,5α,6β-三醇、20-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇等。
(一)胆固醇及其氧化物的结构与性质
1. 胆固醇的结构与性质
胆固醇又称胆甾醇,是一种环戊烷多氢菲的衍生物,由甾体部分和一条长的侧链组成,含有不饱和键(图1-17)。早在18世纪人们已从胆石中发现了胆固醇,1816年化学家本歇尔将这种具脂类性质的物质命名为胆固醇。
图1-17 胆固醇结构式
一般,脂类物质主要分为两大类。一类叫脂肪(主要是甘油三酯),是人体内含量最多的脂类,是体内的一种主要能量来源;另一类叫类脂,是生物膜的基本成分,约占体重的5%,除包括磷脂、糖脂外,还有很重要的一种叫胆固醇。胆固醇溶解性与脂肪类似,不溶于水,易溶于乙醚、氯仿等溶剂。
胆固醇广泛存在于动物体内,尤以脑及神经组织中最为丰富,在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分,占质膜脂类的20%以上。血浆中的脂蛋白也富含胆固醇,其中大部分与长链脂肪酸构成胆固醇酯,仅有10%不到的胆固醇是以游离态存在的。胆固醇虽然存在于动物性食物之中,但是不同的动物以及动物的不同部位,胆固醇的含量很不一致。
2. 胆固醇氧化物的结构与性质
食品中常见的几种胆固醇氧化物结构如图1-18所示。
在常温下,大多数胆固醇氧化物为白色粉末固体,沸点均超过300℃,在水中的溶解度不是很大,但能够溶于正己烷、丙酮等有机溶剂中,也具有易溶于脂肪的特性。在通常情况下,大多数胆固醇氧化物较为稳定,如果是处于中性和碱性环境中,不太容易分解,然而在有氧、加热等特定条件下也能发生加成等反应,转变为其他胆固醇氧化物。
图1-18 常见的胆固醇氧化物
(二)胆固醇氧化物形成机理
1.自由基机制
胆固醇分子含有一个双键,因此容易在氧自由基或其他自由基作用下发生氧化反应。在动物组织细胞中,胆固醇是质膜的重要组成成分,它嵌于磷脂双分子层之间,其分子的取向与邻近的磷脂分子的脂肪酸平行。细胞膜含有丰富的磷脂,因此,在氧化过程中,细胞膜中磷脂的不饱和脂肪酸氧化产生自由基,胆固醇通过自由基机制发生自动氧化。Smith(1981)推测食品或生物系统中胆固醇氧化可分为分子间和分子内两种形式。在分子间氧化过程中,胆固醇分子中的氢是由细胞膜上与之相邻的多不饱和脂肪酸氧化产生的过氧自由基或氧自由基时所提供的。在分子内氧化过程中,氧化的脂肪酰基部分攻击同一胆固醇酯分子中的胆固醇基部分(图1-19)。
图1-19 胆固醇分子内氧化过程
胆固醇酯自动氧化中涉及的自由基反应与胆固醇相同,但两者的氧化速率存在显著差异。胆固醇在碱溶液中的氧化速率显著快于胆固醇酯,但在空气中或溶解于油中加热时,胆固醇酯的氧化速率更快。
Osada等(1993)研究发现,胆固醇在不添加甘油三酯的情况下于100℃加热24h,几乎不产生胆固醇氧化物,但当它分别与不同饱和度的甘油三酯混合加热时,发生了不同程度的氧化。当胆固醇与不饱和度低的脂肪混合加热时,如硬脂酸甘油酯、牛油等,经过长时间加热才产生胆固醇氧化物;而多不饱和脂肪酸酯存在时,胆固醇的氧化速率明显加快。因此,胆固醇与不饱和度越高的脂肪共存,越容易发生自动氧化反应。其中,检测到的胆固醇氧化物主要是7-酮基胆固醇、5β-环氧化胆固醇、5α-环氧化胆固醇,而7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇和胆甾烷三醇含量很低。
2.胆固醇氧化的路径
Smith(1987)提出的食品中胆固醇氧化的路径已被普遍接受(图1-20)。启动氧化时,其C7位上脱去一个氢,再加上氧后形成了差向异构体:3β-羟胆固醇基-5-烯-7α-氢过氧化物和3β-羟胆固醇基-5-烯-7β-氢过氧化物。脱氢也可能发生在C20和C25位置上,
图1-20 胆固醇氧化路径
