第四章　肺癌生物标志物的检测

生物标志物包括DNA、RNA和蛋白质。DNA主要检测基因突变（点突变、移码突变、缺失突变）、扩增和染色体变异（结构和数量变异）。RNA和蛋白质主要检测分子表达量。检测EGFR基因突变，可预测EGFR-TKIs的疗效［1］；检测ERCC1 mRNA表达量，可能预测多西他赛联合顺铂的疗效［2］；检测c-MET基因扩增，可预测onartuzumab的疗效［3］；检测ALK基因重排或ROS-1融合基因，可预测克唑替尼的疗效［4］。基于生物标志物的个体化治疗是未来肿瘤治疗的方向。

一种有生命力的靶向药物必须有明确的驱动基因（分子靶点）、获益人群及高效准确的检测方法。其中高效准确的检测方法是实现精准治疗的基石和关键。任何一个试剂的变质、一项操作的不规范，甚至一些已达成共识的规范操作都可能对生物标志物检测结果产生直接或间接影响，从而发生假阳性、假阴性。本章基于已有文献和我们的经验，从检测方法的优缺点、待检标本及其特点、病理质控、各分子靶点的特点及最适合检测这些靶点的标本及方法等方面进行阐述。

一、检测方法概论

DNA和RNA均以核苷酸为基本单位，故其检测方法无甚差异，均以基于测序平台、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）平台的方法为主，当然在发展成熟后，出于经济因素等考虑，可以以免疫组化作为初筛，如乳腺癌中HER2检测，但在结果上仍以前者为金标准。DNA和RNA水平的检测方法总归起来分为两类，一类以测序法为代表，基于单个核苷酸的检测，能够识别所有突变，包括已知和未知突变，称为筛查法；另一类以突变特异性扩增系统（amplification refraction mutation system，ARMS）为代表，基于引物识别配对原理，仅能检测已知突变，称为位点特异性方法。两类方法各有其优缺点。

（一）筛查法

筛查法基于测序时发现的碱基变化或者解链过程中碱基间相互作用力的不同，检测出一个变异或者整体性变异。前者为测序法，后者为变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）或者高分辨率溶解曲线法（high resolution melting，HRM）。

1.一代测序

一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明的［5］。其基本原理是聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后，该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团，所以可被用作链终止试剂），通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种双脱氧核糖核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）中的一种进行终止，再用PAGE分析四组样品，从得到的PAGE凝胶上可以读出我们需要的序列。

Sanger测序法因操作简便得到广泛应用（图4-1）。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术如焦磷酸测序技术。在该测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，该峰值将不会显示。

一代测序技术应用于肺癌分子检测［5］：

（1）可以检测所有类型的变异，包括已知突变和未知突变。

（2）产生大量数据，结果分析有一定难度。

（3）灵敏度较低，仅25%左右。

2.二代测序

下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术又称为高通量测序（high throughput sequencing）技术。它可以一次对几百万到10亿条核酸分子进行测序，实现一天内完成人类基因组的测序运行。基于其强大的测序能力，该技术在癌症基因组学研究等方面具有广泛的应用。其基本原理是应用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息［6，7］。

近年来，随着对肺癌驱动基因研究的日益深入，引发了基因检测的革命性变化，特别是在以EGFR突变为代表的基因变异的异质性和对靶向药物的耐药性方面。人们逐步认识到既往单一基因、单个突变位点、静态的和定性的检测不能准确地反映异质性肿瘤内的多个亚克隆基因变异及其治疗选择过程中动态变化规律。因此，肺癌驱动基因的检测正在经历从单基因到多基因、从静态到动态、从定性到定量、从组织到单细胞水平的转变。正是基于上述认识的巨大转变，NGS才得以快速发展，全基因组、外显子组及转录组测序分析才得以大规模及系统性的开展。全基因组测序不仅有助于明确肿瘤发生、发展的分子机制，也为肿瘤的个体化诊治开辟了新思路。基于全基因序列分析的肿瘤个体化治疗模式应至少包括：①获取配对肿瘤和正常对照样本，并确认所得组织达到肿瘤组织、细胞质量和数量的严格标准；②通过高通量测序平台比对肿瘤患者的肿瘤组织和自身正常组织的全基因组序列，筛选出个体肿瘤发生相关结构性变异、插入/缺失突变及单碱基变异等的“肇事基因”；③将筛选出的数据进一步与其他患者或临床背景数据库进行比较，验证病变组织细胞的基因序列在不同个体中的异质性；④结合基因组特征、测序结果和数据协调中心的临床背景数据对基因组变异进行详细解读，获得全基因表达视图，进行突变影响预测；⑤基于相关肿瘤生物信息学的分析，结合肿瘤个体中的突变，设计针对多个靶基因的诊疗方案［8］。

全基因序列分析在肿瘤个体化诊治中的关键思路是通过比对患者的肿瘤组织和自身正常组织的全基因组序列，发现个体肿瘤相关的“肇事基因”，从而对患者的个体化诊治和预后分析做出决定性影响。通过全基因组测序进行个体化诊治的一大优点是可避免常规候选基因测试的局限性。全基因组测序能够探测到常规检测之外的基因变异位点。全基因组的测序和确认在7周内完成，且可根据结果改变患者的治疗计划及预后，这说明，全基因组测序可在较短时间内发现细胞遗传学所无法发现的致癌基因。随着全基因组测序费用的降低，其在检测易患癌基因变异中的应用值得期待。

全基因组序列分析技术在肺癌个体化诊疗临床应用中的一个重要问题是肺癌肿瘤细胞中的基因突变是否能代表肺癌整体的基因突变。2013年，王洁教授等通过单细胞基因测序对11例肺癌患者CTC进行了全基因组和外显子组测序。结果发现，不仅来自同一患者的不同外周血CTC的全基因组拷贝数变化模式高度一致，而且同一患者的原发灶和转移灶肿瘤组织的全基因组拷贝数变化模式亦保持一致，更为令人惊奇的是，不同肺腺癌患者CTC全基因组拷贝数变化模式同样保持一致。这种现象在SCLC患者中也得到了验证。提示特定的基因拷贝数变异在肿瘤形成和转移中发挥了重要作用。尽管全基因组测序技术在寻找肺癌驱动基因方面已经取得了一定的进展，但要应用于临床，还面临很大的挑战：由于大多数肺癌在发现时已处于晚期，诊断主要依靠小标本，这可能会影响测序结果，进而使生物信息学分析变得异常艰难；尽管目前研究发现肺癌基因拷贝数在各种情况下保持高度一致，但异质性是肿瘤的基本特点，故对肺癌基因组进行更为深入、全面的分析实属必要。

二代测序技术应用于肺癌分子检测［9-12］：

（1）并行检测多种分子变异。对现在科研常用的483个癌症治疗相关基因进行并行检测，根据检测结果实施个体化用药。

（2）需要专业人员进行数据分析。

（3）二代测序精确度与测序平台、测序深度等相关。SOLID（supported oligo ligation detetion）测序的准确度相对较高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%。

3.DHPLC、HRM等其他方法

应用DHPLC方法比较混合在一起的两条或多条染色体经变性和退火后的PCR扩增产物，通过同源和异源双链DNA部分变性时在反相色谱柱上的保留时间不同可以揭示突变是否存在（图4-2）。DHPLC的敏感性和特异性可达96%。这些特性和低成本使得DHPLC成为一种检测人类和其他基因组序列的有效工具［13，14］。

