第二章　浆膜积液细胞学检查的操作技能

调查发现，积液细胞学检验技能普遍较低与不少医院缺乏专职积液细胞检查人员、缺少稳定的操作方法及统一的细胞识别标准等有关。如何提高浆膜积液细胞检验的操作技能，加强积液细胞的质量控制工作，现归纳如下几个方面：

抗凝管（anticoagulant tube）最好具有以下条件：试管为标有刻度并带有盖子的专用清洁塑料管（图2-1），试管内壁上涂有干粉EDTA-K ₂抗凝剂，一般抗凝的积液量8～10ml（图2-2）。

试管上醒目的刻度线能提醒医生应达到的送检量，保证每位患者抽取的积液量基本一致，这有利于评价方法的统一和涂片细胞分析的标准化。试管带有盖子能减少送检及处理过程中微生物的污染，也能避免标本之间的交叉污染。干粉抗凝剂可保证试管在长期存放过程中不长杂菌，有利于积液中的细菌观察；而各种液体抗凝剂因长时间放置，难免会有细菌生长，使检验工作者较难对涂片中的细菌、真菌作出正确评判。抗凝剂以EDTA-K ₂最常用。塑料管不易破碎，可保证离心时细胞不粘贴管壁，方便沉淀。但塑料管壁极性低，管底沉渣黏附力较弱，不宜用传统方法倒弃，而宜用吸管缓慢吸弃上清液，直到吸尽多余液体为止。

送检标本（delivery specimen）性状不一，处理方法可有所差异。脓性或急性胰腺炎标本，细胞极易被消化、溶解，所以应该尽快送检和检测，收到标本后要尽快制片。若为淡黄色的普通积液标本，包括一些转移性肿瘤细胞标本，放置4～6个小时后的细胞形态变化不大，在夜间值班较忙时，可将多余标本放置到次日制片。疑有细菌标本在温热气温环境下会大量繁殖，导致涂片上的细菌数量明显增多，所以应及时送检和制片。另外，分析前的质量控制工作十分重要，这与临床医生的操作密切相关，如规范的穿刺、避免出血、正确的抗凝和充分混匀、积液量的保证及送检量的一致等。同时，提供必要的临床资料也是完成好积液细胞学检验或细胞图文报告的重要前提。

普通斜式离心机比水平离心机更好，因为离心后的试管沉淀聚于一侧，更方便吸管把管底多余液体吸尽（图2-3）。离心速度一般控制在1500转/分，约10分钟，速度太慢影响离心效果，速度太快导致巨噬细胞、肿瘤细胞等有黏性细胞堆集，不易分散，增加分析难度。多数医院实验室习惯于将积液细胞类同尿液标本的操作，因此没有感受到浓缩涂片带来的益处。

相当于增加了检测的积液数量，只要做好浓缩这一步骤，常规送检量的积液检验就可以大大提高了阳性检测率。没有浓缩就很难提升对积液细胞的检测兴趣和分析水平，就如看稀释的骨髓片一样，兴趣大减。所以，要求将沉渣以外的液体尽量吸干，试管底部剩余沉渣只能推1～3张涂片（图2-4～图2-6）。个别积液若沉渣太浓（或细胞太多），可酌情增加残留液体。

推制涂片（preparation of slide）是首选方法，有了沉渣浓缩的保证，再加上推片制作，涂片观察效果就类同于观察骨髓片（图2-7）。涂片分布有体、尾部，细胞分布层次清晰，特别是大细胞和成堆细胞主要分布在片尾，易发现，缩短阅片时间。推片时还应注意控制推片角度，避免推制涂片太薄或太厚（图2-8、图2-9），沉渣黏度高时，推片角度尽量变小，推片速度尽量放慢，以免涂片太厚。采用涂圈方法制得的涂片导致细胞分布太厚，使细胞染色太深，分布无规律，异常细胞则会随机分布，寻找起细胞来也将比推片法更费时（图2-10），涂圈制片法只适合检测细胞实在太少的情况，而且涂圈半径控制在0.5～1cm为宜。因强调胸腹水标准化操作和推片技术，所以本书不推荐用脑脊液专用离心机制片，后者的检测量少且较难控制，也无涂片尾部的优势。

染色技术（staining technique）在常规实验室常采用瑞特-吉姆萨染色，配制过程要将瑞特染粉1g置洁净干燥研钵内，加甘油3～5ml，研磨片刻，使瑞特染粉充分溶解后加甲醇50ml，研磨，收集上层染液后再加甲醇50ml，研磨，重复几次后，用甲醇冲洗研钵，倒入同一瓶内，最后加甲醇至500ml（严禁将瑞特染粉直接倒入甲醇中，使染色效果偏淡，涂片污染颗粒增多）。一般染色液存放时间越长，染色效果就越佳。若认为浓缩的吉姆萨染液配制较繁，可选用商品刘氏染液的B液按1∶10的比例用自来水稀释，制成吉姆萨代用液和瑞特染液的稀释液（瑞特缓冲液），此液染色效果十分稳定。加瑞特染色液后要用吸耳球吹吸，并使其均匀布满整张涂片，约30秒后加瑞特缓冲液，再用吸耳球吹吸空气使染液充分混匀，若有金黄色油膜出现，染色效果则更佳。染好的涂片要自然干燥，切忌加热烘干，否则细胞易退色从而影响观察效果。瑞特-吉姆萨染色不应与铁染色混用染色板，染色时应避免盐酸挥发影响瑞特-吉姆萨染色效果。冲洗时应平放涂片用流水缓慢冲洗片刻，尽量减少染料沉渣沉积，冲洗完毕后，涂片尾部向上，插在染色板上晾干。