导致形成3β-羟胆固醇基-5-烯-20α-氢过氧化物和3β-羟胆固醇基-5-烯-25-氢过氧化物。上述变化所形成的氢过氧化物随后转变为一系列不同的化合物,食品中常见的胆固醇氧化物有8种,包括7-酮基胆固醇、7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5α,6α-环氧化胆固醇、5β,6β-环氧化胆固醇、胆甾烷-3β,5α,6β-三醇、20-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇。在分析、处理等过程中,某些胆固醇氧化物之间会相互转化。其中,环氧化胆固醇水解可形成胆甾烷-3β,5α,6β-三醇,7α(β)-羟基胆固醇脱氢形成7-酮基胆固醇。7-酮基胆固醇似乎是一种相当稳定的产物。
(三)胆固醇氧化物的有害作用
医学研究结果表明,食源性胆固醇氧化物会对健康造成一定损害,血液中胆固醇氧化物浓度的增加是动脉粥状硬化的早期预警,并可能进一步导致血栓的形成和中风。大多数调查报告显示,胆固醇氧化物还是强效的细胞死亡诱导剂,会造成细胞凋亡或胀亡,细胞死亡失衡,将会导致许多疾病,特别是癌症的发生。除此之外,也有研究表明胆固醇氧化物会造成其他疾病的发生,如阿尔茨海默症、帕金森症、多发性硬化症等神经障碍。
1.致动脉粥样硬化
动脉粥样硬化的发生与胆固醇及其氧化物有直接的关系。1913年,Anitschkow首次使用溶解在植物油中纯胆固醇来喂养兔子,发现会导致兔子动脉粥样硬化。1969年,Kritchevsky等分别用含结晶胆固醇和无定型胆固醇的饲料喂养家兔,结果发现无定型胆固醇最易导致动脉粥样硬化的发生,后来证实这些无定型胆固醇中含有胆固醇氧化物。1996年,Brooks等报道了人动脉粥样斑块内含有胆固醇氧化物。Berliner等发现胆固醇氧化物能快速地在组织中聚集,尤其是动脉壁中。1999年,Garcia-Cruset等发现动脉粥样斑块中7-酮基胆固醇和7β-羟基胆固醇含量很高。20世纪90年代以来,对低密度脂蛋白,特别是对氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化关系的深入研究,发现氧化型低密度脂蛋白中含有大量的胆固醇氧化物,且其毒性主要来自胆固醇氧化物。此外,大量实验表明,胆固醇氧化物对动脉粥样硬化形成有关因素(炎症、氧化应激、细胞凋亡)具有促进作用。
血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的启动环节。Peng等(1985)研究发现,25-羟基胆固醇和胆甾烷-3β,5α,6β-三醇会损害家兔血管内皮细胞。羟基化的胆固醇是胆固醇合成限速酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂,因此会抑制胆固醇的生物合成,造成细胞膜功能障碍而导致细胞死亡,细胞死亡使脂质积聚在动脉内膜上,久了容易形成血栓,最终导致动脉粥样硬化。实验证明,胆甾烷三醇可引起90%的血管内皮细胞损伤,25-羟基胆固醇可引起67%的血管内皮细胞损伤。
泡沫细胞堆积形成脂质条纹乃至脂质斑块是动脉粥样硬化形成的关键环节。有研究者在小鼠实验中发现,一些胆固醇氧化物(7-酮基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5β,6β-环氧化胆固醇)能够激活巨噬细胞NADPH氧化酶,促进花生四烯酸释放和超氧阴离子产生,这会导致巨噬细胞介导的低密度脂蛋白氧化增加,从而造成更多泡沫细胞堆积。
2.细胞毒性
研究表明,7-酮基胆固醇、7β-羟基胆固醇等会诱导不同类型的细胞发生细胞凋亡,而25-羟基胆固醇的细胞毒性强弱取决于细胞类型。事实上,一些促进细胞凋亡的胆固醇氧化物会改变生物膜特性和参与信号转导的脂筏的组成,其中一些还可引起细胞内钙振荡,从而影响细胞的正常生理功能。当胆固醇浓度过高时,会引起细胞胀亡,这是一种表现为细胞肿胀和核溶解的细胞损伤过程,细胞胀亡在肿瘤发生、发展过程中具有重要作用。