HRM法是1997年Wittwer等发明的［15］。与当时盛行的其他DNA分析技术不同，这个方法无须进行额外的样品分离。随着溶液温度增加，DNA同源或异源二聚体的稳定性通过荧光染料SYBR Green I监控。该法可通过熔解温度（Tm）不同鉴别PCR产物基因型的差异。2003年，Wittwer等［16］发表了将LCGreen染料应用于HRM法进行基因突变检测。这种方法仅需将普通的引物和通用双链染料加入到PCR扩增体系。灵敏度可达100%，特异性随扩增子长度、引物长度等略有不同。

DHPLC和HRM虽能够检测出基因变异存在，但除非是已知变异，否则这两种方法均不能明确是何种变异，仍需测序法来最终确定具体突变类型。

（二）位点特异性方法

与筛查法不同，位点特异性方法仅能检测某个特定位点变异，通常是已知变异。检测方法分为两类——FISH荧光探针平台和定量PCR平台（如ARMS法等）。近几年正在研究的还有数字PCR（digital PCR，dPCR）等灵敏度更高的方法。乳腺癌HER-2扩增，肺癌EGFR突变检测是FISH和PCR平台方法的经典应用。

1.FISH

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代放射性核素标记而形成的一种新的原位杂交方法［17］。FISH的基本原理是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合，从而对DNA序列在染色体或DNA纤维切片上进行定性、定位及相对定量分析。FISH法多用于基因扩增和融合的检测，如HER-2扩增和ALK融合。

2.荧光定量PCR

荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度［18］。

根据不同的引物设计、荧光探针可以设计出不同的方法。如EGFR分子检测最普遍的ARMS法［19］。其基本原理是在突变位点设计PCR引物，引物3′端与突变型基因配对，但不与正常基因配对，从而保证了只有突变型模板才能够扩增（图4-3）。1999年，Whitcombe D等［20］设计研发了Scorpion ARMS，利用引物5′端的蝎形尾探测扩增时引物延伸部分，将检测靶标区域DNA变成了单分子事件，提高了整个检测体系的动力学、热力学、检测设计和探针可信性。现在临床应用的ARMS法有蝎形探针、双环探针等多种。

ARMS法用于分子检测的检测限达1%［21］，且有多种经国家FDA批准的商品化试剂盒，操作简单，发生污染概率小，目前已被临床广泛应用。

3.dPCR等

dPCR于1992年由Sykes提出［22］。1999年Vogelstein和Kinzler［23］在前人报道的单分子定量技术的基础上，采用96孔板系统发展了微升级的PCR扩增方法，并用于结肠癌K-RAS的定量分析。随后几年的时间内，dPCR突破了96孔板及386孔板的限制，微流体和纳升反应仪器的开发赋予其高通量的特性。虽然目前在该平台的大框架下，细节技术仍处于日趋完善中，但业已成为研究热点。

作为传统RTFQ PCR的升级版，dPCR采用的是直接计数目标分子数而不依靠任何校准物，即通过计数单个分子从而实现绝对定量［24］。具体来说，在该项技术中，样品被充分稀释后，每个样本被分到单独的PCR反应孔中。一部分阳性反应孔含有目标分子，另一部分阴性反应孔则不含有目标分子。接下来，采用传统实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）的荧光结合染料或荧光标记探针来实时检测整个扩增过程积累的荧光信号。待扩增循环结束后，利用不同荧光信号的PCR反应孔数目计算样本中的绝对目标分子数（图4-4）。由此可知，dPCR将传统qPCR的指数数据转换成数字信号，通过判断扩增是否发生达到对核酸的绝对定量，也即体现了dPCR命名的由来。

dPCR特点：

（1）灵敏度理论上没有上限。样品稀释度越高，灵敏度就越高。现在常说的是在0.1%。

（2）精确定量。可以对样品中某一基因位点野生型和变异的DNA数量进行定量。

（三）分子检测的未来

分子检测的未来很大程度上依赖于测序技术的进步。过去的三十年里，测序技术从以凝胶电泳为基础，经毛细管测序系统，到现在的高通量大规模并行检测技术，极大地推进了个体化治疗的发展。

1.技术的发展：从单基因到多基因、从定性到定量检测

由于大部分肺腺癌为单一驱动基因，故现行的分子检测方法（靶向治疗V1.0）通过检测单个分子，选择特定的患者接受靶向治疗。逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）、FISH、Sanger测序、焦磷酸测序，甚至IHC等方法基本可以满足检测需求。由于少数肺腺癌存在多个驱动基因，45%肺鳞癌常表现为多个驱动基因变异或通路改变，故目前正在发展、完善中的分子检测（靶向治疗V2.0）主要是基于PCR的大规模阵列SNapShot检测和初始的高通量测序技术如SNP/CNV DNA微阵列、RNA微阵列等方法进行多靶点并行检测，使临床实践中能更充分地利用有限的肿瘤标本获得更多的分子信息，为患者提供更多、更有效的治疗选择。未来的分子检测（个体化治疗V3.0）主要通过NGS获取患者的基因组信息（全基因组、外显子组、全转录组、目标转录组和表观遗传学分析等方法），实现从定性到定量的检测变革，从而深入了解NSCLC的异质性（如临床实践中，我们常常发现一些EGFR敏感突变患者应用TKIs疗效不佳，部分可能与突变的EGFR含量或丰度低有关），最终为患者制定个体化的治疗方案，实现真正意义上的个体化治疗。

靶向治疗V1.0和V2.0时代检测能够获得的信息仅限于是否突变，而个体化治疗V3.0时代，通过新一代测序方法和生物信息学分析能够计算出核酸标本中突变等位基因和野生型等位基因的比例，从而更有针对性的打击携带突变等位基因的肿瘤细胞（图4-5）。

核糖核苷酸是RNA的基本单位，是DNA中丰度最高的非标准核苷酸，它们会在DNA复制和修复过程中嵌入基因组DNA，进而影响基因组的稳定性。然而，迄今为止人们还无法鉴定和定位这些插入DNA的核糖核苷酸，也无法确定它们的类别，但核糖核苷酸插入会改变DNA的结构和功能。为此，人们开发了一种新测序技术——Ribose-seq。研究发现，核糖核苷酸里特有的羟基（OH）是Ribose-seq的关键，它能使DNA发生扭曲，形成敏感性位点。由于OH和碱性溶液之间的反应，使DNA更容易被切割。Ribose-seq就是利用这一反应来检测核糖核苷酸的插入事件。该技术可以鉴定和分析插入基因组DNA的核糖核苷酸，能够特异性的直接捕捉嵌入DNA的核糖核苷酸，适用于任何生物的任何细胞类型，只要能提取出基因组DNA（从细胞核基因组、质粒DNA到线粒体DNA），不需要进行标准化，还可以在DNA遭遇环境压力发生断裂和脱碱基时分析rNMP，鉴定特征性的核糖核苷酸插入，可以找到人类疾病包括肿瘤等新的生物学指标。目前，利用这一技术已经在酿酒酵母的细胞核和线粒体DNA中成功绘制了核糖核苷酸的完全图谱，鉴定了核糖核苷酸插入的“热点”区域。研究显示，核糖核苷酸嵌入很普遍但并不是随机发生的。该法先在核糖核苷酸处切割DNA，然后构建DNA文库，文库中的DNA序列包含核糖核苷酸插入位点及其上游序列。随后，对文库进行高通量测序，将测序读取结果与参考基因组进行比对，最终获得rNMP插入事件的基因组图谱［25］。

