10 脓毒症免疫抑制的研究进展
据统计，全球每年脓毒症例数高达3000万，死亡例数近600万。世界卫生组织于2017年5月将脓毒症列为“全球医疗优先关注的疾病”。2016年脓毒症3.0版最新定义为，机体对感染的反应失调而导致的危及生命的脏器功能障碍。近年研究发现，脓毒症的发病过程中机体并非处于持续的过度炎症反应状态，还合并免疫抑制。脓毒症免疫抑制既可伴随初始过度激活的炎症反应发生，也可表现为过度炎症反应后延迟出现的免疫抑制。随着实验与临床研究的蓬勃发展，脓毒症免疫抑制的机制被逐渐发现，并不断得到重新认识。本综述将重点从细胞分子水平探讨脓毒症免疫抑制的机制，免疫抑制导致的固有免疫应答与适应性免疫应答的改变，并对免疫刺激治疗予以回顾和展望。
一、脓毒症免疫抑制的机制
程序性细胞死亡也称凋亡，是免疫系统清除激活细胞维持免疫稳态的方式。脓毒症时免疫细胞异常凋亡是描述最多的促进机体出现免疫抑制的机制。线粒体介导的内源性凋亡和死亡受体介导的外源性凋亡均被激活，由此介导中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）以及淋巴细胞等多种免疫细胞凋亡增加。一方面，这会导致患者血液CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、DCs等免疫细胞数量锐减，相应免疫应答受损；另一方面，凋亡细胞本质上具有免疫抑制和免疫耐受的特性，故会影响DCs的成熟与功能。DCs作为机体功能最强的专职抗原递呈细胞，能高效摄取、加工处理和递呈抗原，有效激活初始型T细胞，树突状细胞的成熟与功能障碍将导致其介导的免疫应答受到严重抑制。此外，凋亡细胞增加后单核细胞、巨噬细胞等在吞噬清理其他凋亡细胞的同时分泌大量IL-10等免疫抑制因子。因此，细胞凋亡的增加会促进免疫系统向抗炎型、免疫抑制的方向转变，而动物研究已证实，抗凋亡治疗可降低脓毒症小鼠的死亡率，改善其免疫功能状态。
自噬作为一种细胞保护性程序能介导细胞死亡，同时与凋亡存在相互关联。Lin CW等采用小鼠盲肠结扎（CLP）穿孔制作脓毒症模型后发现，脓毒症诱导T细胞凋亡增加的同时，其脾脏CD4+、CD8+T细胞的自噬水平却下调。Oami T等研究发现，小鼠淋巴细胞自噬基因Atg5或Atg7（自噬过程必需的基因）的条件性敲除，将导致小鼠死亡率、T细胞凋亡及免疫功能异常程度显著增加；利用T细胞Atg5基因条件性敲除小鼠构建CLP脓毒症模型，则发现T细胞自噬缺陷将导致其分泌的IL-10显著增加。总之，上述研究表明，自噬缺陷可促进脓毒症免疫抑制的发生。
近年来，学术界逐渐从能量代谢调控免疫细胞功能的角度研究脓毒症免疫抑制的机制。免疫细胞活化、分化和增殖功能的维持与改变，均需要能量代谢提供ATP。能量代谢的底物，如葡萄糖可通过糖酵解或氧化磷酸化分解代谢产生ATP。虽然糖酵解途径产生能量少，但该途径可快速启动，以利于迅速产生ATP。静息状态的免疫细胞能量需求低，主要通过氧化磷酸化途径产生ATP供能；活化状态的淋巴细胞需要持续的大量能量供应，因此更依赖糖酵解途径。这种细胞内代谢模式的改变过程，即为代谢重编程。其中由氧化磷酸化向糖酵解转换的过程，也称Warburg效应，可使细胞快速生成ATP以维持其能量需求。
脓毒症可诱发免疫细胞的代谢重编程。通过对脓毒症患者转录与代谢谱的分析发现，白细胞代谢模式由氧化磷酸化向无氧酵解转变是脓毒症宿主防御反应启始阶段的重要组成部分。脓毒症在急性过度炎性反应状态下，白细胞转录因子谱呈现糖酵解途径基因表达增加，在后期的免疫耐受状态下，调控糖酵解的基因表达下调。在过度炎症与免疫耐受状态下，单核细胞截然不同的炎症因子表达与细胞代谢模式的显著差异密切相关。Cheng SC等研究发现，脓毒症患者存在包括单核细胞糖酵解与氧耗降低在内的多种代谢缺陷，且均与mTOR通路功能异常相关；二甲双胍可抑制小鼠的糖代谢，导致细胞因子生成显著减少，增加小鼠全身性真菌感染的死亡率。因此，目前认为代谢状态改变参与脓毒症导致的免疫功能变化。