在不同类型的细胞体外试验中发现,7-酮基胆固醇、7β-羟基胆固醇、5α,6α-环氧化胆固醇、5β,6β-环氧化胆固醇、25-羟基胆固醇表现出强烈的氧化作用,有时会引发复杂的细胞凋亡程序。另外,有研究者用含有胆甾烷-3β,5α,6β-三醇的饲料饲喂大鼠,发现其血管平滑肌细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性受到了抑制,并且发生细胞凋亡。
细胞间缝隙连接在细胞间物质交换、信息传递以及在组织内环境的稳定中起着非常重要的作用,它的功能异常被认为是导致肿瘤发生化学物质毒性作用表现的关键一环。研究发现7-羟基胆固醇、22-羟基胆固醇以及25-羟基胆固醇显著地抑制细胞间的信息传递,其中以后者的作用最为明显。研究表明纯化后的胆固醇氧化物在80μg/mL浓度下对大鼠肝细胞表现出显著毒性作用。
3.神经毒性
阿尔茨海默症是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病,特点是大脑中淀粉样蛋白沉积和神经元广泛丢失导致的突触数量减少。目前,关于胆固醇氧化物在阿尔茨海默症发生过程中的作用是有争议的。其中,25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇可能与该疾病的发生有关。
帕金森病是一种以多巴胺能神经元丧失和细胞内路易小体存在为特征的渐进性神经系统疾病,一些因素如线粒体功能障碍、细胞凋亡可能是诱发本病的主要原因。研究表明,胆固醇氧化物与α-突触核蛋白(在路易小体聚集的主要蛋白)之间有一定联系,Bosco(2006)发现具有路易小体的患者大脑皮层中的胆固醇氧化物代谢产物比同年龄的对照组更高。
多发性硬化症的特点是脱髓鞘和轴突的损失,这是一种中性神经系统免疫性疾病,可能与胆固醇氧化物有密不可分的联系。
(四)胆固醇氧化物的测定方法
1.脂质提取
在食品中,胆固醇氧化物溶解在脂类物质中,故提取胆固醇氧化物须先提取与之相溶的脂溶性物质。脂质在生物基质中主要以两种形式存在:一是以液滴形式存在于储藏组织;二是细胞膜的组成部分。但任何一种形式下,胆固醇与脂质不仅彼此密切结合,还与非脂质(如蛋白质等)通过疏水作用、范德华力、氢键和静电作用力结合在一起。因此,需要采用合适的方法将组织中的脂溶性化合物提取出来,其中提取溶剂的选择尤为重要,需要既能够溶解脂类物质,又能够破坏脂质与其他组织基质之间的相互作用力。所以单一的非极性有机溶剂(如正己烷)的使用是不合适的,为了满足这一要求,必须采用适当极性的溶剂或混合物。
在一些研究报道中,使用最频繁的方法是以2种或者3种溶剂以不同的比例混合来提取脂质,这样可以充分提取不同脂类物质,同时将其他非脂类物质去除,避免了提取液基质的复杂性。其中,甲醇-氯仿体系经常被用于胆固醇氧化物的提取。
2.净化
胆固醇氧化物在提取物中是痕量级别,所提取脂类物质中含有甘油三酯、酯化游离甾醇、游离脂肪酸等,所以需要对提取的脂类物质进行净化操作。一个有效的净化方法应该能够去除大部分非待测物质,并且不引入新的杂质,使胆固醇氧化物得到富集。皂化和固相萃取法是常用的净化方法。
皂化在胆固醇氧化物分析测定中起着两个重要的作用。首先,它能通过水解反应将甘油酯转化为水溶性脂肪酸盐和游离甘油,从而去除脂质提取物中占主导地位的甘油酯。其次,它能够水解胆固醇酯。在皂化过程中,一般将脂质提取物加入KOH或NaOH的甲醇或乙醇溶液中反应一段时间,然后通过液-液萃取法将未被皂化部分提取出来。皂化温度和碱溶液浓度是两个关键参数,选择不当会造成某些胆固醇氧化物的分解。目前多采用冷皂化,即在室温或略高于室温下进行皂化,皂化反应多在15h以上。
目前,许多研究者为了避免胆固醇氧化物的分解和转化,采用固相萃取法取代皂化步骤,使胆固醇氧化物得到分离和富集。相比于皂化法,固相萃取法具有更快速、温和的优势。硅胶柱和氨基柱常被用于胆固醇氧化物的净化,这两款都为正相柱。脂质提取物中,胆固醇酯和甘油三酯极性最弱,磷脂极性最强,而胆固醇及其氧化产物极性处于两者之间。因此,根据待测物质与杂质极性的差异,通常逐步增强洗脱溶剂的极性以达到分离效果。较常用的方法是将脂质提取物加入固相萃取柱中,首先选用非极性溶剂洗脱胆固醇酯和甘油三酯,然后再用少量中极性溶剂洗脱胆固醇氧化物,而磷脂由于极性最强被保留在柱上。
