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第五节 病毒灭活效力的评估
为了保证血液成分中病原体灭活的效果，必须对选用的病原体灭活的方法、灭活病毒滴度测定和临床应用效果进行评估。
一、病毒灭活方法的评估
（一）评估依据
1.安全、有效是评估病毒灭活方法的主要标准与基本要求，病毒灭活效果应符合这些要求。
2.我国《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则的通知》（国药监注［2002］160号）规定，病毒降低量（log10）≥4logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效；如因检测方法造成病毒降低量＜4logs时，应盲传三代，如无病毒检出，方可认定是有效的灭活病毒方法。
（二）评估方法
1.病毒灭活方法从技术路线和工艺内容上评估可分为方法学评估、工艺流程评估、设备设施评估、材料评估、基本参数评估（如浓度、温度、光照度、纯度、速度、酸碱度、混浊度、压力、时间等）等。
2.定期评估与经常性评估和使用前使用后评估相结合，单方法与多方法评估相结合。评估要准确和留有足够的效力以确保病毒灭活效果与安全。
（1）巴斯德消毒法和S/D法得到美国食品和药品管理署（FDA）批准，是在世界范围内被广泛用于实际生产的成熟技术，若经改进后用于全血浆和单人份血浆的病毒灭活，其具体方法需要评估。
（2）即使白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的，其病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证。但是必须对巴氏消毒法所用设施进行验证，使巴氏消毒各参数符合要求（包括制品内温度分布的均一性和灭活时间）。
（3）由于制品的组成、稳定剂（如氨基酸、糖、枸橼酸盐等）及其浓度的不同，均会对灭活病毒效果有一定的影响。
（4）病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。
（5）膜过滤法在过滤前及过滤后应测试滤膜的完整性，该方法应与其他方法联合使用。同样的病毒灭活方法对不同的血液或血液制品的病毒灭活效果要验证评估。同样的血液或血液制品采用同一种病毒灭活方法，在使用某种不同材料（如保护剂）、设施（如消毒柜）与参数（温度、时间）条件下要验证与评估；在相同材料、设施与参数条件下也要经常验证评估这些条件的稳定性和可靠性。
（三）评估作用
1.病毒灭活方法的评估是为了病毒灭活能达到或满足预期的目标与要求，并始终保持在这些验证与评估的合格范围内，制品的批间与瓶间各参数误差在允许的合格范围内，各种参数与参数变化的幅度在允许的合格范围内。
2.好的病毒灭活方法及其工艺应具有安全性、有效性、可靠性、可控性、稳定性、易放大性和经济性的特点，能满足人类社会明示的和隐含的需求。
二、病毒灭活效果的评估
病毒灭活效果的评估主要包括以下方面内容：指示病毒的选择、评估方案的设计、评估的观察指标和评估结果的判定。病毒灭活效果的评估应符合国家药品监督管理局《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》（国药监注［2002］160号）等有关规定。
（一）指示病毒
血液或血液制品污染的病毒可能有多种，有的可能是人们已经认识的，而有的如今还未被认识。并且大小、结构、品种和数量各异。因此，指示病毒的使用与选择就尤其重要，要求如下：
1.应该选择经血液传播的相关病毒（如HIV、HBV与HCV），不能用相关病毒的，要选择与其理化性质尽可能相似的指示病毒。
2.所选择的病毒理化性质应有代表性（病毒大小、核酸类型以及有无包膜），其中至少应包括一种对物理和（或）化学处理有明显抗性的病毒。
3.指示病毒滴度应该尽可能高（病毒滴度应≥10 6/ml）。
4.指示病毒（模型病毒）应该能在细胞培养中生长并获得高滴度，而且容易检测。
5.所选择的指示病毒至少应包括HIV-1、HBV和HCV模拟病毒以及非脂包膜病毒。
6.指示病毒的选择应符合国家药品监督管理局《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》（国药监注［2002］160号）等有关规定。例如，以鸭乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）用作HBV的模型病毒，以牛腹泻病毒（BVDV）与辛德比斯病毒（Sindbis virus）用作HCV的模型病毒，以脊髓灰质炎病毒（poliovirus）和脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）用作HAV的模型病毒，以猪细小病毒（PPV）用作人类细小病毒B19的模型病毒，水疱性口炎病毒（VSV）耐受的pH范围比较广，验证低pH孵放法灭活病毒效果时可选用此指示病毒。