内毒素耐受是机体的一种适应性反应，是指宿主长期多次接触或注射亚致死量脂多糖后，再次遭遇脂多糖刺激时产生促炎因子的能力下降或无反应。离体研究发现，多种髓样细胞在接受初始内毒素刺激后会出现内毒素耐受。内毒素耐受的单核细胞，其抗原递呈功能和趋化能力均减弱，但杀灭、内吞病原体的能力保持不变。内毒素耐受时免疫细胞内基因转录发生变化，表现为编码促炎细胞因子和趋化因子的基因（被称为“耐受基因”）表达降低，而非耐受基因表达增加，导致机体免疫系统分泌大量免疫抑制细胞因子（如IL-10），促炎因子如TNF-α、IL-6分泌减少，进而诱导或加重免疫抑制。
中枢神经系统在抑制感染与炎症诱发的免疫应答过程中也发挥重要作用。中枢神经系统主要通过交感与副交感通路、下丘脑-垂体-肾上腺轴控制炎症反应。交感与副交感通路可通过其神经支配的淋巴器官发挥局部调控作用；下丘脑-垂体-肾上腺轴可通过释放糖皮质激素发挥全身调控作用。Dalli J等研究发现，小鼠迷走神经离断后腹膜固有髓样细胞的数量降低，腹膜巨噬细胞的免疫反应失调，腹膜脂类介质谱表达失调（其特征为消退素水平降低），最终导致小鼠感染大肠埃希菌后的炎症消退延迟。Singer BH等则提出，脓毒症可诱发中枢神经系统小胶质细胞慢性炎症，由此形成持续的抗炎反馈环路。尽管脓毒症时中枢神经系统在启动强烈抗炎反应中作用是确定的，但每个系统和通路如何发挥免疫抑制作用仍有待进一步研究。
表观遗传学是一门基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化的遗传学分支学科，如DNA甲基化和染色质构象变化等。表观遗传调控是脓毒症后大量基因发生转录重编程的关键机制，受调控的基因包括IRF5、CLEC12A、STAT6与CARD8等众多参与免疫功能调节的基因。转录的表观遗传调控可通过转录活化与转录沉寂发挥作用，其主要机制为转录后染色质组蛋白的修饰，如甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化。表观遗传调控参与脓毒症诱发的免疫抑制，并可传递给子代细胞，因此在脓毒症缓解后的较长时间内仍可对免疫应答反应发挥重要影响。脓毒症时固有免疫及获得性免疫功能均受累，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞及自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等表型和功能受到不同程度影响。
二、脓毒症免疫抑制与免疫功能改变
脓毒症免疫抑制可导致固有免疫应答（innate immune response）发生变化。固有免疫系统由机体组织屏障（如皮肤黏膜、微生物屏障、血-脑屏障等）、固有免疫细胞〔如吞噬细胞、DC、自然杀伤细胞（NK细胞）、自然杀伤T细胞（NK T细胞）、γδT细胞、B-1细胞等〕和固有体液免疫分子（如补体、细胞因子等）组成。体内固有免疫细胞和固有体液免疫分子识别、结合病原体及其产物或其他抗原性物质后，被迅速活化并产生相应的生物学效应，从而将病原体等抗原性异物杀伤清除。其主要特点是固有免疫细胞对多种病原体和其他抗原性异物均可应答，且不形成免疫记忆，维持时间较短。
脓毒症免疫抑制所导致的固有免疫应答改变，不仅发生在血液、骨髓中，也发生在远离初始病灶的其他器官，包括骨髓中未成熟中性粒细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）的释放增加，以及成熟中性粒细胞功能的转变。此外，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞的表型和功能也会发生改变，包括感受器功能降低、抗炎介质分泌增加、免疫检查点抑制剂表达增加等。这些变化均可导致宿主对感染的第一道免疫防线减弱，降低炎症反应和T细胞功能。
脓毒症免疫抑制也会导致适应性免疫应答（adaptive immune response）发生变化。参与机体适应性免疫应答的细胞和分子主要有αβT细胞、B-2细胞、特异性抗体和细胞因子。与固有免疫相比，适应性免疫的3个主要特点是特异性、耐受性和记忆性。初始T细胞通过T细胞受体（TCR）特异性识别结合APC表面的抗原肽——主要组织相容性复合物（MHC）所组成的复合物，启动抗原识别信号（即第一信号）；T细胞与APC表面多对协同刺激分子相互作用产生T细胞活化的第二信号。如果缺乏共刺激信号，第一信号非但不能有效激活特异性T细胞，反而导致T细胞无能。脓毒症免疫抑制导致的适应性免疫应答变化，可影响T细胞、B细胞和固有淋巴细胞的表型和功能。