有研究表明,在固相萃取之前采用皂化步骤,可避免造成测得胆固醇氧化物含量与实际值相比偏少的情况。已知胆固醇酯的氧化速率比胆固醇更快,可能有部分氧化产物以胆固醇酯的形式存在,因此需要进行皂化反应,将这部分氧化产物分离出来,若直接进行固相萃取,这部分物质将被去除。
3.衍生化
胆固醇氧化物具有高沸点、双性基团、化学不稳定性的特点,故色谱分析前通常需要进行衍生化反应,改变其物理性状,有利于色谱分析时分离度的改善和检测灵敏度的提高。常用衍生试剂有BSTFA[N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺]、BTZ[N,O-双(三甲基硅烷)乙酰胺∶三甲基氯硅烷∶N-三甲基硅烷咪唑为3∶2∶3]、Sylon BFT[N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷为99∶1]等。此外,在衍生化过程中需将水分去除干净,水分会与胆固醇氧化物竞争衍生化试剂,导致衍生化反应不完全,将会使一种胆固醇氧化物出现几个色谱峰。
4.色谱分析
胆固醇氧化物的测定方法有多种,包括气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法(简称气质联用法)、核磁共振和酶法等。常用的是气相色谱法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法。
气相色谱法特别是毛细管气相色谱法是胆固醇氧化物的主要分析方法之一,这主要是因为胆固醇形成的氧化物结构十分类似,必须用高分辨率的毛细管柱才能分开。所用柱型大多是非极性的聚甲基硅氧烷和弱极性的5%苯基甲基聚硅氧烷,如DB-5、DB-1、HP-5、Rtx-1、SPB-1等。采用这类非极性和弱极性柱的主要原因是胆固醇氧化物具有较强极性、低蒸汽压、高沸点,所需柱温较高,而这类柱子高温稳定性好是其主要优势。柱温操作方式均为程序升温,且大多为多阶程序升温。氢火焰离子化检测器(FID)在胆固醇氧化物的气相色谱分析中仍占绝对优势。
高效液相色谱法分离效率高,一般在室温下分析即可,不需高柱温,因此不会造成待测物质高温分解的情况,但在检测胆固醇氧化物方面存在一些缺陷。首先,液相色谱仪所使用的色谱柱的容量和分离效果达不到所需要求;其次,液相色谱仪的紫外或者荧光检测器不能用于大多数胆固醇氧化物的检测,因为它们无紫外吸收,更无荧光。
气质联用法是将气相色谱和质谱结合起来的一种用于确定测试样品中不同物质的定性定量分析方法。气相色谱-质谱联用技术兼顾了气相色谱和质谱两者各自的优点,其具有气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度,是分离和检测复杂化合物的最有力工具之一。此类方法中,色谱柱的选择、柱温升温程序设置同气相色谱法相近。质谱部分采用标准的电子轰击离子源(70eV),质谱扫描范围多在m/z100~650之间。胆固醇氧化物定量一般根据质谱特征离子峰计算。
五、反式脂肪酸
反式脂肪酸是包含反式双键的一类脂肪酸。反式双键指非共轭双键上两个相邻的氢原子处于不同侧面。反式脂肪酸已引起各国的关注,其中美国要求食品营养标签上必须标注反式脂肪酸含量,一些欧盟和亚洲国家也制订其最低限量标准。
(一)物理化学特性
反式脂肪酸按碳原子数目可分为16碳、18碳和20碳三种,加工食品中以18碳的反式脂肪酸含量较多。反式脂肪酸按照双键数目分为反式单烯酸和反式双烯酸。按照反式脂肪酸的异构位置分类,18碳的单烯酸可以进一步分为反式9-十八碳烯酸、反式11-十八碳烯酸。
反式脂肪酸的空间结构为直线型,此结构使得其较顺式脂肪酸熔点高且具有更好的热力学稳定性,其性质与饱和脂肪酸接近。反式脂肪酸表现出的一些特性是介于饱和脂肪酸和顺式脂肪酸之间的。一般反式脂肪酸的熔点高于顺式脂肪酸,如油酸的熔点是13.5℃,室温下呈液态油状,而反式油酸的熔点为46.5℃,室温下呈固态脂状。
