第二节　常见创伤感染动物模型及建模方法

创伤感染模型为感染模型中合并有创伤这一基础疾病的一个亚类，属于复合型的动物模型。在该模型中，创伤是感染发生的前提。创伤后动物往往出现免疫、凝血等多种生理功能的紊乱，因此在感染的易感性、严重程度以及预后等方面均较单一感染模型更为复杂。根据合并感染方式的差异，目前常见的创伤感染模型又可分为创伤部位自发感染动物模型和创伤部位合并外源性感染动物模型等两种主要的类型。

一、创伤部位自发感染动物模型

创伤部位自发感染动物模型是基于理化作用引起皮肤、组织或脏器创伤，破坏机体的防护屏障，继而被自身或环境中病原体侵袭所建立的感染动物模型。动物建模常用的创伤方式主要有：烧伤、烫伤、手术器械以及其他理化损伤等。

1. 烧烫伤自发感染模型

烧烫伤是日常生活中最常见的外伤疾病之一。烧烫伤是主要指由气体、液体和固体材料引起的热损伤，当做为人体天然免疫屏障的皮肤被破坏，创面产生大量的坏死细胞，病原微生物更易于定植而造成创伤感染。1968年，Mason和Walker报道了首例烫伤动物模型的研究，将小鼠麻醉后，局部十秒沸水浴创建了Ⅲ度烫伤的小鼠模型。直到今天，已有大量的各种烧烫伤动物模型报道。烧烫伤模型建立方法有：火焰烧伤、电光源烧伤、化学试剂烧伤以及高温烫伤等，可根据研究目的选择不同的方法。同时还可以通过优化温度、时间、创面大小等来控制感染动物模型的烧烫伤程度。建模后进行各项指标的观测，用以评价感染模型的建立或干预措施效果。如目前常用的金属烫伤模型，其主要建模过程为：①术前24小时备皮脱毛，术前12小时禁食；②术前采用腹腔注射戊巴比妥或异氟烷吸入麻醉等方式麻醉；③将有机试剂混合调整沸点的共沸水或者普通沸水浴加热金属烫头，接触烫伤部位造模；④创伤后进行腹腔注射乳酸林格液复苏，并根据实验需求行清创处理；⑤模型制备后的第3天，对创面皮肤组织进行病理组织学观察诊断创伤程度评价。在致烫伤过程中可以通过恒温恒压的创伤装置结合优化烫伤时间，以建立可重复的深度烧烫伤模型。烧、烫伤感染动物模型在小鼠、大鼠、家兔、猪和猴等中均有建模应用，大量的创伤愈合研究发现，猪烧伤模型研究有78%与人体研究结果一致，啮齿类动物模型研究有53%与人体研究结果一致，表明猪作为烧烫伤模型研究更具有优势。在此模型中，主要通过对创伤部位进行感染菌群分析、创面病理学切片观察愈合进程、组织和血液感染程度、炎症介质释放、创伤感染部位细胞浸润检测等对模型感染特征进行评价和分析。

2. 手术自发感染动物模型

在动物建模研究过程中也采用外科手术的方式造成创伤，并同时引发感染，以模拟人体相应的创伤感染。腹部创伤往往会引起肠道病原体的移位，而易导致感染的发生。因此是手术感染动物模型建模的主要选择部位。前面在自身感染模型中介绍的CLP模型，即为一种手术所致的腹部感染模型，模拟肠道创伤穿孔所致感染性腹膜炎。该模型与临床感染并发脓毒症患者具有极佳的相似性，复制了许多继发细菌性腹膜炎特点，包括复合细菌感染、持续升高的HMGB1以及引发急性肺损伤等。CLP模型是目前应用最为广泛的一种腹腔自身感染模型，并被公认为脓毒症动物模型的金标准。该类动物模型具有如下优点：第一，通过模型动物自身感染引发脓毒症，具有与人类脓毒症相似的循环反应（即早期心输出量升高、全身血管阻力降低，晚期输出量和血管阻力均低）和体内炎症介质的变化规律；第二，在建模的同时可同步模拟临床脓毒症治疗方法，辅以充分的液体复苏和适当辅助治疗，非常适宜用于防治脓毒症或脓毒性休克新药的临床前观察。尤其是对于脓毒症新药临床前研究来说，往往须经CLP模型中的药效验证。CLP模型的操作和应用流程主要包括：①动物术前禁食12～24小时；②术前麻醉，采用异氟烷吸入麻醉或腹腔注射戊巴比妥等方法进行；③盲肠结扎穿孔手术操作，将动物固定于手术台板上，腹部备皮，碘伏消毒，逐层开腹，游离盲肠，在距盲肠远端固定位置以缝合丝线结扎，在结扎处与远端中间肠段穿刺，回纳盲肠，逐层缝合肌层和皮肤，可通过调整穿刺针型号与结扎长度建立脓毒症、重度脓毒症和脓毒症休克动物模型。④术后模拟临床辅助治疗，包括保温处理和液体复苏。啮齿动物多采用皮下注射生理盐水或林格液复苏的方式，犬类则可建立静脉通道，行液体复苏操作。⑤建模或干预效果评价，存活率，血液感染指征检测（细菌、内毒素、炎症因子），病理和生化检查检测脏器损伤等。目前CLP模型中主要采用注射器针头进行盲肠的穿刺。笔者观察到注射器针头无法保证建模的稳定性，同时因尺寸小，不能在犬、猪等大动物上实施操作。为此研制了一种新型的穿刺针，并将其利用到CLP建模中，解决了稳定性问题。利用该穿刺针尺寸范围大的特点，也将其用于了比格犬等大动物种建立CLP模型。

