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第三节 全血及其成分的病毒去除
全血及其成分的病毒去除工艺及方法较多,包括专门的和非专门的。非专门的方法如物理或化学沉淀、过滤与深度过滤、洗涤、层析、透析等,在去除病毒方面都有不同程度的作用。全血及其成分的病毒去除方法主要有纳米膜过滤法、这是为去除病毒而研发的专门去除病毒的方法。
一、纳米膜过滤
(一)原理
1.纳米膜过滤(也称病毒过滤),薄膜孔径在15~50nm之间。在纳米膜过滤中,大于滤膜标称孔隙度的病毒或病原体截留在薄膜上,而较小或较软的组分(如血浆蛋白)则通过滤膜存留在液相中。
2.纳米膜对HIV、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、伪狂犬病毒(PRV)、犬细小病毒(CPV)、脑心肌炎(EMC)病毒、HAV的过滤效率分别为>7. 0Log、>5. 9Log、>6. 2Log、>5. 9Log、>7. 3Log、>5. 9Log。
(二)作用
1.纳米膜过滤是表面直径较小病毒如甲型肝炎病毒(HAV)和细小病毒B19最有效的去除方法,是有效增强非包膜病毒去除的常用方法。此外,有报道通过15nm甚至35nm的纳米膜过滤,可去除3~5个log范围内的朊病毒。
2.纳米膜过滤可较好地保留血浆蛋白的完整性与生物学活性,蛋白质活性的回收率可达90%~95%,并且还未发现存在生成新抗原的风险。
(三)方法与注意事项
1.随着流经纳米膜过滤器的蛋白质溶液增多,病毒穿过滤器的风险将增大(尤其是病毒大小接近过滤膜孔径大小时),应注意控制纳米膜过滤的压力、速度与温度。
2.使用较大孔径(如35nm)的滤膜不能过滤除去比它小的病毒;但如使用较小孔径(如15nm)的滤膜时,一些分子比它大的血浆蛋白分子(如Ⅷ因子),因不能滤过而损失。
3.当过滤一段时间后,部分孔径堵塞,使过滤流速减慢,如操作不当还会影响病毒过滤消除效果。所以,不能单独依靠膜过滤技术保证病原体的过滤清除效果,应与其他方法联合使用,如结合S/D法或巴氏消毒法、加热法等。还应使用过滤器(如75nm)过滤待处理的蛋白质溶液,以去除病毒复合物。
4.纳米膜过滤主要在目标蛋白纯化之后,除菌过滤之前应用;在去除非包膜病毒方面具有较高的可靠性。膜过滤技术验证研究时应考虑蛋白溶液的浓度、滤速、压力和过滤量等重要参数;在过滤前及过滤后应测试滤膜的完整性。
二、去除白细胞
(一)去除白细胞的方法
去除白细胞的方法有离心法、洗涤法与过滤法,血站常用过滤法。即利用白细胞体积大于白细胞过滤器平均孔径或网间隙而被拦截与吸附载留以滤除。方法是:全血于采集后在适当时间内离心,以无缝接驳法或连袋法在一定恒温条件与速度下过滤去白细胞,所得制品置转移袋经热合封口包装后置于适当温度贮血冰箱保存备用。
(二)去除白细胞的作用
1.过滤白细胞并不是为去除病毒而研发的专门去除病毒的方法,但是在去除病毒方面有积极与重要的作用,因为在去除白细胞的同时也减少或降低了病毒在血液中的含量。
2.过滤白细胞可去除细胞内外的病原体,如CMV、HTLV和部分朊病毒(prions)等。通过白细胞过滤器能去除大约50%的prions。使用高效去白细胞滤器,可以使制品中白细胞感染的HIV滴度低5. 9log。
(三)注意事项
1.过滤白细胞并不是以达到病毒去除为目的,但过滤白细胞可以使血液进一步纯化,对输血安全起积极作用。
2.过滤法去除白细胞存在膜(网)孔被堵塞、膜(网)表面形成黏性附层、血凝块与血液黏稠度等都会影响有效过滤面积和膜(网)通量的稳定性。过滤时的温度、速度与压力也会影响白细胞及其病毒去除效果和产品质量。