(二)反式脂肪酸形成机制
反式脂肪酸进入食品主要有两种不同的渠道:一是植物油脂经高温处理;二是一些动物脂肪中自然存在。但不管哪种渠道,反式脂肪酸都是由不饱和脂肪酸异构化反应而来。
在日常生活中,许多人习惯在烹饪时将油加热到冒烟,由于油的温度较高,油脂异构化产生的反式脂肪酸较多,而且一些经过反复煎炸的油,油温更是远远高于发烟点的温度,会积累较多的反式脂肪酸,而且还会产生其他具有挥发性的醛、酮、醇等化合物,严重影响油脂的品质。在高温条件下发生的不饱和脂肪酸异构化,主要由高于活化能的热能作用使顺式结构发生异构化。
植物油传统压榨法或浸出法制取的毛油中含有游离脂肪酸、胶质、色素等杂质,需经精炼过程去除。油脂的脱臭过程在真空、高温条件下进行,顺式脂肪酸在高温、金属离子等因素影响经过异构化作用而生成不同类型的反式脂肪酸。在高温条件下,不饱和脂肪酸中的双键容易被破坏,发生异构化生成反式脂肪酸的同时有一部分发生不饱和键断裂生成短碳链的挥发性化合物。不同的脱臭温度和时间会引起亚油酸和亚麻酸的异构化。
传统油脂生产过程中通过将油脂部分氢化来改善油脂的品质。在此过程中油脂分子中一部分双键被饱和,另一部分双键发生位置异构或转变为反式构型,产生反式脂肪酸,主要是n-9反式油酸。
亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物的酶促氢化作用下会产生反式和共轭脂肪酸。在反刍动物进食区域里发现一种异构化酶,它导致了不饱和脂肪酸的顺反异构化。通过还原酶的氢化作用反式脂肪酸在反刍动物的瘤胃中产生,并传递到乳脂以及自身脂肪当中。
(三)有害作用
1.流行病学调查
(1)对心血管疾病的影响 有确凿的证据显示反式脂肪酸与心血管疾病有相关性。反式脂肪酸能引起血清总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)含量的升高,一定程度降低了高密度脂蛋白(HDL)含量,从而促进动脉硬化。
反式脂肪酸能使血液黏稠度和凝聚力增加。当反式脂肪酸的摄入量达到总能量的6%时,人体的全血凝集程度比反式脂肪酸摄入量为2%的人高,更易产生血栓。而血浆总胆固醇和甘油三酯水平升高、载脂蛋白B水平的降低、血液黏稠度的升高都是动脉硬化、冠心病和血栓形成的重要因素。也有一些研究认为,反式脂肪酸与细胞膜磷脂结合,改变了膜脂分布,直接改变膜的流动性和通透性,进而影响膜蛋白结构和离子通道,改变心肌信号传导的阈值,从而成为导致心肌梗死等疾病发病率增高的重要原因。
(2)对Ⅱ型糖尿病的影响 部分研究结果证实,反式脂肪酸摄入过多会增加妇女患Ⅱ型糖尿病的概率。脂肪总量、饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸的摄入均与糖尿病发病率无关,但摄入的反式脂肪酸能显著增加患糖尿病的概率。有实验结果表明,反式脂肪酸能使脂肪细胞对胰岛素的敏感性降低,从而增加机体对胰岛素的需求量,增大胰腺的负荷,容易诱发Ⅱ型糖尿病。这可能也与反式脂肪酸进入内皮细胞,导致内皮细胞功能障碍,影响与炎症反应相关的信号传导有关。反式脂肪酸与Ⅱ型糖尿病的关系需进一步研究。
(3)对婴儿发育的影响 孕妇和哺乳期妇女摄入的反式脂肪酸可以通过胎盘和乳汁进入婴幼儿体内,对婴幼儿生长发育产生不可低估的影响。反式脂肪酸通过影响Δ6-脂肪酸脱氢酶活性,从而使体内多不饱和脂肪酸的生成受到抑制,直接影响婴儿的正常生长。体内的反式脂肪酸还会干扰正常脂质代谢。反式脂肪酸在合成组织时优先占据细胞膜磷脂的sn-1位,取代饱和脂肪酸;少数的反式脂肪酸会结合在sn-2位与多不饱和脂肪酸形成竞争。反式脂肪酸通过抑制Δ6-脱氢酶和Δ9-脱氢酶的活性抑制体内花生四烯酸和其他多不饱和脂肪酸的合成。
反式脂肪酸对婴幼儿生长的影响有以下三个方面。
①由于婴幼儿的生理调节能力较差,反式脂肪酸对多不饱和脂肪酸代谢的干扰会导致胎儿和新生儿体内必需脂肪酸的缺乏,影响生长发育。
