第一章 抗病毒疫苗的制备

——微生物的修修补补时代

19世纪末，微生物学遭遇了一场轰轰烈烈的革命，而正是路易·巴斯德（Louis Pasteur）和他的门徒们共同撑起了这场变革的一片天。那时，科学家们不甘示弱，纷纷走上了发现新病原体的赛道。自此之后，微生物们就被分为两大“阵营”：细菌和病毒。

欲走近抗病毒疫苗的世界，先要知己知彼。让我们走马观花式地认识一下它的敌人——病毒。病毒是何方神圣？疫苗又要有几班武艺才能克敌制胜呢？

19世纪末，微生物学遭遇了一场轰轰烈烈的革命，而正是路易·巴斯德（Louis Pasteur）和他的门徒们共同撑起了这场变革的一片天。那时，科学家们不甘示弱，纷纷走上了发现新病原体的赛道。自此之后，微生物们就被分为两大“阵营”：细菌和病毒。被“揪出”的细菌有引起伤寒症、破伤风、白喉还有霍乱的各种杆菌。细菌的主要特征为：我们能在光学显微镜下观察到，并可通过“肉汤培养基”进行培养。病毒则不同，它体积微小到用显微镜也无法观察到——直至1940年电子显微镜被发明后，病毒才无处遁形。此外，病毒是无法独立繁殖的。

那么，当时研究者们又如何判断病毒是否存在呢？以狂犬病毒为例，可以将一只患病动物的唾液注射给另一只健康动物，狗或兔子都行，如果后者也病了，那么就证明这种病毒可在动物间传播。一旦疾病可以复制，研究者们就能推断出：又是病原体在作祟了。但尽管他们再三努力，却仍无法让这个家伙乖乖现身。就在山重水复疑无路之际，这种具有传染性又会“隐身术”的病原体露出了马脚：疯狗的唾液已经被细细地过滤过，可它仍然具有传染疾病的能力。这种过滤可不是闹着玩，它是一种高度精密过滤器，也称超滤子（最初病毒的“乳名”就是滤过性病原体）。我们能感受到，第一批病毒学家是极其失望的，因为他们未能亲眼观察到自己发现的病毒，而必须要借助复杂的动物实验才能够令这种神秘的感染原进行繁殖。

病毒的培养困难重重，导致病毒学的发展严重落后于细菌学，尤其是在疫苗应用方面。到了20世纪30年代，只有两种抗病毒疫苗可供使用：天花疫苗和狂犬疫苗。但是细菌疫苗的数量远多于此，有伤寒疫苗（1896年）、霍乱疫苗（1896年）、鼠疫疫苗（1897年）、白喉疫苗（1923年）、破伤风疫苗（1927年）、结核病疫苗（1927年）和百日咳疫苗（1926年）。

1900—1950年的半个世纪之中，在活体动物上制备出的病毒性疫苗非常稀有：天花疫苗是在小母牛犊的肋部制备的，而狂犬疫苗则取自羊脑，黄热病疫苗取自受精鸡蛋，日本脑炎疫苗取自鼠脑。开始于20世纪50年代的细胞培养促进了病毒学的跨越式发展。从人们翘首以盼的脊髓灰质炎疫苗开始，疫苗发展史掀开了新的一页。但当时的培养技术还十分原始，这限制了疫苗的大规模生产。抗病毒疫苗产业直到1975年才真正成形，这得益于细胞培养新技术的到来和发展，即在发酵罐中利用微珠培养。

这一漫长的技术进化过程伴随着疫苗质量的持续提升，其安全性因而越来越得到保证了。

但是让我们重新回到细胞培养技术出现之前，那时的条件极其艰难：第一批病毒疫苗是如何被研发出来的？我们也可以看到，它们的生产是以动物为供体的。针对不同的疫苗，研究者们制定了复杂而又具体的策略。最终这些疫苗可以分为两类：减毒活疫苗和灭活疫苗。

第一组减毒活疫苗成员众多：黄热病、脊髓灰质炎（口服）、麻疹、水痘、流行性腮腺炎、轮状病毒以及日本脑炎。这是一类依据经验制成的疫苗，通过使病原体发生变异后在人体内生长繁殖，最终使人类获得免疫性，病毒变得无害。

其他针对各种病毒性疾病的减毒疫苗也是通过相似方法制出的。第一批减毒活疫苗研发出来时，人们对于病毒生物学的了解仍然十分有限。20世纪70年代，分子生物学时代的到来使我们发现了病毒的一项基本特性：它们在增殖时具有高频突变的能力。实际上，病毒与细菌恰恰相反，后者要稳定得多，而病毒却能够迅速演变。而当一种病毒跨越物种屏障时，它的变异频率更高。1930年，美国洛克菲勒基金会（The Rockefeller Foundation）的研究员们将黄热病毒——一种一般只在灵长类动物和蚊子之间传播的病毒——传染给了鼠，之后又传给了受精鸡蛋。在我们的行话里，以“鸡胚”指代受精鸡蛋，本书中也会使用这一表达。而黄热病毒为了适应这种新的宿主发生了变异。研究员们出于偶然或运气，竟发现这种病毒在动物间几经传播之后，失去了致使人类患病的能力。于是“黄热病17-D疫苗”就这样诞生了（见第四章）。这件事里有偶然和运气的成分，事实上，人们之后也多次尝试在相似条件下重现这一实验，但没有任何一次能再成功地得到减毒疫苗。所以，“黄热病17-D”疫苗可以说是“撞大运”的独一份了。

其他针对不同病毒性疾病的减毒活疫苗也是通过类似方式研发的——通过使病毒进行多次传播选出一个可用作候选疫苗的抗原。之后，这一候选疫苗会相继在动物和人类身上进行实验，从而验证毒性是否减弱。减毒活疫苗的巨大优势在于，接种之后病毒在人体内不断繁殖却不会诱发疾病，进而大大增强人的免疫能力，筑起一道坚固的健康城墙。黄热病疫苗接种一支就已足够，而麻疹、风疹和日本脑炎则需要两支疫苗。但这类疫苗可能会造成一些负面影响，极端情况下会陷接种者于险境（见第四章）。

疫苗的第二大类，即灭活疫苗，则沿用了不同原理：用化学制剂或加热的方法中和对人体具有致病性的病原微生物，使其不能再在人体内繁殖，狂犬疫苗就使用了这个方法。灭活病毒的化学制剂是β-丙酰内酯或福尔马林。除狂犬病疫苗外，这一组还有许多成员：注射型脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗和甲型肝炎疫苗。很显然，这些疫苗的制备相对容易，不用对病毒做任何改变，只要灭活就可以了。但其劣势在于产生的免疫力非常低，因此就需要疫苗内含有大量病毒才行（大剂量的病毒是较难获得的）。同时还需要多次接种，因为灭活疫苗产生的免疫期限远低于减毒活疫苗。

