第一节 细菌感染性疾病的实验诊断方法
一、采集标本的基本原则
1.早期采集标本 最好在病程早期、急性期或症状典型期，并且最好在抗菌药物使用前采集标本。
2.无菌采集标本 采集的标本应保证无外源性污染。采集血液、脑脊液、体腔积液、关节液或封闭的脓肿等标本时，应正确消毒穿刺点表面皮肤或黏膜，用无菌操作抽取标本；已形成窦道的部位，应从窦道底部取活组织检查；与外界相通的腔道中流出的或挤压出的脓液或分泌物，应弃去前段标本，留取后段标本进行检查；对于从正常菌群寄生部位或附近采集的标本，如口咽部、鼻咽部和泌尿生殖道等部位应采取措施避免正常菌群和其他菌群的污染，并明确检查的目标菌。
采集的标本盛放在带盖的无菌容器中。无菌容器内不得含有抑制微生物生长的物质；容器宜采用高压蒸汽、干烤等方法灭菌，对于使用环氧乙烷灭菌的容器灭菌后必须放置足够长的时间后方可使用；不得使用消毒剂或酸类处理。
3.根据病程发展的不同阶段采集标本 如伤寒患者，发病全程可采集血液或骨髓，病程的第2～3周可以收集尿液或粪便；亚急性细菌性心内膜炎患者在抗菌药使用前24小时内需作3～5次血培养。
4.根据不同感染可能出现的病原菌采集标本 由于无法预知感染的是什么病原体，因此应根据流行病学资料和临床症状，尽可能多地考虑可能出现的病原体。某些感染性疾病具有明显的地方性和（或）季节性，应根据流行病学资料和患者接触史进行判断。不同感染部位如腹腔及其周围的感染、菌血症等至少应考虑需氧菌和厌氧菌混合感染，需要同时采集需氧和厌氧培养标本。常见细菌培养阴性，要考虑少见病原体以及特殊病原体的可能。
5.正确保存和运送标本 采集的标本，均含有病原体或潜在的病原体，容器应密封不易碎，不得污染容器的口和外壁。应及时运送，防止标本干涸。
6.安全采集标本。
采集血清用于抗体的测定。病程早期可以测定IgM抗体，由于抗体的产生需要应答过程，因此早期抗体检测可能阴性，此时应在-20℃以下保存该份血清。在病程的2周后或恢复期再采集血清，与先前保存的血清同时测定抗体，如果抗体滴度有4倍以上的升高可以确定感染诊断。
需要在病原体感染部位采集，避免其他病原体污染。
二、标本的采集方法
正常人的血液是无菌的。当细菌侵入时可引起严重的菌血症或败血症。一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；对持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症由于菌血症时间短，应预测其体温上升期进行采血。一般在抗菌药物使用前采集2～3次，对已使用抗菌药物又无法停止使用的患者，应在下次用药前采取。
采血的部位应彻底消毒。一般采集肘静脉，宜多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取，可以排除污染并提高阳性率。现多提倡双侧双瓶抽取血液标本。或在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。成人采血量一般5～10ml，婴幼儿1～3ml。采集的血液标本用无菌技术注入装有血液增菌培养基的培养瓶中先进行增菌培养。怀疑有厌氧菌感染时，应抽取血液同时注入需氧培养瓶和厌氧培养瓶中。厌氧培养基通常采用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等作为增菌培养基，培养瓶密封，将瓶中空气用90%N2、10%CO2替换，形成无氧环境，在培养液中加入刃天青作为指示剂，无氧时无色，有氧时呈红色应弃去不用。无论是否接种标本，血液培养瓶都不得冷藏。