3. 复合伤自发感染动物模型

复合伤受伤局部组织损毁污染严重，伤情复杂，极易发生感染，因此复合伤感染较单纯的烧烫伤、冲击伤感染具有发病更早、更重等特点。同时放射处理后动物对各种病原体更加敏感，易感性也大大增加。小鼠放烧复合伤模型建立方法主要为：成年小鼠全身在辐照仪中进行辐照损伤，0～9Gy剂量，剂量率为95cGy的每分钟，作用1小时。辐照损伤后进行氯胺酮的混合物和甲苄噻腹腔注射麻醉，背部剃毛，将其放回仅允许15%体表面积暴露的特制塑料盒中，95℃水浴7秒造成全层烫伤，完成烫伤后立即吸干水分避免残余热水引起进一步烫伤。建模后立即行37℃生理盐水腹腔注射复苏发生，将动物放回含加热垫的培养笼中直至苏醒。建模后定期观察和检测细菌计数以及动物生理指标的改变，以判断模型构建是否成功。

二、创伤合并外源性注入/植入感染动物模型

创伤合并自发感染模型造模个体差异大，严重程度也不易控制，因此标准化问题常常制约了其推广应用，为解决单一创伤模型的上述问题，研究者通过创伤合并外源性注入/植入感染的方式建立复合型创伤感染模型。该模型通常在对动物进行创伤造模后，在伤口部位植入或经静脉、腹腔、皮下等注入病原体或病原分子，建立创伤后脓毒症动物模型。

（一）外科手术部位合并感染模型

外科手术部位感染主要由术中或术后护理过程中引入的病原体感染，包括条件性感染、院内感染、继发性感染等。由于手术创伤造成免疫力低下，部分非致病菌和低毒力致病菌能够引起条件性感染，院内的各种致病菌侵入外科手术患者手术部位或体内引起院内感染。常见的手术创伤感染动物模型可建立表皮开放性或闭合性创伤、深部皮肤/肌肉创伤或器官创伤，同时通过在皮肤、腹腔等部位植入感染性病原体等方式诱发急性或慢性感染。根据手术部位的不同，该模型可分为表皮切除感染、深部创伤感染和器官创伤感染。采用的动物种类主要有小鼠、大鼠和猪等。对于表皮手术部位感染，小鼠是最常用的动物。对于深部切开和脏器相关的感染，一般采用大鼠或更大个体的动物。

1. 表皮手术部位感染模型

通常使用小鼠表皮创伤结合病原体植入进行建模操作。具体过程包括术前禁食与备皮等准备工作，麻醉后进行手术操作，定量病原体植入操作，术后监护与护理。为了保证建模的可重复性，需要准确的控制表皮的创伤面积和深度和定量控制病原体的数量。如在建立浅表皮切口外源物体感染模型的模型中，可在手术植入一个6.35mm的经10%无菌角叉菜胶溶液处理的滤纸盘。具体方法为腹侧中部皮肤切开，用处理过的纸片植入底部皮下组织，同时添加拟杆菌和埃希菌以复制伤口感染。角叉菜胶溶液饱和的硬片和适当量的微生物植入可确保定量可控的感染。