现在我们已经了解了这些基本概念，马上就能懂得一些主导疫苗生产的原理了。

动物疫苗来报到

很久以前，人类就有了保护自己免受传染病侵害的想法。11世纪时，中国人会从天花感染者身上提取结痂组织，在常温条件下贮存一个月，在研碎并与植物混合后，用鼻子吸入所得粉末。其目的是以毒攻毒，使自己轻度感染，以期能够对令人生畏的天花免疫。这种法子俗称“种痘”（Variolation），有人怀疑它比较危险。然而，种痘还是获得了毋庸置疑的成功，在18世纪还被引入欧洲。

种痘后来被疫苗接种（Vaccination）所取代。爱德华·詹纳（Edward Jenner）医生被称为“疫苗之父”：詹纳在进行多年研究后，发现人被患有牛痘的牛感染后，就获得了对天花的免疫力，在此经验启发下，他发明了疫苗接种。疫苗的第一位受益者是小詹姆斯·飞利浦（James Philip）。1796年5月14日，詹纳从感染了牛痘的年轻农妇身上取下牛痘疱液，注射到了詹姆斯的手臂上。几天后，注射部位出现了典型的感染症状。接下来詹纳等待了整整一年，才又给小詹姆斯注射了天花病毒，他依然活蹦乱跳——这个小孩获得了免疫力，詹纳成功了。第一例付诸实践的疫苗接种首战告捷。

由于当时很难找到携带牛痘病毒的动物，詹纳便采取了“从手臂到手臂”的接种方法。一名儿童接种后，其注射部位会长出一个脓包，之后脓包疱液会被提取出来再注射给其他孩子，这就是所谓“接力”接种。詹纳由此证明，人类感染的这种疾病是可以接续传播的，他将之命名为“疫苗”（Vaccine）。这种疫苗接种法被广泛传播并应用于世界各地。西班牙国王查理四世（CarlosⅣ）的女儿曾感染了天花，他希望可以在其所有的殖民地上推广詹纳式接种。于是，一支探险队在玛利亚-平塔号（Maria-Pinta）船上整装待发，船上载有招募的22名孤儿，年龄在3—9岁不等。起锚首日，两名孩子被接种了疫苗。之后，每十天就会有另两名孩子被注射从感染者身上提取的脓水。如此一来，当一行人抵达波多黎各（Porto Rico）时，还能留下具有活性的病毒。这样，目的地的人们就能用活病毒继续开展被盼望已久的疫苗接种。成功之后，人们又开始了新的长途跋涉，将疫苗接种带到西班牙在亚洲的殖民地上。

有人怀疑，这种由“手臂到手臂”的疫苗接种方法可能暗藏危险。事实的确如此——供体携带的其他病毒也可能同时经由此渠道传播，比如结核病或梅毒等。这也造成了烈性传染病的多次肆虐。1861年，在意大利皮埃蒙特大区（Piémont）的里瓦尔塔（Rivalta），46名孩子接种了另一孩子脓包内的物质，但人们随后发现这个孩子竟已经感染了梅毒，接种的孩子中有39名受到感染。这只是众多悲剧性事件的一幕，伤及儿童也是我们最不愿看到的。

于是，以动物为供体的疫苗亟待发明，好取代人际疫苗。1810年，在那不勒斯（Naples），热纳罗·加尔比亚迪（Gennaro Galbiati）尝试用小母牛培育牛痘病毒，用在疫苗的制备上。这种方法被“出口”到了世界各地。1864年12月，一只在那不勒斯注射了牛痘病毒的牛犊被运抵法国里昂的皮那什（Perrache）火车站，众多政治人物和医学院的全体学员都到场列队欢迎，见证了它的到来。

可是如何让动物感染牛痘呢？首先要给牛犊的肋部剃毛，清洗种痘区域并在上面留下许多划痕。之后，再用牛痘病毒的溶液涂抹这片区域。一定要仔细地摩搓这片裸露的皮肤，确保病毒渗入伤口之中。到了第五天，病毒的繁殖已十分旺盛，这时需要再给牛犊的肋部消毒，用刮匙取下用于制备疫苗的组织——淋巴、痂盖和真皮组织。这种黏糊糊的物质就是疫苗原液了。同时，为防止液体凝结，还要向其中加入甘油，后者还能起到杀菌的作用，且不会减弱病毒的活性。最后，搅拌疫苗原液再加以过滤，就会得到糖浆状液体，那就是疫苗了。疫苗须通过各种检测试验，合格后方可上市销售、投入使用。在漫长的历史长河中，疫苗制备技术得到了不断改进。但正是这种从牛犊肋部制出的疫苗帮助人类在1977年根除了天花。

天花疫苗是一种典型的以动物为供体的疫苗，但并不是“独一份”，与天花疫苗同根生的还有取自绵羊脑的狂犬疫苗（第三章）、鸡胚制成的黄热病疫苗（第四章）和流感疫苗（第五章）、取材鼠脑的日本脑炎疫苗等。时至今日，这些抗病毒疫苗依然是以上述动物为供体。流行性腮腺炎和麻疹疫苗也不例外，是由鸡胚制备而成。

鸡胚疫苗知多少

一项技术横空出世，彻底改变了抗病毒疫苗的发展史。这种技术同样依赖于动物，或者更确切地说，是动物的胚胎。

1930年年初，美国的厄内斯特·古德帕斯丘（Ernest Goodpasture）博士提出，是否能利用鸡胚培育鸡痘或鸟痘病毒，这值得探究。操作相对容易：首先将鸡胚置于孵化器之中，等孵化到第10天或11天时，凭特制照明设备确定胚胎位置，取下一部分蛋壳，使用针管将含有病毒的物质注入蛋壳里，再以玻璃封口，涂上石蜡，重新将鸡胚放回孵化器中。

不过，要想万无一失，还应越过两座“大山”。第一个便是细菌感染：鸡胚本身是一种无菌封闭系统，但注射病毒的过程就会给微生物以可乘之机——要么注射物是病菌的“特洛伊木马”，要么注射用针头是罪魁祸首。这时，抗菌素的存在还不为人所知，所以人们很难在完全无菌的环境下进行操作。第二个困难是人们还没有办法确定，病毒是否真的如愿进入鸡胚并开始繁殖。

古德帕斯丘和其女助手爱丽丝·沃道夫（Alice Woodruff）一起将这些难题各个击破。他们先从改善无菌技术着手，确保注入鸡胚的样本是百分百无菌的。接着，如何能让鸡胚内的鸟痘病毒变得可见呢？古德帕斯丘想出了一个“绝妙好方”：病毒都会选择相应的器官作为“窝点”，在不同的器官中进行繁殖，比如脊髓灰质炎病毒在脑部、黄热病病毒在肝部，这种病毒专门针对某一种细胞的现象被称为“细胞嗜性”（Cellular tropism）。鸟痘与其他痘病毒一样（痘病毒主要包括天花和牛痘等），以皮肤为目标器官，一旦感染这种病毒，皮肤上就会出现我们前文提到过的脓肿。于是，古德帕斯丘建议在鸡胚内的薄膜上培养鸟痘细胞。要知道，鸡胚虽小，却包含着胚胎、为胚胎输送各类营养的液体，还有各种绒膜。后者的一种——尿囊绒膜，就被选作了病毒栖身之所。沃道夫依样行事，开始培养病毒，终于在这层绒膜上发现了一些隆起的微白斑点——看得一清二楚，这就是鸟痘病毒在“作祟”。在鸡胚内培养病毒的技术就此诞生，时为1931年。