2.标本的发展：从静态到动态检测

标本的发展同样对个体化治疗具有很大的推动作用。检测标本由单一的组织学标本向便捷无创的血液标本发展，为动态监控患者治疗过程提供了可能，有利于对患者进行更加有效的全程管理。2014年，Oxnard等［26］用dPCR法研究了血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）动态监控EGFR突变状态，评估疾病进展。研究提示，实时定量的血浆无创基因分型可评估药效和耐药情况，并且能较影像学早16周检测出耐药突变。

二、检测标本概论

（一）手术标本

因肿瘤细胞数量多、比例高，故手术标本是分子检测的最佳标本［27］。手术标本有两种处理方式，术中冰冻和固定包埋为蜡块。前者常用于术中病理诊断，其抗原性保存比较好，且可以抽提出高质量、高浓度的DNA样品，有利于分子检测，但是组织结构形态的保存没有石蜡切片佳，而且抗原容易弥散，不易观察抗原分布情况。石蜡包埋的组织其形态保存较好，且保存时间较长，但抗原常被封闭甚至破坏，需要对抗原进行修复，且福尔马林固定和石蜡包埋过程会对DNA结构造成一定影响，从而在一定程度上影响了分子检测结果。

（二）小活检标本

由于70%的NSCLC患者在初诊时已处于晚期，无法接受手术，难以获得手术标本。因此，小活检标本和细胞学标本作为替代标本用于分子检测具有重要的临床意义。

目前小标本获取技术包括经胸壁穿刺活检、经支气管镜针吸活检（transbronchial needle aspiration，TBNA）、超声支气管镜（endobronchial ultrasonography，EBUS）及电磁导航支气管镜检（electromagnetic navigation bronchoscopy，ENB）等多种技术［28-31］。有时还需要将上述基于支气管镜的活检技术与食管超声内镜（endoscopic ultrasonography，EUS）联合应用。ENB创伤小、并发症少、安全性高；经皮穿刺活检可以获得更大的组织样本，并且这两项技术获得的组织样本理论上足够用于病理和分子诊断。由于CT分辨率高可用于检测肺部小结节，CT引导的细针穿刺活检（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）可用于获取病灶直径<1.5cm的NSCLC患者标本，虽然该技术对病理诊断具有一定挑战，但是其风险和并发症少。EUSFNAB和EBUS-TBNA技术互补，若联合使用，几乎可对所有纵隔淋巴结进行活检。其中EBUS-TBNA适用于诊断中央型肺癌以及进行肺癌纵隔淋巴结分期；EUS-FNAB适用于获取转移的淋巴结；ENB适用于周围型肺癌。原发灶的小活检标本在质控合格的情况下，与手术标本检测结果一致［32］，转移灶可能存在一定程度的异质性，如用肺癌多处淋巴结穿刺标本检测EGFR突变状态时存在约14%的异质性［33］。

（三）细胞学标本

常见的细胞学标本包括细针抽吸（fine-needle aspiration，FNA）标本和由于肺癌常见并发症产生的液体标本等。前者包括经支气管壁的抽吸物（如EBUS穿刺标本）、淋巴结或其他表浅转移灶细针抽吸物等；后者包括胸腔积液、腹水、心包积液、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、脑脊液、痰液等［29，30］。相比之下，从恶性胸腔积液中找到癌细胞概率较低；FNA获取的标本更具针对性，可获得较多肿瘤细胞，且由正常细胞造成的污染最少［34-36］。细胞学标本一般更适合应用IHC和RT-PCR法检测，尤其是RT-PCR法对于细胞学标本特别是离心浓缩后的恶性浆膜腔积液标本检测具有一定优势。一般情况下，细胞样本较组织样本的肿瘤细胞数含量少［37］。有异常的细胞涂片和细胞蜡块（cell block）均可长期保留，其中细胞蜡块切片还可使用Ventana IHC和FISH方法进行分子检测。

用于分子检测时，无论是原发灶还是转移灶的细胞学标本与组织标本突变检出率并无显著性差异［38］。

（四）血液标本（液态活检，liquid biopsy）

由于小标本活检一次性成功率仅66.3%，部分患者需重复2~4次，故很多患者难以接受。血液标本因为取材便捷、无创、均一而备受青睐。一些患者因年龄、病灶位置等因素无法获取组织标本，血液标本成为最后的期盼。血液标本用于分子检测尚处在研究阶段，主要包括cfDNA、CTCs和外泌体（exosomes）的检测。

1.cfDNA

也称循环肿瘤DNA（cell-free circulating tumor DNA，ctDNA），是由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放到血浆中的单链或双链DNA，携带有与原发肿瘤组织一致的分子遗传学改变，有望成为一种新型肿瘤标志物［39］，将在肿瘤的诊断、治疗及预后监测等方面发挥重要作用，尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的有创伤活检。凋亡和坏死来源的cfDNA片段长度不同。一般来说，凋亡细胞释放的DNA片段长度为185~200个bp，而更长的DNA片段则可能是由坏死的肿瘤细胞释放的。目前认为，部分（非全部）晚期NSCLC患者的血液中存在cfDNA。

应用晚期NSCLC患者血液标本检测驱动基因突变具有一定的可行性［40］；血浆的阳性率高于血清。两项大样本研究［40-41］显示，cfDNA检测晚期NSCLC患者EGFR突变的一致性、敏感性达80%左右，特异性达90%以上。Mok等［42］在FAST-ACT2（CTONG0902）研究中评价了从血浆DNA检测EGFR突变作为生存预测标志物的可行性。研究的主要终点为PFS，次要终点为OS和ORR等。共有224例配对标本。以组织样本为参照，检测方法为cobas EGFR blood test试剂盒。结果显示，血浆检测的敏感性为76%（68/89），特异性为96%（130/135）；EGFR突变的阳性和阴性预测值分别为93%（68/73）和86%（130/151）；血浆和石蜡包埋组织检测EGFR突变的总一致率为88%（198/224）；联合治疗组（化疗联合靶向治疗）和化疗组血浆EGFR突变型患者的PFS分别为13.8个月和6.1个月（HR=0.21，P=0.0001），OS分别为32.4个月和19个月（HR=0.51，P=0.0035），而野生型患者的PFS分别为6.7个月和6.0个月（HR=0.80，P=0.06），OS分别为16.1个月和13.3个月（HR=0.89，P=0.39）。在FASTACT2研究中发现，血浆游离DNA和血浆EGFR（pEGFR）突变特异性DNA在治疗的第3周期（C3）明显降低，而在疾病复发时又升高；一线治疗时，对于所有患者，基线与C3时pEGFR突变均阳性患者的ORR显著低于基线阳性而C3阴性者（ORR 33% vs.66%）；C3时pEGFR突变阳性者的PFS和OS均显著短于阴性者（PFS：7.2个月vs.12.0个月；OS：18.2个月vs.31.9个月）；对于接受吉西他滨/铂类联合厄洛替尼一线治疗的患者，基线pEGFR突变阳性而C3突变阴性者与基线、C3均阳性者的ORR无显著性差异；但C3时pEGFR突变阳性者的PFS仍显著劣于阴性者（7.8个月vs.16.6个月），而OS无显著差异。中位pEGFR突变DNA拷贝数显示，两组pEGFR突变DNA拷贝数均在C3时下降，而在疾病进展时升高，但接受厄洛替尼治疗的患者的pEGFR突变DNA拷贝数升高程度仍远低于单纯化疗者。该研究提示，cobas EGFR血浆检测能够较为可靠地反映血浆EGFR突变状态；在吉西他滨/铂类联合厄洛替尼一线治疗时，基线和C3pEGFR突变均阳性者提示PFS和OS均较短（可能在C3时EGFR-TKIs已经不能完全控制肿瘤了）；对于EGFR突变并一线接受EGFR-TKIs治疗的患者，C3 pEGFR突变状态可能是疗效的预测因子，液态活检有望用于治疗过程中的疗效监测，但仍需前瞻性研究证实。在2015年ASCO年会上，韩国学者Ahn等［43］动态检测了接受EGFR-TKIs治疗的EGFR突变NSCLC患者血浆中EGFR突变状态，发现dd-PCR是检测血浆EGFR突变状态的有效方法；监测血浆EGFR突变状态有助于早期明确EGFR-TKIs的疗效（EGFR-TKIs治疗0~20天即可观察到cfDNA水平的变化［44］，并能早期发现患者是否对EGFR-TKIs耐药。