低倍镜下观看整张涂片，再在片尾（相当于国家的海岸线上）仔细寻找有无成堆细胞、体积巨大细胞及其他异常有形成分，若临床没有肿瘤病史或“海岸线”上没有发现异常细胞，可减少阅片时间，直接在体尾交界处分类100～200个有核细胞。分类时要兼顾片尾的大细胞和片中、片头部的小细胞，一般片尾巨噬细胞和间皮细胞偏多，涂片中间和头后部淋巴细胞偏多。若发现“海岸线”有问题，应用油镜观察，看到不典型细胞不要急于下定论，要等找到更典型细胞后再回头认识这些不典型细胞。异常细胞太少时还要阅完该标本的所有涂片。寻找细菌、真菌等微生物不少于100个油镜视野，因在常规工作中，这些特殊成分的发现对临床诊断和治疗及明确下一步检查措施的意义重大。

摄片技术（photograph technique）因积液细胞多而杂，要选择有代表性的图片，要求技术人员了解和总结临床经验，认识到什么样的细胞能提供给临床更多信息，创造更大价值，否则易误导。摄片时应注意选择涂片尾部，尽量多寻找几张涂片，寻找更典型肿瘤细胞，观察有无存在吞噬意义的细胞以及出现变异的淋巴细胞和中性粒细胞、特殊细胞等。

人员培训（personnel training）是提升这项技术的关键，因细胞形态检验的技术人员十分讲究经验的积累，应选择乐于奉献、思路清晰、敢挑重担、对细胞形态检验有一定悟性的工作人员进行培养；应充分利用科室的细胞学技术资源，发展和提升检验科细胞学检验内涵；应适当固定细胞学检验工作人员，避免频繁调动。从科室管理角度切实重视人员培训，确保看片人员正常的培训、相对稳定的工作时间及相对集中的标本是提高积液细胞及其他细胞形态检验技能的三大要素。

分步报告（report in stages）可让有图文报告的实验室分两步报告，第一步先发送临床为常规四项的检测报告，图文报告分析可留在第二步做。急诊值班时检验人员由于时间紧、条件限制，可只做外观、颜色、细胞计数及李凡他试验，先发初步报告，再将余下的标本送专职人员处做细胞形态学分析，不再提供计数板下单个核细胞和多分叶核细胞计数。

提示性报告模式（suggestive report pattern）已在许多实验室推荐使用且相对稳妥，也可规范积液细胞的报告质量。对异常细胞实行分级报告，如轻度、中度、高度核异质细胞的提示和肿瘤细胞的提示类同对细菌、真菌、中性粒细胞、淋巴瘤细胞等提示，是理性而不可缺少的。有条件的单位（若有执业检验医师证）可作明确的诊断性报告。其他积液细胞的提示性报告也一样，要根据细胞形态学变化、异常细胞数量及临床相关资料作出综合分析，完成有档次的检验报告单。

报告风险（risk of report）并不像某些技术人员想象的那么大，和任何工作一样，责任性和报告技巧是做好这项工作的重要因素，除了认真做好标本的保存、浓缩、推片、染色及镜下分析等环节外，还应加强报告技巧的培训，如通过开展各种积液细胞图片的培训或多次实验室之间质量评价等形式，完全可在短期内掌握这门技术。另外，检验人员对形态学检验的提示性报告已大大减轻了报告风险。如细胞形态不够明确，则给出大、中、小或低、中、高度核异质细胞的提示性意见就够了，避免僵硬且带有“是、否”的单句肯定性报告，建议采用“看到什么、考虑什么、建议什么”的三步法模式。如看到大量异常细胞，考虑淋巴瘤细胞可能，建议积液细胞流式免疫标记分析。又如看到较多细菌，考虑细菌感染可能，建议结合细菌培养。

假阴性结果（false negative result）可出现在下列情况：有明显凝块的标本均会降低肿瘤细胞和其他阳性成分的检出率，因纤维蛋白丝会网住大量细胞；送检标本量太少，离心速度不足及沉渣中残留液体太多也会减少涂片肿瘤细胞和其他阳性成分的检出率，造成假阴性结果；患者反复多次穿刺，使原来脱落的细胞减少，新生积液使细胞稀释。当肿瘤细胞太少或不典型时，部分工作人员会降低恶性细胞报告等级，工作人员投入时间不够，没有按流程操作，如认为细胞偏少不做涂片等导致的漏检属于人为的假阴性结果。

假阳性结果（false positive result）可出现在下列情况：推制肿瘤积液的涂片没有及时丢弃或未经处理就用作下一个标本的载片，使前面标本的肿瘤细胞黏附在载片上，导致后面标本的假阳性；送检标本太多时，操作人员没有及时写上患者信息，使标本之间及涂片之间出现交叉（所以，要求送检标本应逐一处理，完成前面标本制作后方能进行下一个标本的沉渣处理）；医生填写信息错误，个别标本由于患者临床信息漏填或误填也会导致不必要的错误结果。总之，一张图文报告涉及诸多方面，阴性、阳性结果的确定还应结合临床医生的综合分析，需要临床与医技部门的不断沟通，必要时可建议重新送检，以明确最后结果。