这一发现不容小觑。因为，其他病毒也随之被证实可在鸡胚内大量繁殖。后来的诺贝尔生理学或医学奖得主弗兰克·麦克法兰·伯内特（Frank Macfarlane Burnet）爵士也证明可在鸡胚的尿囊液内培养大量流感病毒。时至今日，这依然是世界通用的流感疫苗制备技术（见第五章）。

20世纪60年代，鸡蛋逐渐开始撑起疫苗制备的半边天，且多被用于儿童易感的传染病，比如麻疹和流行性腮腺炎疫苗。与黄热病疫苗一样，这两种由鸡蛋制备的疫苗都是减毒活疫苗，而流感疫苗则不同，它是经化学处理的灭活疫苗。减毒活疫苗当然更让人担心一些：鸡蛋是否可能携带感染原？它们会在接种时被一并传染给人体吗？“乐天派”们表示不怕，搬出了物种屏障理论（传染病在不同物种间的传播没那么容易），但这就万无一失了吗？一场讨论就此展开。当时人类已经发现，很多动物携带的病毒都能够诱发肿瘤，譬如禽类。这就更让人忧心忡忡了。

让我们坐上时光机，穿越回20世纪。1909年，一位农夫敲开了裴顿·劳斯（Peyton Rous）实验室的大门，年轻的劳斯时为洛克菲勒基金会的研究员。来访的农夫手里提着一只几小时前刚刚一命呜呼的鸡，劳斯将它开膛破肚，进行了解剖，他在其左肋处发现了一个体积较大的肿瘤，且癌细胞已经转移到其他器官，扩散至全身了。在好奇心的驱使下，劳斯将肿瘤研碎、过滤，再把剩下的滤液注射给了其他动物。还记否？劳斯的做法已不是第一次见了，这是当时唯一能够判断病毒是否存在的技术。没几天工夫，所有被注射的动物都长出了与那只鸡类似的肿瘤。这是怎么回事？过滤的工序是可以把细菌挡在门外的呀，连癌细胞碎片都不能侥幸过关。肿瘤的致病因子又是怎么瞒天过海的呢？于是一个结论就不言自明了：肿瘤的致病因子具有滤过性，肯定是一种病毒。后来这种病毒被称为“劳斯肉瘤病毒”（Rous Sarcoma Virus，RSV）。劳斯的发现打开了病毒致癌因子研究的大门。他本人也因此在半个世纪后的1966年戴上了迟来的诺贝尔生理学或医学奖桂冠。

到1960年，研究者们已经发现了一些可对动物致癌的病毒，但是对人体致癌病毒的了解还是一片空白。以禽类为例，禽白血病病毒——一种非常常见的禽类致癌病毒，已经为人所知。它作恶多端，可在家养禽类中快速传播，造成家禽大批死亡，每年都会造成巨大损失。鸡胚中也含有这种病毒。糟糕了，用于制备疫苗的鸡蛋也可能“中招”——含有致癌病毒。这会危及人类吗？为黄热病疫苗作传的第四章会告诉大家，禽白血病病毒的存在是不无危险的。幸运的是，接种过被感染疫苗的人并未出现任何问题。

后来，由鸡胚制成的新疫苗接连问世。鸡蛋作为重要物料，兹事体大，其质量的提升就不能马虎大意。而且还要具体问题具体分析，供应灭活疫苗和减毒活疫苗的鸡蛋不应混为一谈，而应满足不同的生产标准。

现在，就灭活疫苗而言，比如流感疫苗，最重要的就是鸡胚的成活率，因为这直接决定着病毒的产量。供应疫苗物料的饲养区（“特约饲养区”，Élevages conventionnels）应只用于疫苗生产，接受严格的卫生检查。里面的禽类应接受预防接种，做好主要传染病防疫工作，避免微生物的存在。禽类还要定期接受血清检测，确认饲养区内不存在疫苗无法防疫的传染病。在这种条件下，感染原几乎是无法生存的。即便是最坏的情况发生，疫苗生产的最后一道工序——过滤除菌也会将细菌消灭殆尽，而化学灭活工艺则将潜在的传染性病毒赶尽杀绝。因此，鸡蛋质量和制备工艺可确保疫苗满足要求。

减毒活疫苗的情况就大不一样了。没了灭活这道工序，疫苗成品就少了一组“安全阀”，确保鸡蛋内无任何病菌就成了唯一一道“防火墙”，这给饲养员们提出了相当严峻的挑战。办法来了：20世纪60年代初，一种遵循特定卫生规章的鸡饲养模式应运而生，这种养鸡场生产的是“无特定病原体”（Specified Pathogens Free，SPF）鸡蛋。能打上这一标签的鸡蛋，必须来自封闭、受保护的饲养区，饲养人员应具备专业资格。在SPF饲养区里，规章与特约饲养区完全相反。SPF蛋鸡不得接种任何疫苗，但须定期接受检查，确保不携带任何病菌（该检查涵盖30多种病原体）。饲养区建设之初，每一只蛋鸡都要被抽血检测，之后每月饲养员都要从中选取5%的蛋鸡进行抽样检测，确保不存在任何禽类致病原的抗体。SPF鸡蛋的产量十分有限，价格高昂。举个例子，约有5亿个“特约饲养区”鸡蛋被用于制备季节性流感灭活疫苗（1个鸡蛋约可得1支疫苗），而供应减毒活疫苗的SPF鸡蛋在全世界范围内只有几百万颗。万幸的是，减毒活疫苗的物料投入产出比要高得多——大约1个SPF鸡蛋能制出60—100支流感减毒活疫苗（这种疫苗确实存在，翻阅第五章可知）。

其他由SPF鸡蛋制成的减毒活疫苗有：麻疹疫苗、黄热病疫苗、流行性腮腺炎疫苗。还有两种灭活抗病毒疫苗也使用这种物料：狂犬病疫苗和蜱媒脑炎疫苗。

亚历克西·卡雷尔和“永生细胞”谜团

现在，让我们快进到病毒研究的关键时刻。细胞培养登上舞台后，抗病毒疫苗史诗的高潮刚刚开始。

动物作为病毒宿主，一直是疫苗制备离不开的“培养皿”。直到20世纪中叶，细胞培养才部分取代了动物的角色。乔纳斯·索尔克（Jonas Salk）开始用猴肾细胞制备脊髓灰质炎疫苗，那时距离路易·巴斯德用兔延髓传播狂犬病毒的实验已过去六十多年了。