外周血EGFR突变检测的优势是假阳性率低（0~20%），故其阳性对指导EGFR-TKIs的选择有较大参考价值，但假阴性率达20%~58%［45-49］。IPASS研究和IFUM研究中cfDNA中EGFR突变的特异性分别为100%和99.8%。韩宝惠等比较了组织学标本、细胞学标本及血浆游离DNA标本的EGFR基因突变的检出情况（IGNITE研究）。结果发现，在真实世界中，血液检测较组织学及细胞学检测具有较高的特异性，在亚太地区患者中可达97.2%。以上表明血液检测的假阳性率很低，在临床检测中发现血液EGFR基因突变阳性的患者，可以认为是真阳性。但检测血液中EGFR基因突变的敏感性仅49.6%，较以往IFUM（65.7%）等研究的结果偏低，推测与肿瘤分期、血液标本的处理、EGFR突变检测方法等的差异有关，故对血液标本EGFR突变检测呈阴性者应特别谨慎，尤其是对于EGFR突变的优势人群，应尽可能取得组织学标本，或反复、多次进行血液学检测已明确EGFR突变状态。Qiu等［50］进行了一项荟萃分析，共纳入27项检测NSCLC患者血浆EGFR-cfDNA突变的临床研究，共包括3110例NSCLC患者。结果显示，cfDNA检测NSCLC患者血浆EGFR突变的敏感性、特异性和一致率（组织和血浆）分别为62%、96%和81%。以上研究表明，目前EGFR组织学、细胞学检测依然是EGFR基因突变检测的金标准；EGFR血浆cfDNA检测具有高度特异性，但敏感性较差，可作为无法取得组织或细胞学标本的患者的有效补充（欧洲药物管理局和中国食品药品监督管理总局分别于2014年9月和2015年2月先后批准对吉非替尼说明书进行更新，补充了如果肿瘤标本不可评估，则可用血将标本进行cfDNA中EGFR突变检测）；检测血液标本中EGFR基因突变的方法尚需进行更严格的质控、验证和优化，检测试剂必须使用欧盟或中国批准的试剂盒，以提高检测的敏感性（非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识，2015年12月）。尽管检测cfDNA可以明确EGFR基因突变状况并指导EGFRTKIs的用药，但基于PCR平台的检测方法对于应用血液检测ALK仍存在一定的先天不足，主要原因是目前RT-PCR均是在RNA水平检测ALK融合基因，而血液中存在大量RNA酶，大部分肿瘤RNA释放入血后都已降解。因此，Newman等［51］应用NGS方法检测了血液中游离DNA的ALK融合基因表达。结果显示，4例阳性，其中2例患者接受克唑替尼治疗均获得良好效果。提示该法有一定应用前景。最近，应用FISH方法检测CTCs中的ALK基因取得了令人惊喜的结果。Pailler等［52］应用FA-FISH（filter-adapted FISH）方法检测了18例ALK阳性和14例ALK阴性NSCLC患者的CTCs。结果显示，所有ALK阳性患者中，每1ml血液可检测到>4个CTCs存在ALK分离信号表达，且这些存在ALK融合基因的CTCs均显示间质转化亚型。提示这些CTCs具有很强的侵袭性和抗免疫能力。

尽管应用血液标本检测驱动基因突变具有很大的临床价值，但同时也具有很大的挑战性，主要表现在：第一，如上所述，cfDNA来源于肿瘤细胞凋亡或坏死后的DNA，其DNA均以碎片状形式存在于血液中，而提取这些碎片状DNA是目前的一大难点，尤其是很难有合适的方法对碎片状DNA进行质控；第二，即便成功提取cfDNA，其含量也非常少且不稳定，需要极其灵敏的方法检测。上述两项大样本研究分别采用了DHPLC法和ARMS法，但同样采用这种方法的一些研究，其灵敏度参差不齐，有的仅为43%。这些问题严重限制了cfDNA在临床上的应用。目前，基于血液检测技术的研究倾向于dPCR和NGS，相比于1%灵敏度的ARMS法，其灵敏度可达0.1%，甚至更高。

2.CTCs

CTCs早在140多年前就被发现，但CTCs在转移性癌症患者的外周血中存在的数量极少，109个细胞大概才含有一个CTC（约1~100个CTCs/ml全血），但由于其在恶性肿瘤的早期诊断、转移、疗效预测及预后评估中的重要性日趋明显，故直到近年才逐渐受到广泛关注。CTCs是指由于自发或诊疗操作等原因，从肿瘤组织脱离之后进入人体血液循环系统的各类肿瘤细胞和细胞团（又称循环肿瘤微栓子，circulating tumor emboli，CTM）的总称。CTCs被分为上皮型CTCs、间质型CTCs和混合型（上皮和间质特性共存）CTCs。

CTCs作为“液体活检”备受关注。最新研究表明，间质型CTCs和CTM具有更强的转移侵袭潜能和药物耐受能力，其恶性程度更高，已成为CTCs研究的热点。

许多研究认为，CTCs是肿瘤转移、耐药及复发的根源。大多数CTCs在短时间内会发生凋亡或被机体的免疫系统识别并清除，其在血液循环中的MST仅1~2.4小时。只有极少数的肿瘤细胞（主要是间质型CTCs，尤其是CTM）经过血液循环传播后，抗凋亡能力得到了加强，获得了化疗耐药的特性，因此，该类细胞更易在血液循环中生存下来，并在适宜的条件下黏附并穿过血管壁，侵入新的组织或器官，然后进行分裂、增殖，形成微转移灶，导致肿瘤复发和转移。