若已长期使用了作用于细胞壁的抗菌药物，应考虑细菌L型感染，将血液接种于高渗培养基中，分别放置在需氧、厌氧和5%CO2环境中培养。
正常情况下上呼吸道有正常菌群存在，进行普通培养无特别意义。一般采取咽拭子和鼻咽拭子。
将舌向外拉充分暴露口咽部位，用生理盐水湿润的棉拭子在咽部轻轻涂抹；疑为白喉患者时，应在可疑白膜边缘取分泌物；化脓性扁桃体炎时应先清洁扁桃体表面的脓液，然后另取干净棉签，挤压扁桃体，取扁桃体窝流出的脓液作为标本。
用生理盐水湿润的金属棒的弯曲棉拭子绕过悬雍垂，到达鼻咽部位涂抹。常用于鼻咽部位脑膜炎奈瑟菌携带者的检查。
正常情况下下呼吸道无细菌或仅有少量细菌侵入，但很快被清除。下呼吸道标本采集时应防止被上呼吸道的正常菌群污染。常采集的标本包括痰液、支气管肺泡灌洗液和纤维支气管镜刷检。由于痰液的排出通过气管、咽喉和口腔，表面会黏附上呼吸道的寄殖菌，给判断病原菌带来困难。因此，标本的正确采集和处理非常重要。
痰液标本以采集晨痰为好。可让患者先用无菌生理盐水漱口3次后自行咳痰；痰液黏稠或咳痰困难者，可雾化吸入后再咳痰；儿童可加以轻叩胸骨诱发咳嗽；对支气管扩张症或与支气管相通的肺空洞患者，清晨进行体位引流可获得较多的痰液。也可用环甲膜穿刺法、纤维支气管镜下用毛刷取呼吸道分泌物或收集支气管肺泡灌洗液。采集后需要观察标本的性状，选取脓性、血性的部分作为细菌检验标本。痰液标本中如发现有颗粒、菌块及干酪样物，可能是放线菌或真菌感染。有异常恶臭，可能与厌氧菌感染有关。
正常人的尿液是无菌的。但在前尿道及尿道口有正常菌群和过路菌（如大肠埃希菌、葡萄球菌等）存在，而后者又是常见的尿路感染病原菌，容易混淆。因此正确采集尿液，避免其他菌群的污染是尿液细菌检验正确与否的关键。由于很多抗菌药物或代谢产物通过尿液排泄，因此必须在抗菌药物使用前采集；女性月经期间容易污染，不宜采集。尿液的标本采集方法：
采集前用肥皂水清洗外阴和尿道口，再用灭菌水冲洗，无菌纱布擦拭。男性可直接排尿，用无菌容器留取中段尿10～20ml。女性则需用手将阴唇分开后排尿，用无菌容器留取中段尿10～20ml。
为确定尿中细菌来自肾脏，在膀胱镜下将导尿管插入两侧输尿管内，分别收集。
一般用于厌氧菌培养的标本采集或不能正确留取中段尿而又需确定诊断的儿童。在耻骨联合上对皮肤进行消毒，用无菌注射器作膀胱穿刺抽取5～10ml膀胱内尿液。
正常人的脑脊液是无菌的。从脑脊液中检出细菌均应作为病原菌看待。以无菌方法采集脑脊液3～5ml，分别置2支无菌试管中。由于脑脊液中常见的致病菌如脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌等能产生自溶酶，离体后迅速死亡，因此脑脊液标本采集后应立即送检或床边接种。此类病原菌对温度较敏感，在周围环境温度较低情况下，应35℃保温运送。
肠道内有多种种类和数量庞大的正常菌群，因此粪便标本中也包含有大量的正常菌群，通常需要使用选择性培养基分离致病菌。引起肠道致病的细菌种类众多，有强烈致病的沙门菌属、志贺菌属、霍乱弧菌、肠出血性大肠埃希菌等；能引起一般腹泻或食物中毒的副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌等；引起二重感染的常见病原菌如金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、真菌等。对于这些菌属的分离根据其不同的特点选用不同的方法。此外，菌群失调和菌交替症亦可引起腹泻，对正常菌群的种类和比例的检查是不可或缺的。
