第三节 拉曼光谱
一、拉曼散射
1928年，印度物理学家拉曼（Chandrasekhara V. Raman）在研究苯的光散射时发现，在散射光中除了有与入射光频率相同的谱线外，还有与入射光频率发生位移且强度极弱的谱线。后者是新发现的，后来以发现者拉曼的名字命名为拉曼散射光，与之对应的光现象称为拉曼效应。基于拉曼散射的发现，1930年拉曼先生获得了诺贝尔物理学奖。
光散射（图1-5-4）其实是一种非常常见的自然现象，晴朗的天空呈蓝色、早晚东西方的空中出现红色霞光、广阔的大海是一幅深蓝色的景象，这些都是大气和海水对太阳光的散射造成的。当一束光照射到介质时，大部分的光被介质反射或透过，另一部分的光被介质散射到其他方向，即为散射光。在散射光中除了有与入射光频率相同的谱线外，还有与入射光频率发生位移（频率增加或减少）且强度极弱的谱线（大约占总散射光的10-6～10-8），前者是已知的瑞利（Rayleigh）散射光，称为瑞利效应，属于弹性散射，后者就是拉曼散射光，称为拉曼效应，属于非弹性散射光。
电磁波与物质相互作用时会发生吸收、反射、散射等过程。其中散射光包括弹性散射和非弹性散射两种。拉曼散射是光散射现象的一种，单色光束的入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞，在弹性碰撞过程中，光子与分子间没有能量交换，光子只改变运动方向而不改变频率，这种散射过程称为瑞利散射（Rayleigh scatterin），而在非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅仅改变运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，或者分子的振动和转动能量传递给光子，从而改变了光子的频率，这种散射过程称为拉曼散射。拉曼散射光和瑞利散射光的频率之差值称之为拉曼位移。拉曼谱线的数目，拉曼位移值的大小和谱带的强度等都与物质分子的振动和转动有关，这些信息就反映了分子的构象及其所处的环境。
在入射光的照射下，分子先由基态E0（或振动激发态E1）被激发至虚态（virtual state），该能级介于基态和电子第一激发态之间，随即发出光子，分子能量回到振动激发态E1（或基态E0），光子失去（或得到）的能量与分子得到（或失去）的能量相等（图1-5-5）。不同的化学键或基团有不同的振动能级，△E反映了指定能级的变化。所以，与之相对应的光子频率变化也是具有特征性的，根据光子频率的变化可以判断出分子中所含有的化学键或基团。
二、拉曼光谱的基本原理
拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气体、液体或固体。每一种物质（分子）有自己的特征拉曼光谱，因此可以作为表征这一物质之用。每一物质的拉曼频率位移（即入射频率与散射频率之差）与入射光的频率无关。拉曼散射是瞬时的，即入射光消失时，拉曼散射在10-11～10-12秒（万亿分之一秒）后消失。拉曼谱线的线宽一般较窄，并且成对出现，即具有数值相同的正负频率差。在短于入射光波长（v0+v）一边的称为反斯托克斯（anti-Stokes）线，在长波长（v0-v）一边的称为斯托克斯线（Stokes）。
拉曼光谱研究分子振动和转动模式的机制与红外光谱不同，但它们提供的结构信息是类似的，都是关于分子内部各种简正振动频率及有关振动能级的情况，可用于鉴定分子中存在的官能团。一些同核原子对称结构的官能团（如：—C==C—、—N==N—、—S—S—等）在红外光谱仪较难检测的信息，在拉曼光谱仪上却有较强的反映；而在红外光谱中有很强吸收峰的不均衡对称的官能团，在拉曼光谱却表现很弱。因此，拉曼光谱与红外光谱相互补充，成为研究物质分子结构的有效手段。
拉曼光谱技术具有直接、准确、快速、无损等优点。1960年激光技术的发明，为拉曼光谱的研究提供了高强度的激光光源，有力地促进了拉曼光谱技术的发展；20世纪80年代以后高性能光电器件的广泛应用和计算机技术的结合，又使拉曼光谱获得新的生命力，就此开辟了研究激光拉曼光谱学的新热潮。这些技术的不断进步使拉曼光谱仪的检测精度和检测范围得到了巨大的提高。拉曼光谱已成为现代科学研究中一个重要的中坚力量。目前，它已成功地应用于生物医学、食品与医药化工、石油化工、纳米新材料、公安刑侦与司法鉴定、矿物勘探、考古、环境科学等诸多领域。
