第三节 中成药学研究方法
中成药在我国制药行业中独具特色，已成为创新药物的重要源泉，目前国家已批准上市的中成药有9000多种，且随着传统医药在世界范围内“回归自然”的呼唤中复苏，以及在全社会高度重视和发展中医药的大背景下，有必要运用现代科学技术，深入开展中成药的挖掘研究，科学地阐释中成药的有效性和安全性。目前中成药的研究内容非常广泛，具体研究方法可参考相关章节内容，本章主要从中成药的物质基础研究和作用机制研究做一简单介绍。
一、中成药的物质基础研究
中成药的化学成分是其发挥药效的物质基础。目前中成药药效物质基础的研究思路主要有两种：一是中成药体外化学成分的研究；二是中成药体内血清药物化学的研究。
1.体外化学成分的研究 传统化学成分分离法是研究中成药物质基础最经典的方法。即按植物药研究思路，将中成药经过植物化学成分提取、分离、纯化、结构鉴定得到的单一化合物，辅以活性筛选确定药理活性；或者利用已有药理模型对分离得到的每个部位进行活性追踪，从而对最终得到的化合物进行结构鉴定。如对当归龙荟丸治疗慢性粒细胞白血病的筛选中，发现其中主要有效药物是青黛，进一步对青黛进行化学成分分离、活性验证，发现其有效成分为靛玉红。
2.体内血清药物化学的研究 不管中成药中含有多少种化学成分，但只有进入血液的成分才有可能发挥作用，成为有效成分。中药血清药物化学即以中药给药后的血清为研究对象，通过先进的分析技术，从血清中分离、鉴定进入血液的移行成分，结合药理学的研究结果，将入血成分与药效学指标变化相结合，应用聚类分析、主成分分析、逐步回归分析等多元统计分析方法，研究血清中移行成分与传统药效的相关性，以阐明中药的药效物质基础。例如，利用UPLC-HDMS方法分析大鼠口服生脉散后含药血清样品，对比空白血清的成分异同，确定大鼠口服生脉散后的血中移行成分，并利用质谱数据表征血中移行成分的结构，最终分析鉴定了18个血中移行成分，其中5个为代谢产物，13个成分为生脉散的原型成分，血中移行成分及代谢产物可能为生脉散的体内直接或间接作用物质，对其进行深入的研究将有助于阐明生脉散的有效成分及作用机制。
此外，还有学者提出谱-效关系结合法的研究思路。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式。中成药指纹图谱较单一化学成分的质量控制方法，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。谱-效关系是指将中药指纹图谱或特征图谱中化学成分的变化与其疗效变化相结合，研究其相关性，找出与药效活性相关的药效物质群。如利用GC-MS建立桃红四物汤低极性部位指纹图谱，结合小鼠痛经模型，研究桃红四物汤抑制小鼠痛经有效部位的谱效关系，结果表明，亚油酸在延长扭体潜伏期和减少扭体次数方面起主要作用，十八碳烯酸、花生酸、二十七烷对镇痛效果有一定的协同作用。
二、中成药的作用机制研究
中成药尽管长期在临床应用，疗效可靠、作用肯定，有扎实的理论与实践基础，但其作用机制尚不十分清楚，成为制约中成药创新发展的主要因素。因此，阐明中成药的作用机制，已成为目前中成药研究关注的焦点，目前主要的研究思路有以下几种。
1.基于整体动物的作用机制研究 采用疾病动物模型、证候动物模型、病证结合动物模型及模式动物等整体动物模型，在研究中成药主要药效的基础上，结合相关疾病的分子生物学基础，应用分子生物学技术，从分子水平探讨中成药的作用机制。例如，采用气管内滴注脂多糖（LPS）致小鼠急性肺损伤模型，探讨连花清瘟胶囊作用机制。在常规光镜下观察肺组织病理形态变化、透射电镜下观察肺泡上皮超微结构的基础上，应用流式细胞术检测外周血T细胞中TNF-α阳性表达细胞百分率，免疫组化法检测肺组织间隙连接蛋白43（Cx43）、闭锁蛋白和闭锁小带蛋白（ZO-1）的表达，RT-PCR法检测肺组织中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA表达，免疫印迹法检测肺组织中中性粒细胞弹性蛋白酶、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表达。结果显示，连花清瘟胶囊可能通过抑制炎症细胞浸润，改善肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞连接蛋白的表达，抑制IKK/IκB/NF-κB信号转导系统，减少炎症因子的表达等机制缓解LPS所致的急性肺损伤。