②反式脂肪酸还可结合机体组织脂质,特别是结合于脑中脂质,抑制长链多不饱和脂肪酸的形成,从而对婴幼儿的中枢神经系统的发育产生严重的影响。
③反式脂肪酸抑制前列腺素的合成,母体中的前列腺素可通过母乳作用于婴儿,通过调节婴儿胃酸分泌、平滑肌收缩和血液循环等功能而发挥作用,因此反式脂肪酸可通过对母乳中前列腺素含量的影响而干扰婴儿的生长发育。
(4)对癌症发病率的影响 反式脂肪酸与乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发病率有关。流行病学调查结果显示,增加反式脂肪酸摄入量与患乳腺癌的风险呈显著正相关。
2.相关法律法规
世界卫生组织和联合国粮农组织于2003年发表的“膳食、营养与慢性病预防专家委员会报告”指出,为增进心血管健康,应尽量控制饮食中的反式脂肪酸,最大摄取量不超过总能量的1%。许多国家已经颁布反式脂肪酸相关的法律、法规以及建议。美国1999年强制在营养标签中标示反式脂肪的含量。2003年发布新的增补法规,强制要求在传统食品及膳食补充剂的营养标签中标示反式脂肪酸的含量,并最终于2006年实施。丹麦营养委员会多次公布“反式脂肪酸对健康不良影响的报告”,丹麦政府于2003年立法,要求丹麦市场上销售的食品中反式脂肪酸含量不得高于脂肪含量的2%,这一举措有效控制了丹麦食品中反式脂肪酸含量。荷兰及瑞典等国制定食品中人造脂肪的限量标准,其中反式脂肪酸含量控制在5%以下。
我国卫生部2007年发布的《中国居民膳食指南》建议,“远离反式脂肪酸,尽可能少吃富含氢化油脂的食物”。2013年实施的《预包装食品营养标签通则》规定,如食品配料含有或生产过程中使用了氢化和(或)部分氢化油脂,必须在食品标签的营养成分表中标示反式脂肪酸含量。标准指出,每天摄入反式脂肪酸不应超过2.2g,反式脂肪酸摄入量应少于每日总能量的1%。
根据流行病学研究结果,欧美在反式脂肪酸摄入量上逐渐减少,而发展中国家的反式脂肪酸摄入量则有增加的趋势。因此,对食品中反式脂肪酸含量实施限量管理势在必行。
(四)测定方法
国标GB 5009.027—2016《食品安全国家标准食品中反式脂肪酸的测定》中规定检出限为0.012%(以脂肪计),定量限为0.024%(以脂肪计)。反式脂肪酸的分析方法还包括Ag+技术、红外吸收光谱法(IR)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱法(GC)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)以及结合使用的方法。
六、亚硝胺
N-亚硝胺是一类很强的化学致癌性物质,包括亚硝胺和亚硝酞胺两大类物质,通常泛称为亚硝胺,是四大食品污染物之一。亚硝胺可以在人体中合成,是一种很难完全避开的致癌物质。
(一)亚硝胺的种类
N-亚硝胺是世界公认的三大致癌物质之一,其中低分子量的N-亚硝胺在常温下为黄色油状液体,高分子量的N-亚硝胺多为固体。二甲基亚硝胺可溶于水及有机溶剂,其他则不能溶于水,只能溶于有机溶剂。在通常情况下,N-亚硝胺不易水解,在中性和碱性环境中较稳定,但在特定条件下也发生水解、加成、还原、氧化等反应。N-亚硝胺是一类化学结构和性质极为多样化的化合物,依照化学结构可以分为对称性二烷基亚硝胺、不对称二烷基亚硝胺、具有功能团的亚硝胺、环状亚硝胺和烷基(芳基)亚硝酰胺。按照物理性质又有挥发性和非挥发性亚硝胺之分。
(二)亚硝胺的形成机理
亚硝酸盐是亚硝胺类化合物的前体物质。在自然界,亚硝酸盐极易和胺类物质化合,生成亚硝胺。在人体胃的酸性环境里,亚硝酸盐也可以转化为亚硝胺。亚硝胺的形成是一个复杂的过程,依赖于胺类物质、酰胺类物质、蛋白质、肽类物质和氨基酸的存在。此外,微生物也参与了亚硝胺的形成,把硝酸盐还原为亚硝酸盐,还能把蛋白降解为胺类物质和氨基酸。
(三)亚硝胺的致癌作用
300多种N-亚硝胺在动物身上显示出致癌作用。这类强致癌物质在实验动物身上诱导的肿瘤在形态学特点上和与具有血型特异性抗原进行的表达在生化特点上都与相应的人的器官上发现的肿瘤相似,并且更多的试验和一些流行病学数据表明,人类是N-亚硝胺引起癌症的易感群体。