2. 深部创伤感染模型

动物多选用大鼠或更大个体的动物，感染病原体常为致病菌或条件致病菌。由于手术部位感染模型是在无菌环境下制造的，使用低接种量的感染微生物将更符合临床实际情况。深部感染模型的基本过程包括：术前备皮、清洁、麻醉等准备工作，创伤的建立合并病原体的植入，术后护理与模型评价。具体建模方法如下：大鼠深部感染模型为首先大鼠背部皮肤切开4cm长、5mm侧向平行于背部脊柱，深1cm至脊柱旁肌肉的伤口。用100mg无菌沙作为异物置于伤口，且伤口部位接种5.0×107CFU的金黄葡萄球菌悬液100μl，皮肤切口缝合封闭。豚鼠深部感染模型为在豚鼠肩部区域做2cm的皮肤切开、1cm至背部中线右侧，延伸但不经过深筋膜。用微量注射器将大肠埃希菌和拟杆菌的混合菌液均匀注射于伤口两侧。建模后定期检测体内或局部组织细菌水平，脓肿形成以及病理指标，以明确建模状态。

（二）开放性骨折合并感染模型

开放性骨折所致感染是骨科的常见并发症。由于生理屏障的破坏，使深层骨骼更容易与污染物直接接触，伤口感染的几率大大增加，并成为严重影响患者预后的突出问题。为研究开放性骨折感染的发病和防治策略，目前已建立的相关动物模型主要基于骨折的部位不同分类，主要有开放性胫骨骨折模型和开放性股骨骨折模型两类。所采用的动物主要有小鼠、大鼠、犬、兔、绵羊、山羊等。最常用的致病微生物为金黄色葡萄球菌。

1. 开放性胫骨骨折模型

开放性胫骨骨折模型动物多选择小鼠、大鼠和兔。具体方法为：动物的左后肢剃毛，清洗并用布包裹以提供无菌区域。纵向剪开皮肤，依次切开皮肤以及皮下组织，将内侧胫骨露出，在胫腓骨止点远端约2mm处横行截断胫骨骨干，实现该胫骨轴的中间部分的可重现的断裂。感染病原体多选用金黄色葡萄球菌，在骨折部位通过先前放置的针头接种0.5ml含有一定数量的细菌悬液，用生理盐水溶液冲洗裂缝部位，若实验中需使用抗生素也可在骨折部位加入小体积的抗生素液体。直腿后将骨干复位，逐层缝合切口，无菌敷料覆盖，用3mm直径的克氏线（Kirschner wire）或石膏托固定。观察整体精神状态，饮食情况，测试体温，同时观察兔鼻腔是否有脓性分泌物进行简单的感染模型判断，进一步建模完成后通过CT断层扫描骨折恢复情况，炎性介质，病理切片等判定感染模型的建立。该模型常用于评价新剂型抗生素治疗该类感染的有效性，和固定植入物材料和设计对局部感染的影响。

2. 开放性股骨骨折模型

（1） 大鼠开放性股骨骨折模型：

该模型包括钝挫伤和开放性伤口。将大鼠麻醉后，腿放置在断裂装置（腹侧向上）的平台上，将钝刀片置于股骨中间轴。采用重物自由下落的方式传递了重力，造成股骨中间轴骨折并伴有软组织损伤模型。暴露骨折末端后用102 CFU/ml的金黄葡萄球菌接种物直接接种于伤口处，骨折部位暴露于外部一小时以模拟外伤患者的“黄金小时”。然后迅速开始固定，逐层缝合使筋肌膜关闭和皮肤闭合。用此模型可建立可重复的90%～100%的感染率。

（2） 兔开放性股骨骨折模型：

在股骨的近端第三股骨处做一个切口，使用锋利的2.5mm钻头，钻孔置于通过股骨的两皮质处，然后用3.5mm的龙头轻轻敲打，一半家兔用了3.5mm不锈钢螺丝，另外的一半孔使其空着。创伤部位接种0.5ml 108 CFU的金黄葡萄球菌，然后用单一连续缝合的方式缝合。结果显示，螺丝的使用可以将感染率提升至超过50%。

（三）烧（烫）伤合并感染模型

由于烧（烫）伤一般合并大面积皮肤缺失，因此感染在烧（烫）伤患者几乎难以避免。为更好模拟患者感染及并发症的发生，目前主要在开水烫伤模型、火焰烧伤模型、预热的双铜块烧伤模型和预热（单）金属板/棒烧伤模型等模型中合并皮下或腹腔注射病原体的发生构建烧（烫）伤合并感染的动物模型。

1. 开水烫伤合并感染豚鼠模型

豚鼠术前禁食24小时。麻醉常采用肌注氯乙酰丙嗪复合etorfine的方式进行全身麻醉，背部剃毛并采用70%酒精溶液（含2.5%碘酊）消毒。烫伤的建立是通过把动物放置在一个定制的绝缘模板上，该模板可暴露60cm2的背部区域（相当于15%体表面积）。该区域浸没于99℃水中13秒，一小时后，动物被再次置于该模板上进行二次背部烫伤。烫伤造模时需及时处理创面多余水，避免形成再次创伤。烧烫处理后迅速在烧烫伤部位皮下注射5×105CFU的金黄色葡萄球菌。该类烫伤模型广泛应用于小鼠、大鼠、兔类动物建模，结合体表和烧伤面积的计算运用。