标本的采集：粪便标本于急性腹泻期及未使用抗菌药物前采取自然排出的粪便，挑选黏液、脓血部分2～3g，液体粪便1～2ml，置无菌容器中，或置于保存液或增菌培养基中。对排便困难者或婴幼儿可用肛门拭子法。不能立即送检的标本应放入Cary-Blair运送培养基中。自行排出的粪便标本不适用于厌氧菌培养。
正常的内生殖器官应是无菌的，但外生殖器可有正常菌群的存在，如男性尿道口、女性阴道等部位有葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌、大肠埃希菌、分枝杆菌、厌氧菌、真菌等存在。主要的致病菌有淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体等。在菌群失调时可发生如真菌性阴道炎、细菌性阴道炎或尿道炎等感染性疾病。
由于解剖结构的不同，男性和女性的生殖道标本采集方法有所不同。
用无菌纱布或棉球清洁尿道口，擦去尿道口自行流出的脓液，然后从阴茎的腹面向龟头方向按摩，使脓液流出，用无菌棉签将脓液采集在无菌试管中。采集前列腺标本，需要由临床医师从肛门进行前列腺按摩，收集前列腺液进行检验。
在阴道扩张器辅助下，分别用3支生理盐水湿润的无菌棉签直视下采集阴道后穹窿分泌物或宫颈黏液。1支作直接涂片用于常规检查；1支置无菌生理盐水管中用于检查滴虫；1支放入无菌试管中，用于常规细菌培养及抗原检查。盆腔脓肿的患者应消毒阴道后，从后穹窿穿刺抽取脓液，分别做需氧和厌氧培养。采集子宫分泌物常用双套管的方式插入子宫腔吸取分泌物。在周围环境温度较低情况下，应35℃保温运送。
对外阴部位硬下疳的表面先用无菌生理盐水清洁，除去表面的脓痂，从其溃疡底部挤出少许组织液，以洁净玻片直接蘸取，加盖玻片后送检。
封闭性脓肿可在消毒脓肿表面皮肤或黏膜后，直接穿刺抽取脓液后注入无菌试管中；开放性脓肿或瘘管，应清洁表面，从深部采取标本；对大面积烧伤或创伤的患者，应采集多个创面的分泌物标本；胸、腹水通过胸腔或腹腔穿刺获得，注入无菌试管中送检。
厌氧菌是对氧气敏感的一类细菌，在有氧气的环境中不能生存或生存极差，而且多数厌氧菌是机体内正常菌群的一部分。因此怀疑厌氧菌感染时标本的采集需要特别注意：①应尽量避免接触空气；②不被正常菌群污染。
采集厌氧菌培养标本原则上应从无正常菌群寄居的部位采取，对穿刺点进行消毒后，无菌操作抽取血液、关节液、心包液、腹、胸腔积液和膀胱穿刺液等标本；封闭性脓肿用注射器抽取；可通过纤维支气管镜保护性毛刷或支气管肺泡灌洗从支气管、肺中获取呼吸道分泌物或经支气管肺活检获取肺活组织；子宫腔分泌物采用双套管宫腔镜采取。
采集的标本应立即排空注射器内的空气（应在针头上包裹乙醇棉球），立即将注射器针头插入无菌橡皮塞中以隔绝空气，运送至实验室；最好将标本立即注入密封的无氧小瓶中，瓶中装有0.5ml厌氧培养基，并含有氧气指示剂刃天青，无氧气时不显色，小瓶内液体呈现淡黄色或无色。小瓶内液体显示粉红色表示有氧气，不能使用。也可在床边直接接种至预还原的培养基中，放入厌氧袋，打开气体发生装置，密封后运送至实验室。
以下标本不宜做厌氧菌培养：鼻咽拭子、咳出的痰液及气管抽取物、胃和肠道内容物、肛拭子、自行排出的尿液及导尿、阴道及子宫拭子、前列腺分泌物、褥疮溃疡及黏膜层表面拭子、皮肤和黏膜拭子等。
三、直接涂片显微镜检查
将患者标本直接涂布在干净的玻片上作染色，用显微镜检查是简便而快速的方法之一，但并不适用于所有标本。通过直接检查可以观察细菌的形态特征及可能存在的细菌数量，也可以通过免疫学方法直接检查相关病原体的抗原获得诊断。