不过，细胞培养技术的发明——或更确切地说是组织的培养，其实可以回溯至1907年。这一年，美国约翰霍普金斯大学（John-Hopkins）的罗斯·哈里森（Ross Harrison）成功实现了蛙胚神经纤维的培养。这一成功得到各界的热烈响应，它不仅使人们看到了修复受损组织的一线希望，也指明了细胞运作模式的研究路在何方。不过再回首，我们蓦然发现——该技术在尘封了多年后才找到用武之地。

在细胞培养的漫长历史上，有一个名字如雷贯耳——亚历克西·卡雷尔。他于1873年出生于圣-弗依-莱斯-里昂（Sainte-Foy-lès-Lyon），并在1912年10月10日摘得了诺贝尔生理学或医学奖的桂冠，是首位居于美国时获得这一殊荣的学者。让我们沿着他的人生轨迹，回到20世纪初，找寻本章的缘起。1904年，心有宏图的卡雷尔在里昂医学界颇为失意，难以施展抱负的他只得背井离乡，出走大西洋对岸。卡雷尔盘算着在加拿大买一座农场放牛，了此残生。就在心灰意冷之际，一场相遇改变了他的人生轨迹。他结识了著名的外科医生——阿戴尔斯坦·德·马蒂尼（Adelstan de Martigny），后者将他引荐到了蒙特利尔上帝医院（Hôtel-Dieu），到自己所在的科室工作。紧接着在第二年的一次会议上，卡雷尔又得到了西蒙·弗勒斯纳（Simon Flexner）的赏识。此人后来执掌了纽约的洛克菲勒研究所（The Rockefeller Institute），卡雷尔就是在那儿全身心投身于研究之中，开始了辉煌的职业生涯。

卡雷尔在血管外科领域的工作迅速得到了认可。通过对于血管修复技术的完善和器官移植技术，他取得了非同凡响的成就。第一次世界大战期间，卡雷尔人在法国，战争结束后才返美。1920—1930年，他又在洛克菲勒学院获得了一系列发现，比如移植——尤其是角膜移植，还有细胞培养、气候条件对个体生理表现影响研究等，探索的领域可以说十分广泛了。不过回到这节的主旋律，这里我们只谈谈卡雷尔在细胞培养方面的成就。

但在详述之前，我们还得再谈谈卡雷尔的一生，因为他杰出的科学家生涯也并非无可挑剔。1935年问世的一部名为《未知的人类》（L’Homme cet Inconnu）的著作集合了他对科学和哲学的思考，却令他白璧微瑕。卡雷尔在里面大谈优生学对于优化人类构成的好处，例如，他这样写道：“要让精英阶层永存，优生学是必不可少的。很显然，一个种族应该不断复制其最优秀的部分。”为达到这一目的，卡雷尔还在书中提供了一些实践性意见：“为什么社会不使用更经济的方法处置那些罪犯和疯子呢？惩治那些最不危险的罪犯，可以用鞭子，也可以采用其他的科学方式，例如，让他们在医院里待一段时间，就能解决问题。而对于其他人，那些杀了人的、那些持械偷盗的、那些拐卖儿童的、那些抢掠穷人的，所有严重背弃了公众信任的人都应该被送到设有毒气装置的优生机构，用人道又省钱的方式处置他们。”

这本书在当时获得了巨大成功。让我们回到1935年，设身处地地思考它的影响。让·莱皮纳（Jean Lépine）教授是卡雷尔多年老友，他在一本献给诺贝尔奖的传记中这样写道：“都不用讲学者们看到这等言论时是何等失望。但是这本书出现时，有一个疯子，恶贯满盈又狂妄自大，把种族主义当成他个人野心的垫脚石。毫无疑问，那时希特勒集团的人从卡雷尔的思想中找到了鼓励和依据。”

卡雷尔的人生路以悲剧落幕。莱皮纳教授补充说：“然而我不知道是哪个满肚子坏水的天才，可能就是希特勒的身边人，建议贝当元帅赋予卡雷尔一个新使命，领导一个机构根据《未知的人类》那本书里的主要思想进行资料挖掘。卡雷尔本人被蒙在鼓里，对于这些人让他扮演的真正角色毫不知情。巴黎解放时他被粗暴解职，给他造成了致命打击，几周后就去世了。卡雷尔无愧于心，不过一时糊涂而已。”

再回到细胞培养上来。卡雷尔对罗斯·哈里森的先驱性工作早有耳闻，他安排自己的合作者之一蒙特罗斯·布伦斯（Montrose Burrows），研究组织培养技术。卡雷尔自己也对这项工作给予了重要指导，让布伦斯从一个组织切片开始做起，比如鸡胚胎心脏组织。他使用一个凹形载玻片和一个能覆盖住该凹槽的盖玻片，然后把从鸟身上提取的血浆置入凹槽底部，之后将组织切片放入血浆中，并加入含有鸡胚碎粒的营养成分。几秒钟后，血浆凝固了，组织切片被封闭在凝块之中。随后他将盖玻片盖在凝块之上，这就构成了一个封闭、潮湿的“小房子”，再将其放入37℃的恒温器中。这种技术被称为“悬滴培养”。

接下来的日子里，细胞开始繁殖，并从组织切片中扩散出来，但它们受到了有毒物质聚集的严重影响。这时，卡雷尔又提出一个新颖的解决方案：他决定将组织切片切分、冲洗，并将一部分转移到一个新的凹形载片中，后者的温度仍然保持在原来的状态——这种工艺即“传代”。之后，细胞重新开始繁殖，在完全无菌的条件下进行连续几次“传代”之后，卡雷尔还成功地维持着培养细胞的存活。为了做到这一点，他借鉴了作为外科医生时的经验：每位工作人员都身穿白大褂、头戴医生帽、脚蹬黑色无菌鞋。卡雷尔对于他培养技术的描述，围绕着技术手法上的神秘感和对于无菌环境的严格要求，令许许多多的研究者们望而却步。卡雷尔被当作了真正意义上的领袖。1912年，他在实验室中用上面提到的技术成功培养了鸡胚胎心脏组织细胞，这些细胞在后来的34年里进行了无间断的传代，卡雷尔也由此成为细胞培养史上不可或缺的人物，而他也依据该实验得出“细胞不死”的结论。此事后被媒体转载报道，一直在传代的培养细胞被称为“永生细胞”，此后美国媒体甚至每年都要进行专门的年度报道。

除了用悬滴培养改良细胞繁殖，卡雷尔团队对细胞培养还做出了其他众多贡献。因此将卡雷尔视为细胞培养之父是完全在理的。

我们还要就“永生细胞系”再讲讲，这是卡雷尔细胞培养成果中毋庸置疑的巅峰。如何解释卡雷尔的细胞不死论呢？一位医学历史学家约翰·维特科夫斯基（Jan Witkowski）博士在卡雷尔去世后展开了长达30年的细致调查。在这里我们简要总结一下他的结论，这些结论里有一些猜想，也有一些新奇的发现。细胞能永生不死吗？可以，但有一个条件：细胞必须经历转化，即对其结构的大幅调整，实现无秩序无限制的生长繁殖才行。这一过程可自发产生（这是极其稀有的现象，但是在鼠细胞中发生过），或由外界因素诱发，例如某种致癌病毒。经历如此转变的细胞可无限增殖，且其中一些在被移植给动物时就具有了致癌性（即它们能够诱发癌症）。然而，卡氏细胞仿佛并不是因为发生转变才永生的，因为卡雷尔一直强调他培养出的细胞是正常的。