2. 火焰烧伤合并感染模型

（1） 乙醇浴烧伤小鼠模型：

该模型使用22～24g 的CF1雌性小鼠，小鼠麻醉后背部剃毛，一个大约30%体表面积的石棉板紧紧贴于小鼠背部，乙醇均匀的置于该区域，点火使其燃烧10秒，迅速在烫伤区域皮下注射铜绿假单胞菌造成致命性感染，即在感染后20小时动物出现濒死状态。该模型已报道用于研究铜绿假单胞菌和肺炎克雷白菌的发病机制以及针对烫伤感染的多克隆免疫球蛋白的局部传递。

（2） 气体火焰小鼠烧伤模型：

该模型使用8周龄的SCID小鼠，戊巴比妥麻醉后进行腹股沟到腋下剃毛。采用一个定制的绝缘模具（2.5cm×3.5cm小窗口）紧紧的贴于背部剃毛的小鼠背部，随后暴露该区域于气体火焰9秒。燃烧器配备火焰分散帽作为气体火焰源。通过此步骤可在体重约为26 g的小鼠中建立15%体表面积的Ⅲ度烫伤模型。以2×103 CFU剂量的甲氧西林耐药的金黄葡萄球菌感染烧伤小鼠完成建模。该类动物模型已报道用于研究甲氧西林耐药的金黄葡萄球菌的发病机制、粪肠球菌的转运机制、免疫缺陷小鼠热损伤和可溶性多糖免疫调节分子对抗烧伤感染的效果。

3. 预加热金属板烧伤感染模型

（1） 小鼠预加热双铜块烧伤感染模型：

采用六周龄的重25～30g的雄性CD1小鼠，结合铜块的面积为1.8cm×1.8cm，相当于5%的体表面积。用两个预加热的铜块（92～95℃）对背部剃毛小鼠相对两侧处理5秒，施以烧烫后，焦痂处迅速皮内注射总量为106CFU的铜绿假单胞菌。该建模方法同样适用于大鼠烧伤感染模型。

（2） 猪金属板烧伤感染模型：

猪麻醉后背部备皮准备，使用一个配备了20cm手柄的1cm× 1cm×3cm的铜板，在加热板上加热至150℃，将热铜板放在背部10秒，造成三度烫伤。15min后，用浓度为108CFU/ml的金黄葡萄球菌悬液1毫升均匀涂抹于烫伤表面。感染后24 小时，在未经治疗的烧伤部位细菌总数达2×109 CFU/g焦痂。该模型被稍加修改，已应用于创面愈合和烫伤感染的发病机制以及冲击和烫伤感染诱导的高代谢反应的研究。

（四）切除伤口合并感染动物模型

切除伤口部位由于愈合较慢，暴露几率增加，因此也常易导致感染的发生。切除创伤由切除较大的组织引起，通常感染较复杂且愈合较长。切除创伤感染模型中用到的动物主要有小鼠、大鼠、猪和兔，研究的微生物主要包括金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌。切除创伤通常发生在切除手术后，切除创伤感染动物模型要感染大量的细菌。该类模型建模通过控制切除面积和深度、感染病原体的种类和数量实现稳定可重复性建模，适用于各种切除创伤感染的发病几率以及疗效评价。

1. 小鼠切除创伤感染模型

雄性体重20～25g 的BALB/c 小鼠，氯胺酮-甲苄噻腹腔注射麻醉后背部剃毛。沿背部表面切8mm×12.5mm的全层皮肤切除伤口，伤口底部为脂膜层，且无可见出血。以5×106 CFU大肠埃希菌感染感染小鼠完成小鼠切除伤感染模型。该模型已被用用于研究抗菌药物和伤口愈合、壳聚糖醋酸绷带对伤口感染的影响、肽对感染伤口愈合的影响、细菌定植和诱导型一氧化氮合酶在小鼠伤口的表达等。

2. 猪表皮切除创伤模型

使用80磅左右的家猪，舒泰进行术前麻醉，手术过程中通过吸入异氟烷的方式使其保持麻醉状态。背部进行70%乙醇和碘伏消毒，全层皮肤切除（2.54cm×2.54cm），皮肤切除处涂布2×108CFU金黄色葡萄球菌。该模型广泛用于皮肤缺损修复以及局部抗感染用药的相关研究。