流行性脑脊髓膜炎患者的脑脊液和瘀斑组织液涂片，革兰染色常可显示在细胞内的革兰阴性肾形双球菌，可报告“脑脊液中找到细胞内的革兰阴性肾形双球菌，疑似脑膜炎奈瑟菌”，或用脑膜炎奈瑟菌抗体包被的乳胶凝集试验，凝集阳性有诊断价值。通过革兰染色还可以发现其他革兰阳性和阴性细菌。在对脑脊液进行革兰染色时，有些革兰阳性的细菌如肺炎链球菌被白细胞吞噬后，可转变为革兰阴性，需要加以鉴别。此外，还可通过对脑脊液墨汁负染，在黑色背景中观察到折光性很强的菌体和周围似晕轮样的宽大透明荚膜，有时可见到生芽的新型隐球菌。可用0.1%甲苯胺蓝染色将小荚膜的新型隐球菌与白细胞区别，新型隐球菌菌体呈红色，白细胞深蓝色，红细胞不着色。抗酸染色可发现抗酸杆菌。涂片检查还可以发现寄生虫等病原体。
口咽和鼻咽部位存在大量的正常菌群，进行普通涂片染色难以鉴别致病菌。怀疑白喉患者，咽部假膜涂片可用异染颗粒染色法，可见大量典型的棒状杆菌并可见异染颗粒，有参考诊断价值。怀疑鹅口疮等二重感染时，直接涂片革兰染色可见大量真菌孢子可诊断。
标本涂片用革兰染色后可以检查标本采集是否合格。低倍镜下观察如白细胞＞10个/1个视野，上皮细胞＜10个/1个视野，被视为“合格”标本，可以涂片观察标本中的细菌给予报告，但不能确定菌种；上皮细胞过多说明标本来自口腔，应重新留取。标本中有黄色颗粒或不透明颗粒，则将标本洗涤后挑取颗粒作2张涂片，分别革兰染色和抗酸染色。如发现有革兰阳性，中央为菌丝团，周围呈放射状排列，抗酸染色阳性或弱阳性，可能是放线菌或奴卡菌感染；如果菌体大小不一致，或菌体粗大，或有芽胞发现，结合标本恶臭等情况，可能是厌氧菌感染；另外还可发现如曲霉、隐孢子菌等真菌。
粪便标本普通涂片染色没有意义。在怀疑菌群失调或二重感染时可以涂片或取伪膜样粪便，革兰染色观察菌群分布的大致情况，如发现大量的革兰阳性球菌，或大量粗大杆菌，或大量真菌孢子可确定诊断。在怀疑霍乱时，可取“米泔水”样便或肛门拭子，用复红单染，可见大量“鱼群样”排列的弧形细菌，具有参考诊断价值。也可制成悬滴片，观察动力，如有穿梭样运动发现，同时用霍乱弧菌O1群抗血清与标本混合后发现运动消失，此为制动试验阳性，可初步报告“疑似O1群霍乱弧菌”。怀疑肠结核，可取粪便标本差速离心后，抗酸染色找抗酸杆菌。
尿液标本的直接涂片由于受到前尿道及尿道口寄居菌的影响，不能确定致病菌。对男性患者的尿液、尿道分泌物或脓液，可直接涂片检查，或将尿液离心后取沉淀涂片检查，发现有革兰阴性双球菌位于细胞内，可报告“疑似淋球菌病奈瑟菌”。怀疑结核分枝杆菌感染的患者可以留取晨尿或24小时尿液，离心浓缩后抗酸染色检查。
女性生殖道分泌物标本常规湿涂片可以观察阴道清洁度，并可以发现真菌、阴道毛滴虫等病原体以及“线索细胞”等提示感染存在的细胞形态；疑为淋球菌感染时可对涂片进行革兰染色，可以发现革兰阴性双球菌，但特异性不高。硬下疳溃疡分泌物涂片在暗视野显微镜下可以发现螺旋体。
四、病原菌分离
由于无法预知感染的病原菌，有许多病原体引起的临床表现基本相像，而有时病情紧急只能提供一份标本，因此要求实验室工作人员必须考虑尽可能多的病原体存在，结合临床表现，同时采用多种手段分离可能的病原体。
怀疑菌血症必须要进行血液细菌培养。由于受到血液中细胞的影响，直接从血液中分离细菌比较困难。通常将血液先在血液增菌培养基中增菌培养后再行分离。为了满足病原菌的生长要求，最好选用胰大豆胨肉汤作基础，添加生长因子如Ⅴ、Ⅹ因子等。为了有效抵抗血液中残存的抗菌物质，选用聚茴香磺酸钠作为抗凝剂，添加对二甲氨基苯甲酸、硫酸镁等拮抗抗菌药物的活性；必要时添加青霉素酶。接种了血液的标本瓶应尽快放入35℃孵育箱，并加以缓慢摇动促进生长。有阳性报警或人工观察有可疑细菌生长现象时，必须尽快涂片进行染色，报告细菌的形态和染色性；同时将标本转种至固体培养基上进行分离。培养瓶人工观察3天未见细菌生长也应转种一次。培养瓶孵育7天后仍未见生长，应再次转种，确认无菌生长后报告“血液需氧细菌培养7天未见细菌生长”。