（二）方案设计
病毒灭活效果评估和验证应注意以下内容和要求：
1.去除/灭活病毒验证研究应符合GLP的要求。
2.研究影响去除/灭活病毒效果的参数（包括机械参数和理化参数）允许变化的幅度。
3.研究病毒灭活动力学，包括病毒灭活速率和灭活曲线。
4.指示病毒滴度应该尽可能高（病毒滴度应≥10 6/ml）。
5.加入的病毒与待验证样品体积比不能高于1∶9。
6.如可能，验证过程中每步取出的样品应尽快直接进行病毒滴定，不做进一步处理（如超离心、透析或保存、除去抑制剂或毒性物质等）；如果样品必须做进一步处理，或不同时间取出的样品要在同一时间进行测定，应考虑这些处理方法对病毒检测结果的影响。
7.检测方法可包括蚀斑形成、细胞病变（如合胞体或病灶形成）、终点滴定或其他方法。这些方法应该有适宜的灵敏度和可重复性，每一个取样点应取双份样品并设有对照以保证结果的准确性。
8.如果制品的生产工艺中包含了两步或两步以上病毒去除/灭活方法，应该分别进行病毒灭活效果验证。
（三）观察指标
观察指标应包括以下方面内容：
1.病毒方面
（1）去除/灭活病毒滴度。
（2）灭活病毒速率、灭活曲线。以列表和做图形式报告验证结果。
2.病毒去除/灭活各参数允许变化范围。
3.蛋白质方面
（1）制品质量应符合《中国生物制品规程》或《中华人民共和国药典》有关规定。
（2）采用适当方法测定蛋白质结构和功能活性的变化。
（3）如果采用新的去除/灭活方法（包括更换使用已认可的病毒灭活方法或国内外未曾采用过的病毒去除/灭活方法），需对蛋白质半衰期和新免疫原性进行研究。
（四）效果的判定
判断病毒去除/灭活的有效性须综合考虑，不能仅以病毒去除/灭活的量来确定。在确定有效之前，必须考虑如下因素，审慎评价每次验证结果：
1.验证试验所选择的病毒是否适宜，病毒验证的设计是否合理。
2.病毒降低量（log10）≥4logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效；如因检测方法造成病毒降低量＜4logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的灭活病毒方法。
3.病毒灭活动力学可更好的显示病毒灭活的效果。病毒灭活通常不是简单的一级反应。往往是起始反应速率快，其后变慢。如果病毒灭活速率随时间明显降低，表示该方法可能无效，或者残留的指示病毒对该灭活方法有抵抗力，说明该步病毒灭活方法无效。
4.病毒实际滴度为基础病毒、指示病毒与样品1∶9的比例混匀后零点取样的病毒滴度，通过与经去除/灭活病毒后的测定的实际病毒残留量的比较，作为该病毒去除/灭活方法（步骤）实际的灭活病毒的量。
5.病毒检测敏感度的限值。
6.效果的判定举例
（1）加入6logs病毒，剩余4logs病毒，可将去除/灭活病毒的log数计算在生产全过程中去除/灭活病毒总量之中，但是就此步（方法）去除/灭活病毒能力而言是无效的。
（2）加入6logs病毒，但由于制品本身的细胞毒作用使得检测灵敏度限值为4logs，仅证明除去2logs的病毒。在此种情况下需改变试验设计重新进行验证。
（3）加入6logs病毒，但仍可测定2logs的剩余病毒，且清除病毒的量可重复出，并不受工艺的影响，应认为是有效的去除/灭活病毒的方法。
（4）加入6logs病毒，之后未检测出病毒。但是由于检测灵敏度限值为2logs，仅能认为大约清除或灭活了4logs病毒。事实上可能≥4logs，因此应判定此方法清除的病毒量≥4logs。
（5）病毒灭活动力学是非常重要的观察指标。如巴氏消毒法（60℃，10小时），如果病毒残留量很快降到最低检出限度值，说明此方法灭活病毒效果很好。如果病毒灭活速率缓慢，在灭活结束时才达到最低检出限度值，不能认为是一个有效的病毒灭活方法。这就是说，评价验证结果不能仅考虑病毒降低量，同时也要考虑病毒灭活动力学。
三、临床应用的评估
血液或血液制品经病毒灭活/去除方法处理后的临床应用评估一般通过对患者相关疾病的疗效与安全性结合临床实验室检测结果进行，并与未经处理的或标准的血液或血液制品对比，在条件相当的情况下，评价病毒灭活/去除方法对血液或血液制品处理的效果。
（一）常用的评价指标和方法
1.安全性
（1）输血并发症或不良反应发生率。
（2）产生新的抗原抗体免疫反应。
（3）致癌致畸作用。
2.临床疗效
（1）用量与使用频次改变。
（2）疾病或症状改善。
（3）食欲与精神等状态好转。
3.临床实验室检查
（1）红细胞、血小板、凝血因子或血浆蛋白升高或降低。
（2）红细胞、血小板、凝血因子或血浆蛋白等体内回收率。
（3）红细胞、血小板、凝血因子或血浆蛋白等在体内的半衰期。
（4）血浆凝血酶原时间（PT）与活化部分凝血酶原时间（APTT）。
（5）蛋白质扩散系数、沉降常数和黏度的改变。