三、拉曼光谱的特点
拉曼光谱具有以下特点：
1.拉曼光谱的常规扫描范围为40～4000cm-1。
2.固体粉末样品、高聚物、纤维、单晶、溶液等各种样品都可以做拉曼光谱。溶液样品可以安装在玻璃瓶及玻璃毛细管中，因为拉曼散射可以完全透过玻璃。
3.固体粉末样品可以直接进行测定，不必制样。但样品可能被高强度激光束烧焦。在拉曼光谱中激光束是作为激发光源的。
4.水的拉曼光谱很弱，所以水是优良的溶剂。
5.有色物质和有荧光的物质难以进行测定。
6.红外光谱和拉曼光谱都反映了分子振动的变化，红外光谱适用于分子基团的测定，拉曼光谱更适用于分子骨架的测定。
四、拉曼光谱仪
拉曼光谱仪与红外光谱仪相比，其发展较缓慢，早期拉曼光谱仪以汞弧灯为激发光源，拉曼信号十分微弱，20世纪60年代以来，激光技术的出现拯救了一度陷于停滞的拉曼光谱学，使其获得新生并取得了革命性进展，形成了一个十分活跃的光谱学分支。80年代以来，随着激光技术、计算机技术、光电技术的迅速发展，拉曼光谱技术也随之有了飞速的发展，由于各组成部分的配置上有所改变，现代拉曼光谱仪（图1-5-6）已发展成系列产品。拉曼散射已经形成一系列光谱技术，主要有自发拉曼散射、共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉漫反射、表面增强拉曼散射、时间分辨拉曼散射和傅里叶变换（Fourier transfer，FT）拉曼散射。多种拉曼手段的提出和发展，不断开拓了拉曼技术应用的广度和深度，在物质结构等许多研究领域上都活跃起来，其范围还在不断地扩大，作用日渐显著，成果丰硕。
五、拉曼光谱的应用
20世纪90年代之后，随着光纤样品探头、组合光学设计、计算机以及数据获取、处理、分析等技术的发展，解决了仪器的一些局限，从而使拉曼光谱仪的性能得到很大提高，使其更具有实际应用的价值。可用于原料药的水分分析、溶剂残留、晶型鉴定、晶型与结晶度的定量分析，药物制剂中各组分解析及药物与机体作用后的结构信息。此外也用于中药材鉴定与药材中有效成分的分析（图1-5-7～图1-5-9），混淆品的鉴别等。
在拉曼光谱中水的拉曼吸收很弱，因此很多水溶性物质，包括一些生物大分子及其他生物体内组分可以用拉曼光谱来研究。例如，蛋白质、酶、核酸等生物活性物质常需要在水溶液中接近生物体内环境下研究其一些性质，此时拉曼光谱比红外光谱更合适。可对这些生物大分子的构象、氢键和氨基酸残基周围环境等方面提供大量的结构信息。相干反斯托克斯拉曼光谱显微学（CARS Microscopy）和受激拉曼散射（stimulated Raman scattering，SRS）显微技术在拉曼激光在生物技术和医学研究中取得了重大的突破，实现了活细胞的生物分子成像。
CARS显微术通过一种叫做自发拉曼散射的现象来增强信号。在自发拉曼散射中，样品内的化学键能够改变通过其中的光的波长。通过使用两束激光，它们的频率差等于需要成像化学键的振动频率，细胞产生的微弱的拉曼信号能够被不断放大。它的灵敏度比自发拉曼散射的灵敏度高了好几个数量级。哈佛大学谢晓亮和他的同事证明，CARS可以用于活细胞研究。但是CARS也有缺陷，在同一时间里，它只集中在很宽的拉曼谱中很短的一段，限制了所能采集的信号的数量，同时还带来了很高的背景信号。
近年谢晓亮研究组提出了利用其研究组自身研发的技术——受激拉曼散射（stimulated Raman scattering，SRS）显微技术进行实验的新方法。这种新方法利用不需要荧光标记的受激拉曼散射显微仪进行定量成像，克服了生化分析方法繁琐的色谱分析等问题，是一种简单精确，适用于高通量分析的新技术。这项研究应用的SRS显微技术能通过对激光迅速反应，精确调制来去除背景噪声，从而不仅能够得到与传统拉曼光谱一样的谱图，而且信号强度高了几个数量级。将SRS显微技术与RNAi技术结合起来，能帮助研究人员在线虫的活性生理条件下观察脂肪代谢调控（图1-5-10），而且这种方法不需要标记，极大的简化了样品准备过程，适用于模式生物的细胞追踪，也有利于高通量筛选分析。