为了有效分离培养瓶中的细菌，根据涂片检查的结果应转种血平板、巧克力（色）平板、EMB平板等多种平板，并分别放置需氧环境、5%CO2环境中35℃孵育。
最好同时进行厌氧菌的检查，将抽出的血液标本排出空气后立即注入厌氧培养瓶中。如有可疑生长情况，立即接种预还原的厌氧血平板，放入厌氧环境35℃孵育48小时，同时接种血平板放入需氧环境孵育。如果厌氧血平板上生长，而需氧环境中没有生长，则报告“厌氧菌生长”。
需要接种血平板、流感嗜血杆菌选择性平板、EMB平板或麦康凯平板，必要时增加沙保弱琼脂或念珠菌显色平板。检查百日咳鲍特菌应将标本直接接种在鲍-金（Border-Gengou）平板上；白喉棒状杆菌应直接接种吕氏血清斜面或鸡蛋培养基，同时接种亚碲酸钾血平板；脑膜炎奈瑟菌带菌者的检查，应将鼻咽拭子35℃保温运送，尽快接种在35℃预温的卵黄双抗平板上，置3%～5%CO2环境中24小时后观察菌落生长情况。对化脓性A群链球菌的分离，可以使用血平板，在标本接种原始区贴一张0.04U的杆菌肽纸片作为A群链球菌存在的指示。
由于上呼吸道正常菌群的存在，需要观察血平板细菌的生长情况。如为上呼吸道的正常菌群，且比例大致正常，则报告“未检出致病菌”；如果某一种菌群明显占多数或接近纯培养，应考虑该菌与疾病有关，鉴定后报告。有时采用半定量计数的方式报告，表示菌群中某种细菌所占的比例，作为诊断时参考。
怀疑细菌性痢疾或伤寒的急性期患者取粪便标本或肛门（直肠）拭子直接接种肠道强选择性培养基（SS琼脂、木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂）和弱选择性培养基（如Mac Conkey、EMB、中国蓝琼脂）平板各1个，35℃需氧培养18～24小时。这些培养基以乳糖作为指示，肠道致病菌一般不发酵乳糖，因此不发酵乳糖的无色菌落即为可疑致病菌菌落。病原携带者的检查，可将粪便标本接种于GN增菌液（适用于沙门菌属和志贺菌属）和亚硒酸盐或四硫磺酸盐增菌液（适用于沙门菌属）35℃孵育18～24小时后，将GN增菌液转种于肠道强选择性培养基，而亚硒酸盐或四硫磺酸盐增菌液接种于弱选择性培养基上，35℃需氧培养18～24小时。
可疑霍乱患者，取“米泔水”样便或已接种于保存液中的粪便标本0.5～1ml，或肛门（直肠）拭子接种于碱性蛋白胨水中进行35℃增菌，同时接种TCBS琼脂平板或含糖双洗平板、庆大霉素琼脂平板、4号琼脂平板。碱性蛋白胨水增菌管培养6小时后，取增菌液表层菌膜移种于上述平板中进行分离培养，同时取增菌液作革兰涂片染色和悬滴法动力试验及制动试验，阳性者及时报告。
怀疑副溶血性弧菌感染，取可疑粪便（或可疑食物）接种于副溶血性弧菌增菌液中，同时划线接种于副溶血性弧菌选择性平板和SS平板上，35℃18～24小时培养后观察菌落生长。副溶血性弧菌增菌管孵育16～18小时后移种至上述平板中35℃18～24小时培养后观察菌落生长。