与影像学、血清学等现有检查方法相比，检测CTCs有可能在更早期即可发现肿瘤，并能更准确、更直接地反映肿瘤转移、进展、耐药情况及治疗效果等，实现实时个体化治疗。越来越多的研究显示，肿瘤细胞在疾病的早期就开始散播；早期检测到CTCs并不完全意味着肿瘤已处于晚期，但CTCs的数量可能会随着疾病进展而增多［53］。Ilie等［54］进行了一项前瞻性研究，应用依据细胞大小并通过滤膜直接富集CTCs的方法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET法）检测了168例COPD患者血液中的CTCs。结果发现，在168例COPD患者中5例检测出CTCs，3例分离出的细胞具有良性细胞形态特征。在随后进行的随访中，这5例COPD患者的胸部CT先后都发现了肺部结节，术后病理证实均为早期肺癌，术后12个月时胸部CT复查均未发现肿瘤复发，也未检测到CTCs。3例具有良性细胞形态的COPD患者及其余160例在第一次血液检测时即未发现病变细胞的COPD患者在随访中均未发现肺部结节。该研究提示，检测CTCs可能有助于肺癌的早期诊断。一项临床研究［55］显示，Ⅳ期肺癌患者血液中CTCs数量明显多于Ⅲb期患者，而Ⅲb期又明显多于Ⅲa期；肝转移及骨转移患者CTCs数量明显多于其他部位转移者；基线CTCs数量<5的患者PFS和OS明显长于>5者；化疗后CTCs数量减少者的临床疗效明显好于增多者。此外，2013年发表于Science的研究［56］发现CTCs型别可快速评估化疗疗效。Kuhlmann等［57］研究了143例卵巢癌患者，发现ERCC1阳性CTCs是OS和PFS的独立预测因子（P=0.026和0.009），特别有趣的是，在初始诊断时ERCC1阳性CTCs能准确预测该患者对铂类耐药。Muinelo-Romay等［58］对43例新诊断的NSCLC患者进行了前瞻性研究，旨在评价CTCs预测NSCLC患者预后的价值。在第1、2、5周期化疗前留取血样本，应用CellSearch技术检测CTCs和CTC相关物质（objects，主要是没有形态学特征的细胞碎屑）。在开始化疗前，18例（49%）患者检测到了完整的CTCs，其中10例CTCs计数>5个，79.1%的患者细胞角蛋白阳性；CTCs计数>5个的患者PF（P=0.034）S和OS（P=0.008）均短于CTCs计数<5个者；完整的CTCs数目和CTC相关物质之间呈强烈正相关（C=0.7，P=0.001）；完整的CTCs数目和淋巴结转移之间也表现为正相关：23例N3期患者具有完整的CTCs者占58%，而19例N0、N1期患者具有完整CTCs者仅占22%（P=0.029）；CTCs数量多者往往更易形成多发转移。治疗期间，CTCs计数升高者PFS和OS亦明显短于CTCs计数降低者。该研究提示，CTCs可作为晚期NSCLC预后和化疗疗效的生物标志物；具有完整CTCs者N分期更晚；CTCs数目多者更易形成多发转移灶。

CTCs是完整、无损伤的肿瘤细胞，与肿瘤耐药、转移及表型转换相关的基因变异在CTCs中高度富集；从CTCs中检测分子标志物在理论上较cfDNA准确度更高，结果更为可信。获得CTCs后，需进一步染色确认后才能进行深入分析，包括突变分析、全基因组测序、FISH分析及CTCs细胞培养等。这些都是CTCs研究的方向。目前CTCs捕获的方法从原理上可分为物理学方法、分子生物学方法和直接分析方法（图4-6）。物理学方法利用细胞大小、密度、可变形性和电学性质捕获CTCs，该方法较容易且无须抗体标记，但是CTCs捕获纯度很低（1%~20%）［59］。生物学方法主要是利用免疫磁珠结合CTCs表面特异性抗原，识别并捕获CTCs，将其在血液中与白细胞分离［60］，其中CTCs表面抗原一般选择肿瘤特异性标志物或者上皮细胞特异性标志物（EpCAM和CKs）。目前市场上运用此方法的仪器有CellSearch、MACS以及Dynal磁珠。其中CellSearch在2004年到2008年相继通过FDA批准用于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌患者的预测及预后评估，并在2012年获得我国CFDA批准用于乳腺癌患者预后分析，迄今尚未批准该方法用于肺癌患者。直接分析法是裂解血液中红细胞后，通过高通量分析对CTCs进行直接分析［61］，但迄今尚未批准用于肺癌患者。尽管如此，能够捕获到的CTCs数量仍然非常有限，纯度也不够理想，尤其是CTCs数量和纯度之间“鱼与熊掌不可兼得”，极大地限制了其临床应用。

为了寻找一种有效、可靠的鉴定外周血中CTCs的方法，Yu等［62］应用RT-PCR法检测了68例进展期肺腺癌患者及30名健康人外周血中存活素（survivin）、细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、人端粒酶催化亚单位（human telomerase catalytic subunit，hTERT）和甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor 1，TTF-1）mRNA的表达水平，它们识别CTCs的敏感性分别为41.18%、61.76%、41.18%和35.29%。然而，联合四者后的敏感性高达82.35%。研究还发现，survivin、CK7、hTERT及TTF-1 mRNA的表达水平与肺癌远处转移呈正相关（P<0.05）。Man等［63］通过qRT-PCR方法在肺腺癌患者外周血CTCs中鉴定出四个表达显著增高的候选基因，分别是CK7、钙离子激活的氯通道-2（Ca2+-activated chloride channel-2，CLCA-2）、透明质烷介导的移动性受体（hyaluronan-mediated motility receptor，HMMR）和hTERT。若定义至少一个基因的mRNA表达增高为CTCs检测阳性，在154例肺腺癌患者中，74%的患者CTCs阳性；在48例良性肺疾病患者中，有6.8% CTCs阳性；而在78名健康对照者中仅仅检测到2.2%的CTCs阳性。后续的三年随访发现，在初次检测后90天内CTCs标志物（CK7、CLCA-2、HMMR及hTERT）升高者的OS明显短于降低者（P<0.001）。以上研究说明，寻找合适的标志物在CTCs检测中具有重要意义；CTCs在肿瘤诊断、预后评估中具有一定的价值。

3.外泌体

外泌体最早是20世纪80年代初在未成熟的红细胞中分离出来的一种直径为40~100nm的圆形单层膜结构，属于细胞主动向外排泌的小的细胞外膜囊泡。多种细胞，尤其是DC和肿瘤细胞可释放外泌体。来源于DC和肿瘤细胞的外泌体表面表达MHCⅠ类和Ⅱ类分子、共刺激分子CD80和CD86、抗原肽等，能够激活体内抗原特异性T细胞发挥免疫作用。多种体液如血浆、血清、乳汁、尿液及唾液中均含有外泌体；外泌体包含多种蛋白质、DNA片段和核酸等。外泌体既可调控局部和全身微环境，促进肿瘤发生、发展、转移和耐药，也可以通过调节免疫系统而抑制肿瘤的生长［64］。由于体内外实验证明外泌体具有抗肿瘤作用，故外泌体作为抗肿瘤疫苗被广泛研究。