“永生细胞系”之所以能够无限繁殖，还有另一种可能性，那就是它们的培养环境条件使然。实际上，卡雷尔也谈到过，他用玻璃皿培养细胞，加入的营养成分是从鸡胚中提取出来的。这种成分是按照以下条件制成的：将胚胎切成细片，悬置于盐溶液之中，然后进行离心分离，分离出的清液层就构成了营养环境。这一流程可为我们提供卡氏细胞永生的线索。如果我们想将细胞和提取出的清液层彻底分离的话，离心的速度要足够快；否则，获得的清液层里就有可能含有新鲜的胚胎细胞，最后被注入细胞的培养环境之中。然而，在维特科夫斯基调查的这一阶段，迷雾重重，他对卡雷尔曾经的合作者们进行采访时，并没能得到当时离心分离的准确速度。

维特科夫斯基在他的报告中引用了一些阴谋论说法。这些话出自卡雷尔“永生细胞不死论”的一位坚决反对者——莱昂纳多·海弗里克（Leonard Hayflick）博士。后者1963年在波多黎各大学介绍自己对细胞培养的研究时，对卡式细胞的永生提出了质疑。演讲结束后，一位女士向他走去并做了自我介绍。她彼时已经退休，之前曾在卡雷尔实验室工作过多年。这位女士向海弗里克透露了如下内容：“我之前从未向任何人提到过我今天告诉您的话。事实上，在卡雷尔的细胞培养中，我们加入的培养液含有新鲜细胞。我曾多次观察到这一现象，并报告给了实验室老板，但是他却对此置若罔闻。”

但是维特科夫斯基的调查并没有止步于此。他见了许多曾供职于洛克菲勒基金会或在那个时期见过卡雷尔的研究者，比如芝加哥大学年轻的研究员拉尔夫·布克斯鲍姆（Ralph Buchsbaum）。1930年夏天，布克斯鲍姆前往纽约并请求参观卡雷尔实验室，未果，他一再坚持，终于，卡雷尔的助手答应趁老板在西班牙度假，带他在实验室中快速转了一圈。布克斯鲍姆进一步要求参观卡雷尔大名鼎鼎的不死细胞，旋即遭到拒绝，理由是这是一种珍贵的实验材料，有遭受感染的风险。他一再请求，未能得到许可。当卡雷尔的助手不再理会他时，布克斯鲍姆又遇到了卡雷尔实验室一名技术人员，并请求她带自己观察一下细胞的培养。在软磨硬泡了一段时间后，这位技术人员终于答应了。但她接着说道：“如果卡雷尔博士知道了的话，他可能会心脏骤停的。”

布克斯鲍姆观察了那些细胞，却惊讶地发现它们的状态并不好，会很快死去。他把这一情况向这位女性技术人员说明，后者承认并说：“不能让它们死了，卡雷尔医生会被吓得丢了魂的。我会向里面加入新的细胞，让培养继续下去。”布克斯鲍姆惊呆了，原来所谓的“永生细胞系”只是一次令人不齿的舞弊。他本人泡在自己的实验室中从未在几个星期内成功实现类似细胞的培养，最好的条件下也维持不了几个月。他的上级布鲁姆（Bloom）博士因此指责他无能时口头总挂着这句话：“人家卡雷尔就做到了。布克斯鲍姆，您呐，还是缺点灵气。”这下子，这位年轻的研究员可以复仇了。他把自己在卡雷尔实验室的所见所闻报告给了布鲁姆博士，但是后者拒绝相信他。

卡雷尔在第二次世界大战前夕回到巴黎，于1944年11月5日在当地逝世，尔后“永生细胞系”的神话也未能维持多久。长达34年、迷雾重重的“永生细胞”奇遇记于1946年4月26日正式画上句号。在1946年10月2日的《先驱论坛报》（Herald Tribune）上，它最后一次登上报纸头条。

维特科夫斯基从未获得卡雷尔合作者们对布克斯鲍姆证言的证实。即使维特科夫斯基的调查引发了诸多联想，“永生细胞系”的秘密却从未得到盖棺定论。因为最重要的谜团还没有被解开：卡雷尔对其实验室内部发生的事情是否知情？

有诺贝尔奖的威望坐镇，怀疑者也望而却步，直到半个世纪后才有人拿出了一个压倒性证据：正常的细胞是无法永生的。可大把时间已经浪费了……

猴肾原代细胞和诺贝尔奖桂冠

卡雷尔和他在洛克菲勒研究所的团队做了一些技术性工作，这些工作与“永生细胞系”的作弊毫无干系，且对于细胞培养条件的研究是十分有用的。不过我们还是要承认，20世纪40年代的细胞培养技术还远远不能满足人们寄予的厚望。

这一时期，许多研究者都热衷于脊髓灰质炎疫苗的研发。其中有三位佼佼者找到了敲门砖，即希拉里·柯普洛夫斯基（Hilary Koprowski）、乔纳斯·索尔克和阿尔伯特·萨宾，他们会在下一章中隆重出场。有了思路之后，还要迈出实质性的一步：生产数量可观的脊髓灰质炎病毒以制备疫苗。而当时有一种观点已然深入人心：脊髓灰质炎病毒只能在神经细胞中培养，所以繁殖这种病毒的最常用方法是对猴脑进行活体注射。虽然萨宾已经阐述过人工体外培养神经细胞来繁殖病毒的可能性，但这种工艺的难度很高，所以并不具有实践价值。

这时，著名学府哈佛大学的三名研究者参与了进来，令此事柳暗花明。这三人就是约翰·安德斯（John Enders）、托马斯·韦勒（Thomas Weller）和弗雷德里克·罗宾斯（Frederick Robbins）。安德斯是他们实验室的老板，更是一位老将，而另两位则是初出茅庐的新人，因为获得了美国国家研究委员会（National Research Council）的短期奖学金才得以进入该实验室。罗宾斯刚刚上岗时，就向安德斯表达了心声：他不想像当时大多数美国研究者一样从事脊髓灰质炎病毒的研究，真正令他感兴趣的是引起痢疾的病毒。韦勒则对水痘疫苗的研究情有独钟。

当时的细胞培养技术十分简陋：就是将人体组织的碎片悬置于充满营养液的试管中，并且每四天更换一次营养液，在其中加入可能含有病毒的样本。但相对于卡雷尔称雄的时代，这一技术仍然凸显了决定性进步：抗菌素，即青霉素和链霉素的使用有利于抑制细胞培养中的细菌生长，特别是可用于病人粪便的病毒性研究。