引起肠道致病的大肠埃希菌有5型：肠致病型大肠埃希菌（EPEC）、肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）、肠毒素型大肠埃希菌（ETEC）、肠出血型大肠埃希菌（EHEC）和肠凝聚型大肠埃希菌（EaggEC）。取可疑粪便标本接种在中国蓝平板（或Mac Conkey平板或EMB平板），35℃18～24小时，挑取5～10个乳糖发酵菌落，确认为大肠埃希菌，用EPEC、EIEC的多价抗血清进行凝集；疑为ETEC则采用改良Elke法测定LT，用乳鼠灌胃试验测定ST。对怀疑EHEC感染的患者标本，应接种在山梨醇麦康凯琼脂平板，挑选山梨醇不发酵的菌落，用抗血清鉴定血清型。
怀疑小肠结肠炎耶尔森菌感染，将可疑粪便同时接种于新耶尔森菌选择培养基（NYE）、Mac Conkey及SS琼脂平板，35℃48小时后选择无色、透明或半透明、较小菌落进一步鉴定。带菌者可将粪便或肛拭子接种于1/15mol/L pH 7.4～7.8的PBS中，在4℃进行冷增菌，在第7天、14天和21天取增菌液分别接种上述平板培养分离和鉴定。
疑为空肠弯曲菌感染，取可疑粪便或在Cary-Bair运送培养基中的粪便标本接种于Camp-BAP血琼脂或Skirrow血琼脂，或接种于CEM增菌液在微需氧环境下培养18～24小时后接种上述平板，在微需氧环境下培养42～48小时后，观察平板菌落生长情况。
为了区别污染菌和病原菌，采用倾注培养法和定量接种法进行尿液菌落计数。一般认为中段尿液中的菌落数＞105/ml为真性细菌尿，＜104/ml可能为污染菌，104～105/ml为可疑阳性需重新复查，如仍为同样结果，则应视为病原菌。尿量、尿液在膀胱中停留的时间及使用利尿剂等会影响尿液菌落计数的结果。
普通尿液培养一般接种血平板和EMB（或Mac Conkey平板），或CLED平板。需氧环境培养18～24小时后，根据菌落计数结果确定病原菌，再根据细菌特性进行鉴定。
尿液中细菌L型较为常见，特别是在使用了抗细胞壁类抗菌药物后。可同时接种细菌L型平板，置5%～10%CO2环境培养。
硝酸盐还原法、氯化三苯四氮唑（TTC）还原法、尿中抗体包被细菌法和产色培养基法等方法可以快速提示尿液细菌感染的存在。
收到脑脊液标本后应立即接种在35℃预保温的血平板和巧克力平板上。床边接种时直接将脑脊液滴入上述平板中。置5%～10%CO2环境35℃培养18～24小时，观察菌落生长情况，根据菌落特征和涂片染色结果进行进一步鉴定。脑脊液标本一般经3天培养仍未见细菌生长，可报告“经3天培养无细菌生长”。
五、病原菌的鉴定
根据分离培养基平板上的细菌菌落特征，将病原体鉴定到种的水平，有时需要鉴定亚型或血清型。病原菌的鉴定主要有以下内容：
菌落大小、颜色、菌落类型（光滑或粗糙）、透明度、边缘情况等；平板上的特征如溶血、迁徙等；选择性平板上的特征性反应如乳糖发酵情况等。
革兰染色阳性、阴性；球菌、杆菌等。
细菌的营养、气体、温度等生长要求，各种碳水化合物的代谢试验，蛋白质和氨基酸代谢试验，碳源和氮源利用试验，各种酶类试验，抑菌试验等。
如白喉毒素、ETEC的肠毒素（LT、ST）、金黄色葡萄球菌的肠毒素等。
用特异分型血清进行鉴定如沙门菌属、志贺菌属的分型鉴定。
针对16SrRNA的种特异编码基因或细菌具有的毒力编码基因等。
将可疑病原菌感染敏感动物，观察动物发病情况以及从感染动物体内分离病原菌。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。仪器主要由基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）两部分组成。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离。适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子，形成不同的指纹图谱。通过建立各种已知微生物的标准指纹图谱，将待测微生物的蛋白质指纹谱图与数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱进行比对，可对微生物进行分类鉴定。