由于外泌体脂质双层膜的保护，其内的蛋白质、DNA片段、mRNA、miRNA等具有更高的稳定性和肿瘤特异性。多项研究发现，外泌体中的蛋白质、核酸分子可能在肺癌诊断中有重要价值［65，66］。Cazzoli等［67］从10例肺腺癌、10例肺肉芽肿和10例健康吸烟者应用qPCR技术筛选出742个miRNAs，应用WEAK软件进行统计分析和建模，用50例肺腺癌、30例肺肉芽肿和25例健康吸烟者进行验证。结果发现，4个miRNA（miR-378a、miR379、miR139-5p和miR-200b-5p）能够区分肺结节和非肺结节（敏感性、特异性及ROC曲线下面积分别为97.5%、72%和90.8%）；6个miRNA（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p）能够区分肺癌和肉芽肿（敏感性、特异性及ROC曲线下面积分别为96%、60%和76%）。作者认为应进一步扩大样本量验证该模型的预测效力。Li等［68］发现β-榄香烯治疗肺癌可能是通过上调p53表达和提高外泌体的释放发挥作用的。

由于目前提取外泌体的方法（差速离心法）重复性差、不稳定及对外泌体包含物的分析缺乏统一的技术标准等原因，迄今对外泌体所知甚少。但鉴于外泌体包含物的重要性和多样性，其在肺癌的诊断和治疗中必将发挥重要作用。

三、分子检测中的病理质控

分子检测需要注意以下规范：实验室规范、标本处理规范、操作人员规范、应用产品规范。其中标本处理规范中最重要的当属病理质控。

2011年《中国非小细胞肺癌EGFR基因突变检测共识》和2014年《中国表皮生长因子受体基因敏感突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南》就病理质控做了明确要求［69，70］：“组织切片：无论哪种标本类型，均应保证包含有至少200~400个肿瘤细胞，尽量剔除非肿瘤组织和细胞，应用灵敏度高的方法时可酌情降低。一般需切5~10μm的切片10张以满足对肿瘤细胞数量的要求，切片时要有措施避免不同病例组织间的交叉污染。上述标本的质量控制应由有经验的病理医师负责”。

指南对上述标本处理方法做了细节上的补充：“必要时显微镜下定位标出肿瘤组织区域进行人工切割刮取组织，以保证有足量的肿瘤细胞提取。对于肿瘤细胞数量不达标的样本应该重新采集。应有措施避免不同病例组织间的交叉污染”、“所有标本均应该在尽量短的时间内完成检测”。

小活检标本、细胞学标本因为肿瘤细胞含量小，病理质控显得尤为重要。有研究表明［38］，细胞学标本与组织标本检测EGFR突变状态不一致的原因在于病理质控，包含三点：DNA浓度、肿瘤细胞数量和肿瘤细胞比例。以下条件满足其中之一时细胞学样本和组织样本检测的EGFR突变状态可以达到100%匹配：DNA浓度>25ng/μl，肿瘤细胞数量>30个，肿瘤细胞比例>30%。

四、主要分子靶点

EGFR及ALK的检测已较为成熟，也有相应的指南［69，70］。在肺腺癌中，EGFR突变、ALK融合基因已成为肺癌首次诊断时的常规检测。驱动基因HER-2、RET、c-MET及潜在的生物标志物ERCC1、BRCA1、TUBB3、RRM1及TS等也是较为常用的检测靶点。

（一）EGFR

EGFR的突变状态与EGFR-TKIs疗效显著相关。EGFR检测分两步，第一步提取DNA，第二步检测EGFR突变状态［69，70］。

1.提取DNA

DNA的提取有很多方法。当组织样本较少时，推荐使用简单的吸附柱提取法，如基因组DNA提取试剂盒Q1Aamp DNA Mini Kit；当组织比较多时，可以采用针对甲醛固定石蜡包埋组织的DNA提取法，如Q1Aamp DNA FFPE Tissue Kit。只有DNA模板的PCR产物量足够时才能进行基因突变检测。众所周知，DNA模板的质量比数量更重要。为了提高检测成功率，建议对提取的DNA模板进行质量检测，以确定其符合一定的质量标准，质量检测的结果应当报告给临床医师。

2.EGFR基因突变检测技术

目前有很多EGFR基因突变检测的方法，包括直接测序法、基于即时PCR基础上的方法（如ARMS法）、片段长度分析、变性高效液相色谱技术等。这些方法各有优势和劣势。目前对于哪种方法更具优势尚未达成共识。DNA测序法应用较广，它可以检测所有的突变，但通常比较费时。基于实时PCR基础上的方法（如ARMS法）较直接测序法灵敏，但是只能检测已知突变。

不管使用何种方法，如果DNA模板量较少时，应当先检测最常见的突变（外显子19和21）。表4-1列举了文献中几种主要的关于EGFR基因突变检测方法的灵敏度和特性。

（1）直接测序法：

直接测序法是最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法，也是目前广泛应用的EGFR基因突变检测法。但由于直接测序法灵敏度相对较低，同时肿瘤组织具有异质性，突变型肿瘤细胞与野生型细胞掺杂在一起，当突变DNA比例小时直接测序法可能不能敏感地检测出突变。另外，由于实验过程中涉及PCR产物的多次开管操作，需特别注意防止交叉污染。

（2）基于即时PCR基础上的方法（如ARMS法）：

该法检测灵敏度比直接测序有所提高，可检测样品中0.1%~1.0%的突变基因。该方法在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度，可以避免石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点。该方法结合即时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无须产物的后处理，极大程度地避免了扩增产物的污染，易于在临床样品检测开展。

3.检测结果的重复验证

如果发现了新的突变，应当重复进行检测。当测序结果不理想（使用测序法），或者循环阈值接近定义的下限值（使用ARMS法），或者不符合其他质量标准时，也应当重复进行检测。如果检测失败，可以采取以下措施：从新的组织切片中提取DNA重新测序或ARMS检测；用不同的样品重复检测；与病理医师讨论其他的措施。在重复检测时，最好从组织采样重新开始，复杂的样品可以和主管的临床医师一起讨论。

（二）ALK

目前针对ALK融合基因检测常用的方法主要有3种［71］：FISH、基于PCR扩增基础上的技术［cDNA末端快速扩增PCR（RACE-PCR）或逆转录（RT）-PCR联合测序技术、实时荧光定量RT-PCR反应等］和针对融合蛋白表达的IHC方法。上述3种方法各有其优缺点（表4-2）。

1.FISH

大部分克唑替尼治疗ALK阳性NSCLC的临床试验均是基于FISH的诊断，因此，FISH检测目前仍是确定ALK融合基因的参照标准方法。FDA已批准的FISH分离探针试剂盒（Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit；Abbott Molecular，Inc.）可用于检测ALK融合基因的表达。标本FISH阳性结果的判定标准为：至少观察50个肿瘤细胞，如果50个肺癌细胞中至少有25个存在分离信号（>50%）则直接判断为ALK FISH阳性；如果计数的50个细胞中分离信号细胞为5~25个（即分离率在10%~50%之间），则需重复计数50个肿瘤细胞，累加100个细胞中超过15个存在分离信号（≥15%）则为ALK FISH阳性标本。