现在我们将时间的罗盘推进到1948年3月，此时罗宾斯正在尝试运用鼠肠细胞繁殖痢疾病毒，韦勒则在培养人胚胎细胞。罗宾斯谈道：“我无法使这种病毒繁殖。我把这件事告诉了老板，同时向他提出我需要尝试另一种病毒。”安德斯回答他说：“我寻思是否应尝试研究脊髓灰质炎病毒。毕竟，人类感染这种病时，病毒是在肠道内繁殖的，可为什么老鼠的肠道不会感染这种病毒呢？”

罗宾斯觉得这一看法有理。他们的实验室当时存有Ⅱ型脊髓灰质炎病毒株，即可致死老鼠的“Lansing病毒株”。罗宾斯从冷柜中取出该病毒株并将其注射进老鼠的肠道细胞中，同时建议韦勒对不同的人体胚胎细胞进行同样操作。令三人大感惊奇的是，Ⅱ型脊髓灰质炎病毒竟不是在罗宾斯试验的肠道细胞中开始繁殖，而是在韦勒准备的不同人体胚胎组织中。哈佛的“三驾马车”第一次成功地在非神经细胞中实现脊髓灰质炎病毒的繁殖，这将在病毒学家们的世界中掀起一场技术革命。

他们还有另一发现，与培养环境中的酸碱指示剂——苯酚红有关：细胞繁殖时会产生一种酸，从而使培养环境的颜色从红色变成橙色，最后成为黄色；然而，当阻碍细胞繁殖并摧毁细胞的病毒存在时，培养的环境仍然保持红色。用显微镜观察到的结果也证实了这一点：当培养环境保持红色时，其中的细胞已经被病毒破坏了。颜色的改变令培养环境可视化，人们就能轻易判断出脊髓灰质炎病毒是否存在其中。更为可喜的是，这种方法可以帮助人们为样本中的病毒定量（我们使用“滴定”这个术语），而之前工作人员要借助数十只动物才能完成病毒量测定。1949年1月28日，安德斯、罗宾斯和韦勒的工作成果在《科学》杂志发表，文章题为《不同人类胚胎组织中脊髓灰质炎“Lansing病毒株”的培养》。同样的方法显示脊髓灰质炎的另外两种病毒株（Ⅰ型和Ⅲ型）也以类似的方式繁殖。

故事的后续对脊髓灰质炎疫苗的发展产生了重大影响。脊髓灰质炎病毒被证实可在猴肾细胞中迅速繁殖（这些细胞被称为“原代细胞”，见下文楷体字）。病毒量化繁殖的大门已经开启，脊髓灰质炎疫苗的批量生产有了一丝曙光，并于几年后成为现实。

原代细胞、二倍体细胞和异倍体细胞

细胞培养的漫长历史可被划分为三个阶段：原代细胞、二倍体细胞和异倍体细胞的培养。

原代细胞培养，即对一个器官或其一部分的培养。通过一种酶——胰蛋白酶将细胞提取出来，进行培养。提取出的细胞会用玻璃器皿盛装，如培养瓶、试管或载玻片，再注入培养成分。细胞开始繁殖并形成细胞层，它们的生命周期很短。

20世纪60年代，海弗里克博士观察到从人类胚胎中提取的成纤维细胞可通过连续移植进行繁殖。当细胞层形成时，可使用胰蛋白酶将细胞分离出来并移入两个新的培养瓶。同样的操作可重复50余次。此外，细胞也会衰老、死去。由此得到的细胞在存活时完全正常，染色体也未出现任何异常。这种细胞被称为“二倍体细胞”。

后来，我们开始从肿瘤中提取细胞进行培养。这种细胞可无限繁殖，被称为“线性细胞”。它们被“改变过”，染色体的结构或数量存在异常现象，或二者皆有。人们把这种细胞称为“异倍体细胞”。这种变异的细胞也可从非恶性肿瘤的细胞获得。

索尔克和萨宾在这一领域进行了深耕。前者研发出了灭活的脊髓灰质炎疫苗，后者则研制出了减毒的口服脊髓灰质炎疫苗。这两种疫苗是病毒学和现代疫苗学的里程碑，也是第一批采用细胞培养研制出的疫苗。疫苗家族从这种技术中受益良多，却也不乏艰险。一个个故事和事故由此展开，并永远成为疫苗学历史不可抹去的一页（见下一章）。

1954年，安德斯、韦勒和罗宾斯因他们在细胞培养领域的工作，获得了当年度的诺贝尔生理学或医学奖。

猴肾细胞迅速成为细胞培养领域的宠儿，在疫苗的生产中广为应用，但是一些间或发生的悲剧性事件又给这种使用的合理性蒙上了不确定性的面纱。1960年，人们发现了SV40病毒，即猴空泡病毒。这种存活在猴肾细胞中的病毒能够感染脊髓灰质炎疫苗。万幸，这事未对当时的公共卫生安全造成影响（见第二章）。

然而这并不是唯一的危险信号，几年之后，欧洲制药界上演了一场悲剧。1967年的八九月间，贝尔格莱德（Belgrade）和法兰克福（Francfort）的制药实验室工作人员纷纷染上了一种神秘的疾病。最后共有37人患病，其中7人不幸罹难。这些被感染者全部与为制备疫苗而从乌干达运来的长尾猴（也称绿猴）接触过，他们中既有制药人员，也有饲养员。所有病例都表现为发热，尔后出现出血症状。人们那时尚不了解此事件中出现的病毒，暂命名为“马尔堡（Marburg）病毒”。这种病毒与一样可怕的埃博拉病毒是“堂兄弟”，同属纤丝病毒科（Filoviridae）。调查显示，在猴子的运输过程中，乌干达的出口方和欧洲的制药实验室都没有遵守动物检验检疫的相关规定。

这一突发状况令原代细胞的可靠性大打折扣，尤其是猴肾细胞最受质疑。可是，在20世纪60年代，人们还未找到其他能够接受的细胞载体用于制备疫苗，真正的决定性进步直到十几年后才姗姗来迟。一位个性颇受质疑的医生锲而不舍，方才迈出了这一步，他就是莱昂纳多·海弗里克。

二倍体细胞和“丑闻”缠身的海弗里克

1950年，年轻的研究员莱昂纳多·海弗里克加入了费城久负盛名的威斯塔研究所（The Wistar Institute），在其建议下，他开始研究肿瘤病毒。技术层面上，就是将肿瘤组织碎末注射进细胞后，查证是否还有病毒存在。海弗里克培养的人类胚胎细胞是从治疗性流产中获得的。他之所以选择这样的细胞注入肿瘤组织匀浆，是因为它们与从成人身上提取的细胞不同，几乎不存在携带感染性病毒的可能性，不会影响结果。