六、检测细菌的特异性抗原及抗体
利用各种检测抗原的敏感方法，如对流免疫电泳、放射免疫、酶免疫、发光免疫、胶乳凝集以及胶体金标记等方法，直接从患者标本中检测细菌抗原作快速诊断。如在细菌性脑膜炎中，利用特异性抗体包被胶乳颗粒，检测脑脊液中可能存在的肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等细菌的抗原，特异性好，敏感性高。检测抗原的方法可以在抗菌药物使用后，细菌生长被抑制，此时培养方法不易检出细菌，但仍可在短期内检出抗原的存在，从而有助于明确病因。
在某些细菌感染性疾病（如梅毒、军团菌病等）中，当出现临床症状时病原体仅短时间内存在或分离病原体较为困难；或由于细菌感染后出现了变态反应（如溶血性链球菌、耶尔森菌、衣原体等感染后的关节炎等），出现临床症状时不太可能分离到病原菌。此时可通过抗体检测来确定诊断。人体受病原菌感染后，经一定时间的免疫应答产生抗体，抗体的量随病原菌感染过程而增多，表现为抗体滴度升高。因此用已知的细菌或抗原检测患者体液（主要为血清）中有无相应抗体及抗体量的动态变化，可辅助诊断。一般采用血清进行试验，故又称为血清学试验。
血清学试验通常测定血清中抗体的滴度。所谓滴度是抗体的半定量测定，是指能检测到抗原抗体反应的最高血清稀释度。不同的测定方法的滴度不具有可比性。正常人如已经受过某些病原菌隐性感染或近期进行过预防接种，血清中可能含有对该种病原菌的一定量的抗体，因此必须有抗体滴度升高或随病程递增才有参考价值，可作为间接检测病原体的筛选试验。大多数血清学试验的诊断需取患者双份血清，即一份在疾病的急性期，另一份在恢复期（一般为病程的第2～6周后），当抗体滴度升高4倍以上方有诊断价值。此外，补体结合试验和间接血凝试验也是常用的方法，单份血清测定的结果对于判断急性或既往感染的存在和持续时间、是否早期感染的作用有限，主要为恢复期的回顾性诊断。检测结果阴性不能排除急性感染的存在。
七、检测细菌遗传物质
通过检测病原体遗传物质来确认病原体也许是检查病原体最为直接快速的方法了。目前比较成熟的技术包括基因探针技术和PCR技术，主要针对细菌的16SrRNA和一些特有基因进行检测。但对检出的结果需要谨慎对待，解释需要有临床症状的支持，特别是在有正常菌群寄居的部位检出的结果。
用标记物标记细菌染色体或质粒DNA上的特异性片段制备成细菌探针，待检标本经过短时间培养后，经过点膜、裂解变性、预杂交和杂交后，利用探针上标记物发出的信号可以知道杂交结果并判断病原体的性质。
这是20世纪80年代末发展起来的一项技术，针对病原体的特异基因设计的特异引物，细菌标本（不经培养或培养后）经过简单裂解、变性，就可在反应缓冲液中进行扩增反应，在PCR仪经过25～30个循环后，通过琼脂糖电泳即可观察扩增结果，检出病原体。现在已通过实时荧光定量技术可以对标本中病原体的基因数量进行定量分析，提高了检测的灵敏度和可靠性，尤其适用于那些培养时间较长的病原体的检查，如结核分枝杆菌、支原体等。PCR高度的敏感性使该技术在病原体诊断过程中极易出现假阳性，避免污染是提高PCR诊断准确性的关键环节。
近几年来，等温扩增技术和新一代DNA测序技术也得到了一定的应用。