ALK FISH技术适用的组织样本类型：4%中性甲醛固定后石蜡包埋标本，防脱玻片切片厚度3~5μm。

原位杂交技术检测ALK变异也存在不足之处。首先，FISH检测对于操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训。只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性。其次，晚期NSCLC患者通常只能提供mm左右的小活检组织，有时很难保证存在50个以上的肺癌细胞进行阳性判读。FISH检测结果要求≥15%的判断界值（cut off）也存在商榷之处，研究结果显示少数ALK融合基因FISH检测阴性、ALK融合蛋白IHC检测阳性的患者能从靶向药物的治疗中明显获益。最后，目前FISH检测的成本昂贵，且不能明确ALK融合基因的具体融合变体。因此，虽然FISH检测仍是诊断的重要手段，但现阶段尚无法适用于中国ALK阳性NSCLC患者的大规模筛查和诊断。

2.IHC

（1）常规IHC技术：

由于FISH检测在中国普及困难，已有较多学者不断探索其他的分子诊断检测方法。IHC因其具有简便易行、价格便宜、操作方法成熟等特点，成为潜在的有效筛查方法。早期的ALK融合蛋白的IHC抗体敏感性较低，因此，不适宜用于ALK融合蛋白的检测。随着技术的改进，具有高度亲和力的D5F3和5A4抗体检测ALK融合蛋白的敏感性和特异性分别达到了100%和95%~99%，为其临床应用提供了充分的实验依据。总结已报道的数据后发现，常规（指非自动化仪器辅助的手工操作）IHC检测的强阳性与FISH检测阳性之间存在高度的一致性，如IHC 3+到0分的患者FISH阳性率分别为97.4%、62.5%、14.3%和0［71］。采用IHC法需注意以下两点：①由于ALK蛋白表达与神经外胚层的分化有关，故其可能在SCLC和正常人的脑组织中存在表达，因此，不建议在SCLC中使用IHC法检测ALK融合蛋白。②常规IHC的阳性标准判定尚未统一。推荐常规方法IHC的判读如下：IHC+++：>5%的肿瘤细胞呈现颗粒状细胞质强着色；IHC++：>5%的肿瘤细胞呈现中度细胞质着色；IHC+：>5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质着色或≤5%的肿瘤细胞有任何程度的着色；IHC 0：肿瘤细胞无着色。

（2）Ventana IHC：

由罗氏公司开发的Ventana ALK融合蛋白IHC诊断试剂盒已经在欧洲获批用于诊断ALK阳性NSCLC。由于其在自动化仪器上操作，可使检测流程和结果判读都得以标准化。该技术平台使用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶（HRP）系统的染色信号放大技术。在不影响检测特异性的前提下，提高了ALK融合蛋白IHC检测的敏感性。结果判读时采用二分类系统，即仅为阳性和阴性两种，阳性结果即可诊断为ALK阳性NSCLC。数据表明其与FISH结果的吻合率达到98.8%，结果判读的可重复性为99.7%，由于该法与FISH结果高度一致，重复性极佳，加之其可自动化检测，费用低廉，故应用前景广阔，有取代FISH的趋势。期待其在中国正式获批后可应用于临床诊断。

常规或Ventana IHC技术适用的临床标本类型：4%中性甲醛固定后石蜡包埋标本，防脱玻片切片厚度3~5μm。

由于常规IHC的上述特点，考虑到临床实践中的可操作性和患者可接受性，我们推荐在条件缺乏的地区可采用常规IHC法进行ALK融合基因阳性NSCLC患者的筛查，且经常规IHC检出为阳性的患者必须接受FISH、序列特异性的PCR技术或Ventana IHC其中任意一种技术进行进一步确诊。

3.基于PCR扩增基础上的方法

（1）实时定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）：

qRT-PCR法检测ALK融合基因的特点在于快速、简便易行、能同时明确ALK基因已知的融合变体的类型。RT-PCR对RNA提取的质量要求较高，国内部分实验室未具备严格的质量控制条件。此外，在NSCLC中已陆续发现了20多种不同的ALK基因融合变体，但不能排除仍有未知融合变体的存在。因此，无法检测未知的融合型是其最大的不足之处。这些因素限制了RT-PCR在ALK融合基因诊断中的应用。目前已有经CFDA批准用于临床检测的商业化试剂盒，其可通过多重引物RT-PCR法，仅需100~500ng肿瘤组织的RNA，即可检测出EML4-ALK融合基因的阳性信号。该试剂盒可检测7种不同的EML4-ALK融合基因型，基本涵盖了常见的EML4-ALK融合基因型。该方法适用于甲醛固定石蜡包埋肿瘤组织样本和各类新鲜组织或细胞学标本。

（2）RACE-PCR联合测序方法：

Zhang等采用RACE-PCR联合测序技术成功检测分析了ALK基因的融合变异。该方法采用cDNA末端快速扩增技术结合两轮PCR技术来富集扩增ALK基因的融合变体，敏感性高，且不限于检测EML4基因与ALK基因的融合，还可以检测到其他基因与ALK基因的融合，联合PCR产物的直接测序步骤能够明确融合是来自EML4-ALK融合基因多种变体中的具体哪一种。这具有覆盖未知变体的临床意义。已知不同EML4-ALK融合基因变体的酪氨酸激酶活性程度有明显差异，因而可能对临床用药剂量有一定的指导价值。该方法主要适用于各类新鲜组织或细胞学标本。

（3）引物特异性的RT-PCR联合测序方法：

引物特异性RT-PCR是确认NSCLC存在ALK融合基因的另一种快速诊断方法。技术优势在于其检测突变转录本的敏感性高，简便可靠，如发现扩增产物则意味着ALK融合基因（可确定ALK融合型）。该技术也存在一些不足。第一，RT-PCR分析必须基于单管多重技术（multiplex），由于EML4-ALK融合基因至少存在11种变异和非EML4基因的其他融合配对者，所以任何基于PCR的检测策略必须配对所有已知ALK融合基因的明确引物，否则对于潜在的非EML4基因的配对者与ALK基因融合就无法检测出来，而且对于潜在的EML4基因第21号外显子与ALK基因融合的转录变体长度达1284bp，也可能难于检测。第二，肺癌患者甲醛固定石蜡包埋组织提取的RNA很容易降解，故采用RT-PCR法检测石蜡包埋标本RNA的难度较大（福尔马林固定、石蜡包埋标本保存2年以上者不建议应用RT-PCR法检测ALK重排）；若为新鲜肿瘤组织，RT-PCR法检测ALK重排应为首选。第三，存在出现非特异性扩增导致假阳性的风险。因此，对实验室的环境要求较高，以防出现交叉污染。该方法在常规临床诊断实验室可能难以开展。

（三）其他融合基因

如ROS1及RET等，其检测方法仍以上述三种方法为主。其中FISH是“金标准”，IHC仍未被确定用于ROS1及RET的检测，RT-PCR可能会漏诊新的融合基因。应用NGS进行驱动基因检测可能是今后的发展趋势。