这一计划并没有获得实质性成功，因为由始至终并未提取出任何病毒。但是海弗里克和他的合作者——保罗·穆尔黑德（Paul Moorhead）博士却观察到一类特殊胚胎细胞的明显增多，即成纤维细胞。后者在培养皿中显著增多，几天后当一个细胞层形成时，用胰蛋白酶就有可能将它们提取出来。那些分散的细胞由此就可能得到再次培养，这种连续性移植在业内被称为“传代”。就是这样，海弗里克和穆尔黑德可以连续几周，甚至几个月定时得到有活力的培养细胞。但是，细胞一段时间后就会无可避免地死亡。

在当时，由卡雷尔创立的“细胞永生论”仍然被世人所信服，于是细胞的迅速死亡被归咎于操作者的无能，或不适宜、甚至有毒的培养环境。而海弗里克和穆尔黑德并不认为自己没有培养细胞的能力。实际上，那些死去的“年老”细胞恰恰和正在培育的“年轻”细胞处于同一个环境之中，他们从这一点推断出：细胞并不能“长生不老”，它们的存活时长是有定数的。

到了1961年，海弗里克和穆尔黑德决定将他们的成果公布于世。二人投稿给《实验医学杂志》（Journal of Experimental Medicine，JEM），却不想被泼了冷水。拒稿理由：文章内容与当时公论不一致。审稿人这样写道：“近半个世纪以来，细胞培养的频频失败是由不恰当的培养环境造成的。”至于两位作者提出的细胞死亡是源于衰老现象，一位审稿人回复道：“关于细胞死亡是由内在衰老现象造成的这一假设看起来极其大胆且缺乏文献依据。”写下这一评语的，正是该领域的权威之一裴顿·劳斯，我们在前文也提到过。他后来因发现了病毒在某些癌症中所扮演的角色而获得诺贝尔生理学或医学奖。简言之，这一记耳光十分响亮，可是按当时的认识水平却也完全在理。

海弗里克于是决定将本文另投他处：《实验细胞研究杂志》（Experimental Cell Research），令他喜出望外的是，稿件被接收了，也没有提出重大的修改要求。此文就是《人二倍体细胞株的连续培养》，迄今为止还是科学界被引用次数最多的文献之一。这篇文章讲了什么呢？海弗里克是这么说的，如果我们将成纤维细胞从人类胚胎中分离出来，不管是用物理手段——镊子，还是化学方法——胰蛋白酶，然后将它们置于环境适宜的培养器皿中，这些细胞就会繁殖下去。当细胞的数量达到饱和时，我们就能将它们一分为二，分装到两只培养瓶中，之后细胞就会继续繁殖。据海弗里克的阐释，多次重复这一流程是有可能的。我们就此可以观察到，每次分装细胞的数量都会翻番，这可是不得了的。因为n次分装之后，细胞的数量会变成原始数量的2ⁿ倍。例如，10次传代之后，细胞的数量增至原来的2¹⁰倍，就是要乘以1024了。

在5次传代之后，海弗里克注意到细胞状态恶化并相继死亡，其间伴随着细胞碎屑的增多，这一最后阶段被称为“衰老期”。在不同的传代培养中，细胞核的检测，即细胞染色体测定未显示任何非正常现象。这就是说，培养出的细胞与原始细胞一致，并仍然满足2N=46公式。事实上，在一个具有有性生殖能力的有机体生命周期之中，变化会接连发生。在二倍体阶段，细胞的染色体都存在双份，人类染色体公式此时可写作2N=46；而在单倍体阶段，此公式为N=23（针对人类来说）。染色体组型在二倍体阶段形成，所以其公式写作2N=46。海弗里克将这些细胞称为“二倍体细胞”（见第28—29页）。

这是一个重大发现。实际上，在这一阶段，人们只了解原代细胞（如猴肾细胞）和转化细胞。后者也被称之为“异倍体细胞”或“线性细胞”（见第28—29页），它们可以无限制地繁殖（我们会在下一段中予以详细介绍）。所以可以说海弗里克将一组新的细胞加入了这一队列，即源自胚胎的人二倍体细胞。

海弗里克迅速察觉到这一发现具有广泛的应用前景，尤其是疫苗生产的安全性有了保障。事实上正如我们在上文中指出的，原代细胞——尤其是猴肾细胞，有可能含有危险的病毒，疫苗有被感染之风险。

这时，虽然海弗里克还需要做大量的工作，证明二倍体细胞可用于制备疫苗，但他的建树已在世界范围内得到认可。然而，历史却发生了一个急转弯：1977年，《研究》（La Recherche）杂志刊发了一篇文章，在题目中冠之以“臭名昭著的海弗里克博士”——他不再是大众眼中优秀的研究者了。

让我们回望海弗里克遭受的这一磨难。在工作中，他准备了不同谱系的二倍体细胞，以WI（威斯塔研究所的代称）为它们命名，并按照时间顺序称之为WI-1、WI-2等。1962年6月，他制造出了一个新的谱系，WI-38，这是由瑞典一家医院的流产手术中提取出来的女婴“胚肺细胞”而来。在第8次传代时，海弗里克已经培养出了600个安瓿瓶的细胞，并用极低的温度保存在液氮中。WI-38后来成为全世界二倍体细胞的代表，却也给海弗里克带来了麻烦事。美国国立卫生研究院（National Institutes for Health，NIH）与海弗里克博士就该细胞的使用签订了合同，收到请求后，这些细胞就会被发往全世界。很快，海弗里克就恍然大悟，有私立机构正从中牟取暴利。尽管他本人慷慨地无偿捐献了这些细胞，一些企业却囤积居奇，获赠后转手卖给以问诊和科研为目的的医院和研究中心渔利。

据海弗里克估算，几年内制药商们因WI-38细胞而获得的利润高达2000万美元，赚得盆满钵满，而他本人、威斯塔研究所及美国国立卫生研究院都未能从中分得一杯羹。1962年，威斯塔研究所曾尝试为WI-38细胞申请专利，可那时以自然活性形式存在的物质是无法申请专利的——该细胞没有经过任何修改，它是天然的。要等到1978年，美国最高法院才通过第一例天然活性组织的专利申请，对象是一种细菌。

1962年时，库存的WI-38细胞是美国国立卫生研究院的财产，即属于美国政府。1962—1968年期间，瓶装的WI-38细胞会被定期发送给不同实验室。1968年，海弗里克从威斯塔研究所辞职，加入位于加利福尼亚的斯坦福大学。他与美国国立卫生研究院签订的合同规定，只有10瓶细胞属于海弗里克本人，用于他的研究；而剩余的400瓶左右则归国立卫生研究院所有。但是当海弗里克离开威斯塔研究所时，他带走了所有的细胞瓶，他认为那是自己的“孩子”。

细胞瓶到底归谁所有？他与美国国立卫生研究院的恩恩怨怨就此开始。当国立卫生研究院重新找回剩下的细胞瓶时，就只有50只了。其他的去哪儿了呢？海弗里克申明一直在无偿提供分发那些细胞，许多都送给了英国的实验室，但有一些不幸在运输途中被打碎了。但是国立卫生研究院得知，海弗里克成立了一家公司，名为“联合细胞”（Cell Associates）。这家公司只有两名股东，海弗里克以及——他的配偶。这家家族企业出售了一些细胞瓶，主要交易对象是制药巨头默克，交易额总计100万美元。而默克作为重要的疫苗生产商，正企图略施巧计将WI-38细胞据为己有，实现基本垄断，因为那时这种细胞已经被广泛用于疫苗的生产了。