（6）血小板聚集、黏附功能等测定。
（7）红细胞浸透脆性试验与溶血试验等。
（8）血浆钾、钠离子含量测定。
（9）直接与间接球蛋白试验。
（10）血型检查与配血试验困难等。
（二）临床应用的评估举例
1. S-59处理的血浆和血小板制剂
临床试验表明，经S-59法处理的血浆可有效用于治疗先天性或获得性凝血功能障碍、TTP及逆转华法林引起的凝血功能异常。多中心的临床试验结果表明，34名凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ、ⅩⅢ和蛋白C先天缺乏患者的102次出血治疗，都有效地达到了止血目的，疗效及安全性与未经病原体灭活处理的FFR相当。
2. S-303处理的全血与红细胞制剂
42名健康自愿者，输注经S-303处理并保存35天的1份自身红细胞（15ml），很好耐受，24小时回收率大于75%，但与对照组相比，还是有显著性降低（83. 9±6. 1 vs 78. 7±5. 7； P＜0. 003）。
28名健康自愿者，献1单位全血经S-303处理并分成小份保存，并于献血后7、14、21和35天分4次回输，每次15ml。多次输注后未观察到针对性抗体产生，24小时回收率均大于75%。
10名健康自愿者，献1单位全血（500ml）经S-303处理并保存35天，然后全剂量回输，证明安全、有效。
3. PEN110（二元乙撑亚胺）处理的红细胞制剂
（1）PEN110病原体灭活处理后红细胞制品的Ⅰ期临床试验结果：
12名输注处理后的红细胞制品与未处理红细胞制品的对照临床试验结果显示：①溶血为0. 70%±0. 24%，略高于对照组；②未发现直接抗人球蛋白试验（DAT）阳性红细胞和ABO、Rh红细胞血型分型改变；③输注后24小时回收率和半生存期相似（分别为85. 0%±5. 0% vs 85. 9%±2. 7%和31. 9 天±8. 2天vs 32. 9天±3. 3天）。
（2）PEN110病原体灭活处理后红细胞制品的Ⅲ期临床试验结果：
与S-303的Ⅲ期临床试验结果一样，在输注PEN110病原体灭活处理后的红细胞制品后，它可以使长期需要输血的镰状细胞贫血和地中海贫血患者产生抗体，因此Ⅲ期临床试验被停止，未能最终被批准实际用于临床。
4.亚甲蓝光化学法处理的血浆
关于MB/可见光处理血浆的对比临床研究较少。然而，临床数据显示尽管vWF蛋白酶ADAMTS-13水平表面看似正常，但MB/可见光处理血浆比血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenia purpura，TTP）患者体内未处理过的血浆的疗效小。从而导致使用时TTP患者对血浆交换次数需求更多，对血浆体积的要求更大（485ml/kg vs 216ml/kg）。
5.维生素B 2光化学法处理的血浆与血小板
就毒性而言，维生素B 2被认为不具有致癌、诱变成致畸作用。它的LD 50超过10 000mg/kg。与S-59光化学法处理的血小板相比，维生素B 2光化学法处理血小板的临床试验无论是规模或数量都相对较小。有报道维生素B 2光化学法处理的血小板，保存5天后其功能性恢复和成活率，较标准血小板均有显著性差异，但仍符合相关指南规定的标准，能够满足临床需要，未出现不良反应。
6.工业化S/D处理全血浆
（1）S/D处理全血浆总体上是有效的：对于治疗遗传性凝血因子缺乏的患者，S/D处理全血浆有显著疗效；此外，S/D处理全血浆的应用可使输血引起的急性肺损伤（TRALI）的发生率减少；无证据表明残留S/D会产生免疫原性或不良反应，这从S/D处理纯化血液制品的大量临床经验中得到确认。
（2）有大量的研究证实，S/D-FFP的应用不会增加血浆输注量：用来治疗肝病、维生素K缺乏，或使用维生素K拮抗剂引起的继发性凝血功能障碍的效果，包括血浆输注量、凝血酶原时间（PT）＜15秒的患者比例及经输注血浆后停止出血的患者比例，与FFP治疗效果无显著性差异；另发现在治疗肝衰竭提高凝血因子水平及降低活化部分凝血酶原时间（APTT）方面，与FFP无显著性差异，在纠正PT和国际标准化比值（INR）方面，SD/FFP的效果更好。
（3）将S/D处理全血浆用于肝病、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）或纤溶亢进患者时，一些临床报告中出现了负反应；一般认为，其原因与某些抗凝蛋白和蛋白酶抑制剂的改变有关；此外，工业化S/D处理血浆在TTP和肝脏移植中心应小心使用。
临床应用的评估着重以安全、疗效好、适用为原则。安全包括短期效应、远期效应与临床应用的极限条件（如最大一次注射量或一生注射总剂量），体内性能可靠。疗效好也包括疗效明显、临床药学效率也要高、零风险并且疗效稳定。适用包括具有可操作性、容易与方便使用，使临床医院及其患者都容易接受，并方便运输与保存。确保输血安全与防止输血产生的任何次生危害。
（李聚林）