亚硝胺是一类重要致癌物质,在体内细胞色素P450的作用下经代谢活化生成活泼亲电物质。在细胞色素P450的催化氧化作用下,N-亚硝胺首先发生α羟基化反应,即与N原子紧密相连的碳原子首先发生羟基化,形成α-羟基二烷基亚硝胺,随后在体内生理环境下分解,变成醛和羟基偶氮化合物,羟基偶氮化合物进一步离解后形成羟基重氮化合物,羟基重氮化合物具有很高的亲电性,可以与水反应生成醇,而与DNA结合后,可以使DNA的碱基发生烷化作用形成DNA加合物,最终导致肿瘤的产生。所以在癌症的初始阶段,DNA的烷基化被认为是致癌物质的关键性细胞靶向活动。
(四)亚硝胺的测定方法
随着近代分析化学的发展和新仪器的应用,N-亚硝胺的测定方法己经相当多样和完善,选择性和灵敏度也在不断提高。根据分析方法的原理可以分为紫外和可见光光度法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、极谱法和胶束电动毛细管色谱法(MEKC)。紫外分光光度法可以直接测定N-亚硝胺的含量,N-亚硝胺特征的紫外光谱有两个吸收峰,在340nm有一个较弱的吸收峰,在230nm处有一个较强的吸收峰。MEKC结合了高效液相色谱和毛细管电泳的优点,具有高柱效、高选择性、分析速度快、自动化程度较高的特点,在N-亚硝胺分析中的应用也取得了良好的效果。
七、PM2.5
食品在油炸、烧烤等加工过程中挥发的油脂、有机质及热氧化和热裂解产生的混合物形成了食品加工油烟。这些油烟在形态组成上包括颗粒物及气态污染物两类,其中直径小于2.5μm的颗粒物质即为PM2.5。PM2.5粒径小比表面积大、重量轻、吸附能力强,能吸附各种有害物质且能长时间悬浮于空气中,被人们吸入直接进入肺部,对人体健康产生较大危害。近年来,PM2.5已成为政府和社会各界关注的热点问题。
(一)PM2.5来源
PM2.5成分复杂,来源广泛。如火山喷发、风吹起的尘土、森林大火、工业中的燃料源、汽车尾气、生物质燃烧、垃圾焚烧、建筑施工扬尘、食品医药工业等都会排放PM2.5。本章主要介绍食品加工业及家庭厨房排放的PM2.5。
1.厨房油烟中的PM2.5
日常烹调油的化学结构是三酰甘油,在油炸过程中,食物在约180℃下接触热油,油脂挥发凝聚,产生颗粒物,在空气中呈飘浮状态而长期存在,属于典型的PM2.5;同时食物和油脂也部分暴露于氧气当中,发生氧化反应,形成的氢过氧化物在高温作用下快速分解,产生挥发性物质,包括饱和与不饱和醛酮类、烃类、醇类、内酯、酸和酯类。其中很多挥发性物质都有毒,如丙烯醛已被确认是油烟中提高肺癌风险的因素之一。油烟中还含有大量的3,4-苯并芘、杂环胺等致癌物质,吸附到PM2.5上,比普通的灰尘更具危害性,被人体吸入后容易引发肺癌、胃癌等疾病。炒菜油炸温度越高,时间越长,产生的有害物质越多。据统计,在一个800万人口的城市,全年的厨房油烟颗粒物排放量将近12600t,对PM2.5的贡献率超过10%。
2.食品工业中的PM2.5
一个规模化的食品加工企业油炸食品一年用油150~250t,按吸油烟机的油脂去除率90%计算,一年排出颗粒物达15~25t。一个省级城市具规模化的油炸食品企业按100家计算,一年排放颗粒物就达1500~2500t。普通的油条摊点每天用油约5~10kg,一年排出颗粒物约为180~360kg,一个省级城市油条摊点按5000家计算,一年排放颗粒物就达900~1800t,而油炸油烟中的颗粒物主要为PM2.5。此外,烧烤、烟熏等加工方式均会产生大量的PM2.5。
(1)烧烤产生的PM2.5 烧烤污染物质其实包括两类,一类是煤炭燃气燃烧排出的,另一类便是被烧烤物质在烤制过程中排出的。
烧烤主要用的是木炭或焦炭,烧烤过程中处于一个木炭的不完全燃烧的过程,木炭燃烧产物中尚残存有一氧化碳、二氧化硫、硫氧化物、氢、甲烷等可燃物质,这些气体在环境中经化学反应或物理过程转化成液态及固态的颗粒物;烧烤同时会产生烷类、芳烃类、烯类、酯类、醛类等挥发性有机物,而挥发性有机物恰恰是导致PM2.5生成的重要条件。烧烤排出的颗粒物中大部分组成了PM2.5中的物质。