T细胞无能是脓毒症诱导免疫功能障碍的标志之一。这种免疫功能障碍表现在很多方面，尤其是与凋亡增多相关的细胞数量显著减少，并且T细胞水平与脓毒症严重程度及预后相关；功能改变如体外增殖能力的减弱、细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10）合成的减少。此外，脓毒症患者T淋巴细胞的IL-7受体α（IL-7Rα）和正性共刺激分子CD28表达减少，而介导负性信号的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和程序性死亡-1（PD-1）表达增加，同时，TCR的多样性也发生了改变。此外，B淋巴细胞的扩增减少，然而NK细胞和T淋巴细胞免疫检查点表达增加。
三、免疫抑制的临床结局
脓毒症患者持续的免疫缺陷，增加其在随后各种病原菌暴露中的易感性。逐渐增加的临床证据表明，脓毒症患者不能抵抗弱致病菌的原发性和继发性感染。即使经过合理的抗生素治疗，仍有大约80%的脓毒症死亡患者依然存在未清除的化脓性病灶。常见的继发性感染是由鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠球菌等只对免疫受损的宿主致病的微生物所致。此外，全身性真菌感染也是免疫重度受损后一个突出的并发症，同时脓毒症免疫缺陷导致的巨细胞病毒感染也明显增加了患者的死亡率。所有这些感染增加了患者的住院时间及远期死亡率。
许多研究表明除了长期持续的免疫抑制，脓毒症患者出院后持续的低水平的炎症反应和代偿性抗炎反应与免疫抑制机制有关，其中MDSCs具有重要作用。20世纪70年代以来，随着早期急救复苏和器官功能支持技术的长足进步，大部分脓毒症患者可以从早期的疾病打击下存活下来，28d病死率明显下降，然而长期随访发现，存活患者的2年和3年病死率可分别高达45%和71%。这部分脓毒症早期幸存者具有显著的临床特征，即持续的炎症反应、长期的分解代谢、营养不良。2012年，Moore等学者提出“持续性炎症、免疫抑制和分解代谢综合征”（PICS）的新概念来描述其临床特征。PICS是创伤、脓毒症等多种损伤因素导致的，以住院时间长、持续的炎症反应、免疫抑制、蛋白质高分解代谢为特点的一组临床综合征，通常表现为营养不良、反复院内感染，乏力，呼吸机依赖和精神障碍等，病死率较高。这些患者免疫状态的变化包括增加MDSC数量、单核细胞HLA-DR表达减少以及IL-6浓度增加。但是尚缺乏免疫状态评价指标来预测免疫抑制或炎症反应的时间，因此，目前PICS概念应用于脓毒症后长期的免疫状态需进一步评价。
四、免疫刺激治疗
免疫功能抑制的脓毒症患者常常合并仅在免疫功能受损时才致病的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肠球菌等导致的继发性感染。全身真菌感染与巨细胞病毒感染也是脓毒症免疫异常患者的常见并发症。因此，积极调理严重抑制的免疫系统、重建机体免疫平衡状态、恢复正常免疫功能是改善此类患者预后的关键。
免疫刺激治疗的目的是恢复免疫系统功能，以促进机体清除原发感染或对抗继发感染。免疫增强治疗须在免疫状态监测下进行，若于促炎反应占主导的阶段进行可能会导致更为严重的组织器官损伤。
胸腺肽α1是正常人体内分泌和合成的因子，能刺激淋巴细胞的增殖、分化，激活DCs，增强人体细胞的免疫功能。胸腺肽α1是目前临床应用较多的增强机体免疫反应的药物，已开始用于脓毒症治疗。动物实验表明，应用胸腺肽α1可使DCs增多，激活固有免疫反应，逆转LPS小鼠的免疫缺陷状态。临床试验也证明，胸腺肽α1能有效逆转脓毒症患者的免疫抑制状态，增强机体的免疫防御作用，降低脓毒症患者病死率，且胸腺肽α1联合传统治疗可改善脓毒症的临床预后。
