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第四节 FⅧ/FⅨ抑制物检测
临床上反复应用血制品且对血制品治疗无效的血友病A/B患者，需高度怀疑是否出现FⅧ/FⅨ抑制物，并用Bethesda法或改良Bethesda法（Nijmegen法）进行测定。
一、Bethesda法
Bethesda法是国际上首个被广泛接受和推荐的用于测定凝血因子抑制物的方法，最早应用于1975年。其理论基础是FⅧ/FⅨ抑制物能够抑制正常血浆的FⅧ/FⅨ。它以等量的病例血浆与正常混合血浆混匀作为测试血浆，另以等量正常混合血浆与pH7.4的咪唑缓冲液混匀作为对照血浆，置于37℃水浴2小时后检测残余FⅧ：C/FⅨ：C活性，以测试血浆中的残余FⅧ：C/FⅨ：C活性相对对照血浆下降50%为一个Bethesda单位（BU），计算出抑制物的滴度。
结果判定：残余FⅧ：C/FⅨ：C下降50%为1.0BU，阈值设定为残余FⅧ：C/FⅨ：C66%（即0.6BU）；残余FⅧ：C/FⅨ：C80%为阴性；残余FⅧ：C/FⅨ：C 66%～80%报告为＜0.6BU；残余FⅧ：C/FⅨ：C≤30%样本需要稀释后重新测定。根据抑制物滴度水平进行分型：高滴度抑制物者指患者血浆FⅧ/FⅨ抑制物滴度≥5BU；低滴度抑制物者指抑制物滴度＜5BU。
该方法简便经济，易于推广，但仍存在不少问题，其对FⅧ/FⅨ抑制物检测缺乏特异性，尤其是当抑制物水平较低时。其原因是标准Bethesda方法采用的正常混合血浆缺乏缓冲体系，导致在孵育过程中混合血浆中pH升高，FⅧ浓度自然下降，影响抑制物检测的敏感性、特异性和稳定性。另外由于对照血浆是以咪唑缓冲液与正常血浆相混合，而测试血浆中是病例血浆，而血液凝固是一个复杂的过程，涉及多种凝血因子及其他因子，测试血浆与对照血浆中的凝血因子含量明显不同，导致测得的抑制物滴度值误差加大。
二、改良Bethesda法
改良Bethesda法（Nijmegen法）对Bethesda法进行了改进，用乏FⅧ/FⅨ血浆代替咪唑缓冲液，同时向正常混合血浆中加入缓冲体系。具体方法是等量Nijmegen正常混合血浆与等量乏FⅧ/FⅨ血浆混合作为标准血浆，等量病例血浆与等量Nijmegen正常混合血浆混合作为待测血浆。将标准血浆与待测血浆置于37℃水浴2小时，以不同稀释度的标准血浆做FⅧ：C/FⅨ：C的标准曲线，以此检测待测血浆中残留的FⅧ：C/FⅨ：C。根据待测血浆中残留的FⅧ：C/FⅨ：C与BU的关系，计算FⅧ/FⅨ抑制物的量。
Nijmegen法对于检验低滴度抗体特异性较好，目前已成为国际上推荐的检测FⅧ/FⅨ抑制物的标准方法。但该方法仍存在抑制物检测准确性较低和抑制物阳性标准不统一两个主要问题。
为克服上述问题，有研究尝试通过产色物质测定的方法进行抑制物的检测，小样本的研究表明该方法更有利于低滴度抑制物的检出，但目前尚无大样本的临床应用结果。另外，也有许多研究通过ELISA方法对抑制物进行检测，ELISA方法可以直接检测抑制物，敏感性高，但特异性较低，不能辨别无抑制活性的抗体，尚无法标准化和大规模商业化生产，应用范围较小。