烧烤温度往往超过200℃,在此高温下,蛋白质受热产生杂环胺类物质,而且如果肉被烤焦,局部温度接近300℃时,食物脂肪焦化产生的物质与肉里的蛋白质发生热聚合反应,同样会产生大量3,4-苯并芘等致癌物。3,4-苯并芘不仅能通过烤肉的烟雾进入呼吸道,还能通过食用烤肉进入消化道。烧烤燃烧产生的颗粒物比其他PM2.5要细得多,PM2.5中的粒子越细,表面积就越大,它吸附空气中的有害物就越多。这种集中、低空排放的高浓度有害气体,对接触的人们危害极大。
笔者测定了传统烤鸭加工过程中生成的烟气中PM2.5排放情况:燃气烤鸭炉烤制烤鸭,每批次加工20只,烤鸭炉200℃预热15min,将腌制后的原料鸭悬挂在烤鸭炉内,在250~270℃条件下烘烤1h左右,用智能中流量大气总悬浮颗粒物采样器(配PM2.5采样切割头)在100L/min流速条件下收集250℃烤制阶段产生的烟气。按照国标HJ 618—2011环境空气PM10和PM2.5的测定重量法,得到燃气加工方式烟气中PM2.5质量浓度为(2020.00±198.04)μg/m3,超过我国环境空气质量标准二级限值75μg/m3的25.9倍左右。
(2)油炸产生的PM2.5 油炸过程经历复杂的物理和化学变化,如油的吸收、氧化、水解和热分解,产生许多有害成分,影响油炸食品感官,危害身体健康。烧鸡是我国的传统食品,深受消费者喜爱,全国每年产量可达数亿只,烧鸡加工期间油炸烟气中的有害物质对环境和人体造成的伤害不可小觑。
为评估烧鸡油炸烟气的安全性和对环境的污染状况,笔者在南京某肉制品加工企业烧鸡生产线油炸工序排烟口外1m处设置采样点,使用智能中流量大气总悬浮颗粒物采样器(配PM2.5采样切割头),在100L/min流速条件下收集1h烧鸡油炸工序排放的烟气。
烧鸡油炸多使用棕榈油,加工温度在180℃以上,每100kg油可加工1000~1400只鸡,加工过程中油会多次循环使用,直至油色变黑、油哈味明显或烟气有呛感时更换新油。在采集烟气的过程中,将使用12~25h的油定义为中期油,将使用30h以上的油定义为后期油。中期油炸烟气中PM2.5最高超过我国环境空气质量标准二级限值75μg/m3的23.4倍;继续使用30h以上烟气中PM2.5最高超过国标的31.5倍。
(3)烟熏产生的PM2.5 熏制用的熏烟是直接燃烧整块木头、小块木头或者锯木碎屑,将待熏制的产品直接悬挂,或者置于金属网上面进行直接烟熏。熏制时需阴烧不见明火,以最大限度地产生烟。用在食品加工中的熏烟主要是通过燃烧木材所发烟产生的,主要使用的是硬木,如山毛榉、山核桃木、橡树。
熏烟是水蒸气、空气、CO2、CO,还有数百种的有机物质以不同浓度的气溶胶、蒸汽相、极小的分子颗粒形式存在的混合物,熏烟是在不完全燃烧的情况下产生的。木材的不完全燃烧产生的颗粒物不但是PM2.5的重要组成成分,而且使产品中含有多环芳烃类等对人类健康有害的物质。
(二)PM2.5的危害
1.PM2.5成分
PM2.5的化学成分主要包括无机成分、有机成分、微量重金属元素等。无机成分主要包含硫酸盐、硝酸盐等;有机成分主要包括多环芳烃;微量重金属元素包括铬、铜、锌、铅、镍等。
2.PM2.5对环境的影响
首先,PM2.5对空气质量和能见度等有重要的影响。与较粗的大气颗粒物相比,粒径小的细颗粒物富含大量的有毒、有害物质,且在大气中的停留时间长、输送距离远,从而对人体健康和大气环境质量的影响更大。细颗粒物能飘到较远的地方,影响范围较大。其次,PM2.5会影响全球的气候。PM2.5能影响成云和降雨过程,间接影响着气候变化。PM2.5对太阳的辐射有一定的吸收和反射的作用,从而进一步改变当地的温度、湿度等气候条件,形成局部的水循环并导致部分地区的极端天气,严重影响人们的正常生活。
3.PM2.5对人类健康的危害
PM2.5比表面积较大,易成为其他污染物的载体和反应体,可吸附大量的有毒、有害物质,通过呼吸系统直接进入人的肺部并沉积下来,导致人体呼吸系统和心血管系统等罹患各种急性和慢性疾病。