上述三类技术都可以选择，各有优缺点，它们的特异性均很好，但ALK-FISH的敏感性最低（已经有ALK-FISH阴性而ALK-ventana IHC阳性的患者经克唑替尼治疗获益的病例）；RT-PCR法敏感性最高，其不仅可检测ALK基因重排，而且可以鉴定ALK融合基因的变异型，还可以判断NSCLC肿瘤组织中EML4-ALK细胞的丰度［72］。这些方法存在一定的互补性，应结合临床可获得的各类生物材料样本（手术或穿刺活检组织、胸腔积液细胞学和痰液细胞学等），有效利用各种检测分析技术，以获得最佳检测效果。

鉴于ALK基因重排或融合的分子诊断各种方法均有优缺点，且我国适用于ALK变异检测的肺癌患者人数众多，需要在临床建立一套行之有效的分子诊断流程。IHC因其具有方便、易行、价格低的优势，适合于ALK阳性NSCLC的筛查。FISH和RT-PCR扩增联合测序技术，则由于结果判读客观，且qRT-PCR已获CFDA批准用于临床检测，适合于最终的确诊。专家组推荐ALK基因状态检测的总体原则：应综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件，进行多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证ALK阳性肺癌的检出率和准确率。适合ALK融合基因诊断的肿瘤样本，包括各种组织样本和细胞学标本。标本需由有经验的病理医师确定肿瘤基本类型并负责质量控制。组织标本获取手段包括手术切除、支气管镜检、经胸壁肺活检、淋巴结活检、手术活检等。对于恶性胸腔积液、心包积液、痰液或支气管灌洗液、细胞学穿刺和外周血CTCs等样本，在细胞数量充足条件下可制备细胞学样本蜡块，检测方法可采用FISH或IHC，如果是新鲜细胞标本可考虑采用特异性PCR方法。考虑到细胞学样本细胞数量少等特点，细胞学标本的检测结果解释需格外谨慎。综合考虑上述讨论因素：各类检测技术的优缺点、各组织类型的技术适用性特点、ALK融合基因表达的临床病理学富集特点，初步拟出以下用于临床实践的检测流程图（图4-7）。专家组建议基于我国肺癌患者众多，可考虑非排他性地优先检测部分临床病理特征集中、ALK基因融合可能性较大的肺癌患者（如黏液型或含印戒细胞的腺癌患者及EGFR基因状态为野生型的腺癌患者）。对于适合检测的肿瘤标本可直接选择FISH或序列特异性RT-PCR方法或Ventana IHC进行分子检测诊断。对于EGFR基因状态未知或EGFR基因突变患者在EGFR-TKIs治疗后发生继发性耐药的患者，由于存在EGFR基因突变和ALK基因变异双阳性的可能，因此，也建议同时进行ALK融合基因检测。

（四）HER-2等其他靶点

NSCLC研究较多的靶点还包括HER-2、RET、c-MET等［73］，检测类型包括突变、转座（融合）和扩增（表4-3）。目前这些分子在肺癌中的检测尚没有形成共识。HER-2在乳腺癌中有检测指南，但检测的是HER-2扩增，而肺癌中HER-2突变也是一种较为重要的驱动基因改变［74］。虽然如此，已有针对这些分子检测的通过CFDA认证的商品化试剂盒。以PI3K为例，通过认证的有荧光PCR法试剂盒和流式荧光原位杂交法试剂盒。

（五）ERCC1、BRCA1、TUBB3、RRM1、TS等化疗疗效预测因子

DNA损伤修复基因ERCC1和BRCA1，其mRNA表达水平与铂类疗效相关［75］。β微管蛋白（β-tubulin）是构成微管的主要成分，有7种亚型，已有研究证实其中Ⅲ型TUBB3的表达与紫杉醇化疗敏感性相关［76］。核苷酸还原酶是DNA合成通路中的限速酶，包括RRM1、RRM2两个亚单位。其中RRM1是核苷酸结合位点，控制DNA合成底物的特异性和酶的活性，也是核苷类似物的化疗药物吉西他滨的结合位点，并且在体外细胞研究中发现RRM1高表达与吉西他滨耐药密切相关［77］。培美曲塞是基于经典的抗代谢类化疗药物甲氨蝶呤、氟尿嘧啶基础上的新一代抗代谢药物，它是一种多靶点的叶酸拮抗剂，通过破坏细胞复制所必需的叶酸依赖性辅酶，从而抑制细胞复制，TS是培美曲塞的作用靶点之一。临床前研究显示了TS在肺鳞癌中的表达水平明显高于肺腺癌，并且其表达与培美曲塞的敏感性相关，即TS表达越高，培美曲塞的敏感性越低［78］（详见第二章）。

这些分子均需要检测表达水平。定性和半定量可以通过IHC相应的蛋白表达水平，绝对定量需通过检测相应的mRNA表达水平。由于IHC半定量存在抗体可靠性、病理医师经验等问题，2014年TASTE研究表明现有ERCC1抗体并不可靠，不适宜临床检测［79］。检测mRNA表达量总体上分三步：提取mRNA，逆转录为cDNA，荧光定量PCR。其中提取mRNA、逆转录已有成熟的商品化试剂盒，荧光定量PCR扩增试剂盒多是在荧光标记和引物设计上的不同，虽有一些临床应用，但尚无经CFDA认证的可用于临床的检测试剂盒。

五、小结

随着靶向治疗的蓬勃发展，分子检测日益成为个体化治疗实施过程中的关键环节。最初基于酶切位点的RFLP方法仅能检测很小一部分基因变异，且其灵敏度和特异度较差。20世纪70年代，随着一代测序的兴起，分子检测的便捷性和灵敏度得到了大幅提升，sanger测序、焦磷酸测序等方法灵敏度可达20%。目前，ARMS法、dPCR法、NGS等方法不仅可以同时检测多种基因变异，灵敏度达千分之一以上，而且可以应用手术切除、小活检、胸腔积液、腹水等多种标本，在一天之内便可得到检测结果。

然而，随着技术的快速进步，新的问题也不断出现。假阴性、假阳性困扰着病理和临床工作者。排除实验室污染的原因后，假阴性常发生在小活检及细胞学标本中，多数是由于病理质控不严所致，如肿瘤细胞数量、比例不达标等。这就对病理科医师提出了更高的要求，在标本较少的情况下，尽可能的筛选肿瘤细胞富集区域进行分子检测，假阳性发生的概率极小。有研究对比了应用ARMS法和dPCR法同时检测石蜡包埋组织标本和冰冻组织标本，发现应用具有超高灵敏度的dPCR法检测石蜡包埋标本时偶可发生假阳性，其原因可能与标本的石蜡包埋过程相关。

超高灵敏度的检测方法主要是dPCR和NGS。因为灵敏度高，这两种方法可以以血液作为标本检测分子变异，极大地方便了标本采集和疗效的动态监控。并且这两种方法在定量和高通量方面均表现卓越。dPCR可以实现绝对定量，区分出标本中变异细胞和野生型细胞的比例；NGS可以同时检测多个基因，甚至整个基因组序列变异。从低灵敏度到千分之一灵敏度，从定性到定量，从单基因到多基因，从静态到动态，从手术标本到小活检标本，从细胞学标本到血液标本，技术进步始终引领着分子检测的发展方向，也为准确反映肿瘤遗传异质性和治疗压力选择下基因动态变化（如耐药等）及其规律提供了可能，最终为肺癌患者制定个体化治疗方案提供可靠依据。

（杨拴盈　肖婧媛　孟夏）

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