2.基于体外实验的作用机制研究 采用细胞模型，应用基因组学、转录组学及蛋白质组学等技术，体外探讨中成药的“多成分、多靶点、多通路”整合调节机制，鉴于中成药粗制剂中杂质可能对实验结果的准确性产生影响，近年来，常采用血清药理学的方法。血清药理学方法即以含中药血清为受试物，通常指动物经口给药后间隔一定的时间采血，分离含中药血清进行体外实验。例如，研究心脉通颗粒对原代培养大鼠心肌细胞H2O2损伤的抗氧化作用，应用心脉通含药血清干预12小时后，再加H2O2致心肌细胞损伤。6小时后检测心肌细胞形态学的改变，MTT法检测细胞活性的改变，细胞免疫组织化学法检测蛋白激酶B（PKB/Akt）的表达，RT-PCR检测蛋白激酶B（PKB/Akt）和内皮细胞型一氧化氮合酶（e NOS）的基因表达变化。结果显示，心脉通颗粒能够增强心肌细胞抗氧化损伤能力，保持细胞的形态和功能，抑制细胞凋亡，其机制可能是通过干预PKB/AKT-e NOS信号传导途径实现的。
3.基于网络生物学的中成药作用机制研究 2004年Barabasi等提出网络生物学的概念，认为通过建立网络模型，可以将复杂生物系统的相互作用抽象表达成网络，通过分析复杂网络的成分关系和特性来获得对生物体活动机制和功能更多的认识。网络生物学是用生物网络（包括基因调控网络、蛋白交互网络、新陈代谢网络和信号转导网络等）描述研究对象的生物学性质，分析因果关系，认识生命活动规律的科学。
用网络生物学方法获取疾病生物网络的功能模式、网络模体及潜在的药物靶点，构建复杂疾病的生物网络。中成药通过其含有的多个有效组分同时作用于多个药物靶点，从不同水平调节疾病信号通路以治疗疾病。例如，采用网络生物学方法，探讨复方丹参的多成分-多靶点-多疾病相关性。首先选择方中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、隐丹参酮、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及龙脑等9个活性成分，从PubMed中检索出与这些成分相关的所有文献，经对蛋白与基因信息标准化，获取与9个活性成分相关的基因信息。然后从人类孟德尔遗传数据库中，搜寻与心血管疾病相关的所有基因，用于比对来源于文献的数据。最后采用Cytoscape软件建立包括活性成分、基因、疾病3类节点的多成分-基因-疾病网络模型，通过建立疾病-基因-活性成分、疾病-基因-疾病、活性成分-基因-活性成分、基因-活性成分-基因、基因-疾病-基因5种连接，构建起完整的网络图。网络分析表明，丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、隐丹参酮、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及龙脑等9个活性成分可调控PPARG、ACE、KCNJ11、KCNQ1、ABCC8等42个心血管相关疾病基因表达，涉及糖尿病高胰岛素型低血糖症等30种疾病。
4.基于代谢组学的作用机制研究 代谢组学（metabonomics），为生物体在病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，在不同时间、多方位定量检测其代谢变化，通过测定整个机体的系统代谢图谱以探讨基因功能调控机制的学科。其核心思想在于运用现代分析技术定量地测定生物体在不同状态下（生理病理状态、药物干预前后等）参与物质传递、能量代谢和信息传导等代谢调控的小分子代谢物质即代谢物组的变化，并利用模式识别将这种应答与体内生物学事件相关联，定位事件发生的靶器官，从而确定生物标记物，表征或揭示生物体在特定时间、环境下整体的功能状态。
代谢组学动态地对活体内外的非损伤组织、器官进行无损伤、几乎接近生理条件的分析方法，与中医的“司外揣内”理论体系相近似，其研究思想与传统中医药强调人与自然协调统一的整体观及其诊疗模式不谋而合，可作为中医药研究的一种新方法、新途径。代谢组学其整体、动态、综合分析的特点，对于揭示中成药整体调控作用具有独特的优势。
代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域。它主要是应用现代分析仪器与分析手段，定性定量研究生物样品，包括生物体液（如血液、尿等）、细胞提取物、细胞培养液和组织等中的内源性代谢产物，结合模式识别等化学信息学技术，分析生物体在不同状态下的代谢指纹图谱的差异，获得相应的生物标志物群，从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态。例如，采用代谢组学的方法，研究六味地黄丸干预甲亢阴虚大鼠模型的作用机制。实验选用SD大鼠皮下注射L-左甲状腺素钠350μg/kg建立甲亢阴虚模型，给予六味地黄丸干预3周，同时以正常大鼠作为对照，采用UPLC-QTOF-MS技术对不同组大鼠的血清进行分析。结果显示，甲亢阴虚大鼠体内三羧酸循环发生障碍，糖、脂质、氨基酸代谢均出现紊乱，小分子代谢物草酰乙酸、磷酸二羟基丙酮、乙基葡糖苷酸、甘油三酯、溶血磷脂、胆固醇等明显上调，而六味地黄丸干预后，这些物质的水平出现明显下调，代谢紊乱得到一定的改善。