IFNγ是由活化的TH1细胞和NK细胞产生的能激活固有免疫的关键细胞因子，是单核细胞最主要的活化剂，主要通过诱导多种抗原呈递细胞表达主要组织相容性复合体I/II分子，活化单核/巨噬细胞，通过增强其溶菌活性并分泌TNF-α、IL-1、IL-6等炎症介质发挥免疫增强作用。早在1997年就有报道，IFN-γ有利于改善脓毒症患者单核细胞的失能状态。许多研究表明，人类白细胞分化抗原HLADR表达水平下降是免疫功能低下的表现，单核/巨噬细胞和其他抗原递呈细胞表面的HLA-DR持续表达低下与脓毒症继发感染相关。Nakos M等对创伤患者的研究发现，吸入IFNγ治疗可促进肺泡巨噬细胞HLA-DR表达恢复，降低呼吸机相关性肺炎的发生率。Leentjens J等给予健康成年人反复多次注射LPS，以模拟脓毒症诱导的免疫抑制，发现在第2次注射LPS前注射IFN-γ能够增加外周血单核细胞HLA-DR的表达，且恢复炎症介质TNF-α的分泌，IL-10分泌明显减少，能逆转机体的免疫抑制状态。此后陆续有病案报道使用IFNγ治疗严重感染，甚至侵袭性真菌感染，以恢复和改善免疫功能，并取得良好疗效。然而，尚缺乏随机对照试验确认IFNγ对ICU内脓毒症免疫抑制患者的治疗效果。
GM-CSF是一种刺激骨髓生成中性粒细胞和单核细胞的造血细胞生长因子，可刺激单核细胞的活化和生存。Hall MW等研究表明，GM-CSF可恢复严重脓毒症患者单核细胞HLA-DR的表达，促进TNF-α释放，逆转免疫抑制状态。在一项纳入56例新生儿脓毒症的研究中，采用GM-CSF治疗使脓毒症后表达HLA-DR的巨噬细胞数目更早得到提升。Meisel C等纳入39例存在免疫异常的脓毒症患者的随机对照试验中，GM-CSF治疗使患者单核细胞的免疫功能得到明显恢复，缩短了患者机械通气时间、住院时间以及ICU治疗时间。Bo L等通过纳入12项共2380例脓毒症患者的meta分析表明，G-CSF或GM-CSF无法显著降低脓毒症患者院内死亡率，但可显著改善感染的逆转率。
IL-7是一种可由多种细胞分泌的促炎和抗凋亡因子，也是T、B细胞的生长因子。RhIL-7在临床上已被用于治疗特发性淋巴细胞减少和获得性淋巴细胞减少性疾病，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）感染以及经有效的抗反转录病毒治疗但淋巴细胞数量持续低下的患者。动物研究发现，IL-7可显著提高脓毒症小鼠的存活率，同时可抑制CD4+、CD8+T细胞凋亡，增强T细胞活性，促进免疫效应细胞募集至感染部位。对脓毒症患者T细胞进行体外培养后发现，在IL-7可恢复脓毒症诱导的CD4+、CD8+T细胞增殖能力减弱、IFN-γ合成减少、转录因子STAT5磷酸化水平和抗凋亡分子Bcl-2水平降低等。
免疫检查点是指免疫系统中存在的可负向调节免疫应答的信号通路，也称共抑制分子，主要包括PD-1及其配体PD-L1、PD-L2等。PD-1与其配体结合后，抑制T细胞增殖与IL-2、IFN-γ等细胞因子的产生，抑制B细胞增殖分化和免疫球蛋白的分泌，发挥负向调节免疫应答作用。近年研究发现，PD-1和PD-L1广泛表达于脓毒症患者的免疫效应细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞；脓毒症患者血液循环的免疫细胞PD1表达增加，其增高程度与免疫功能障碍和不良预后相关。针对脓毒症患者免疫细胞的体外研究发现，阻断PD-1或PD-L1信号通路可减轻脓毒症诱导的免疫失调。动物实验表明，使用抗PD-1和PD-L1抗体可减轻脓毒症导致的淋巴细胞损耗，增加TNF-α和IL-6合成，降低IL-10的产生，提高脓毒症小鼠清除细菌的能力，减轻器官衰竭程度，最终改善脓毒症小鼠生存率。此外，阻断PD-1信号通路还可显著降低由白念珠菌引起的原发或继发的真菌性脓毒症的死亡率。目前，应用该类抗体治疗癌症已较成熟，其在脓毒症中的应用仍缺乏大型国际多中心随机对照研究的证据。
五、总结
免疫抑制在脓毒症的发病机制中占有非常重要的地位，是导致脓毒症患者后期死亡的主要原因。脓毒症诱导免疫抑制的概念已提出近10年，其机制被逐渐发现并不断得到重新认识，包括免疫细胞凋亡、自噬、细胞代谢重编程、内毒素耐受、中枢神经系统调控以及表观遗传学调控等。免疫抑制不仅导致机体固有免疫应答发生改变，同时导致适应性免疫应答发生变化。积极调理严重抑制的免疫系统，重建机体免疫平衡状态是改善此类患者预后的关键。在监测免疫状态的条件下进行免疫增强治疗，如胸腺肽α1、IFNγ、IL-7、GM-CSF及免疫检查点抑制剂抗PD1抗体等，可能成为脓毒症治疗的新策略，但其临床效果仍需要大规模多中心的临床试验加以验证。
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