这时，一个谣言甚嚣尘上，令这件事再起波澜。传言说，海弗里克剩下的细胞瓶已经感染了一种微生物，不能再使用了，他本人好像也早就知道有一些细胞瓶遭到了污染。这些被感染了的细胞也分发出去了吗？海弗里克予以否认。不过，一波未平，一波又起：国立卫生研究院怀疑他提供的细胞传代次数过多。海弗里克本来应该提供只传代了8次或9次的细胞，然而调查显示，发出的细胞里有的传代次数远高于这一标准。这可不是鸡毛蒜皮之事，要知道传代次数越多，细胞寿命越短。

事情发展到这一步，其中的真相愈加扑朔迷离。即便里面没有种种猫腻，至少海弗里克对于细胞瓶库存的管理是一塌糊涂的。时间推进到1976年，海弗里克从斯坦福大学辞职。不难想象，因为卷进这件事而麻烦缠身的海弗里克很难再找到新职位了。给海弗里克和他的WI-38细胞雪上加霜的是：只剩50瓶细胞了（可能还被污染了），这种细胞变得前途未卜；而剩下的细胞瓶被很快分发出去，这个细胞系用完了。

科学界对海弗里克的看法莫衷一是。当时供职于威斯塔研究所的斯坦利·普洛特金（Stanley Plotkin）教授曾用一句话描述了他这位同事所遭遇的悲剧：“这是一部真正的希腊式悲剧，英雄登上了他荣誉的顶峰，却也萌发了令他一落千丈的种子。”

海弗里克有错吗？抑或他本人也是荒谬体系的受害者？再回首，我们才恍然大悟，看清此事的来龙去脉：研究者与卫生部签订了合约，在此期间工作获得了重大发现（WI-38细胞）并将之无偿地提供给了需求方，最后该成果居然被一些不择手段的国际制药企业用于谋取巨额利润。制药商们赚得盆满钵满，研发者本人及资助了该研究的国家机构却一无所获、官司缠身。

从1976年起，海弗里克为洗雪冤屈而踏上了与美国行政机构对抗的漫漫长路，历时整整六个春秋。1981年，他终于赢得了诉讼。所有涉案细胞瓶的销售盈利都直接归属他本人，WI-38细胞的所有权由他和国立卫生研究院共有。他援引了1977年出台的一部关于活性微生物专利的法律，里面有这样一句话：“本法不反对将微生物纳入专利系统，令发现者或创造者受益。”现在，私立或公立机构已经申请了数千份与活性微生物有关的专利（不论相关微生物是否被改变过）。

海弗里克的胜利一锤定音。里根政府后来鼓励公立部门的研究者们申请专利，专利产生的一部分利润直接归属科研人员。该政策旨在促进行业竞争，提高美国的科研生产力。几年后，美国人成为生物技术领域毋庸置疑的领导者。海弗里克对这一转变做出了重要贡献，他面对美国行政部门的抗争掀开了该国生物医学史上新的一页。

让我们重新回到疫苗的生产上来。正如我们讲过的，20世纪70年代初，抗病毒疫苗多由原代细胞制备而来，主要是猴肾细胞。大家也知道这种细胞有一个重大劣势：它们可能会藏有致病病毒，后者可能继续存在于疫苗之中。此外，如果使用这种方法制作上百万支疫苗的话，每年都需要数千只猴子。相反，二倍体细胞WI-38却具有众多优势：它源自人类、可接受多种检测、不包含任何感染原、可使用低温细胞库贮存。人们只要解冻一个细胞瓶，就可通过连续传代的方式令细胞繁殖，几周之内，就能获得数十亿个细胞用于制造疫苗。总而言之，二倍体细胞看起来好像十全十美。然而，美国主管部门——食品药品监督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）多年后才接受了这一点。

我们就没有任何可以怪罪二倍体细胞的地方吗？只能批评它太新潮了？可作反驳的论据几乎是不存在的，但反对者们提到了以下风险：这种细胞有可能携带一种现在人们未能察觉的病毒。原代细胞和二倍体细胞的对立在专家之中引起了热烈讨论。其中，美国食品药品监督管理局的生物制品办公室主任作了表态，说出了堪称美国医学史上谨慎精神的金句：“宁尝昨日痛，不犯未知险。”也就是说，还是要继续使用我们已经知根知底的原代细胞，尽管它也不是万全之策。

但是最终胜负还未决出。海弗里克和斯坦利·普洛特金（当时后者刚刚用二倍体细胞研发出了风疹疫苗，前景广阔）带领美国一众研究者们，又踏上了推广二倍体细胞的征途。他们的宗旨是：“给卫生当局上一课！”这一号召得到了欧洲一些国家卫生部门的响应，比如英国、法国、南斯拉夫，它们是20世纪70年代第一批批准将二倍体细胞用于疫苗制备的国家。美国则在数年后才开了绿灯，法国生产的人二倍体细胞狂犬疫苗开始在美国销售使用。而普洛特金的风疹疫苗直到1979年才在美国获批，比英国的放行还晚了9年。

今天，WI-38细胞已经退出了历史舞台：它已经被MRC5细胞取代。这是由伦敦的医学研究委员会（Medical Research Council）研发出的二倍体细胞，是对WI-38的仿制（海弗里克经常会提起这一点）。许多现代使用的疫苗都是由MRC5制备而来，例如，狂犬疫苗、风疹疫苗、甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗等。

其实，海弗里克博士又何谈臭名昭著？关于使用二倍体细胞制作疫苗的争论还远未停止。2003年，当时的红衣主教若瑟·拉青格（Joseph Ratzinger）——后来的教皇本笃十六世，加入了反对二倍体细胞WI-38和MRC5的阵营之中，由于这些细胞来自流产后的人类胚胎，他要求不再将这种细胞用于疫苗。普洛特金的风疹疫苗最受苛责，但是这种疫苗获得了巨大成功以至于完全取代了其他同类疫苗（其中就有一些是用其他细胞载体制成的）。这种疫苗已经不可或缺了，它被纳入了多个联合疫苗，如麻风腮三联疫苗（MMR）。宗座科学院（Pontifical Academy of Sciences）在进行了深入研究后，考虑到疫苗接种的益处，终于永远地接受了二倍体细胞在疫苗中的使用，但同时，仍然鼓励制药界研发使用其他细胞载体的新型疫苗。

转化细胞——生生不息的异倍体

在了解了原代细胞（比如猴肾细胞）和海弗里克的人二倍体细胞后，现在我们走进异倍体细胞，即那些转化过的、能够在我们供给营养时无限繁殖的细胞。这种细胞在疫苗和医用蛋白生产领域掀起了一场革命。

迅速知名的海拉细胞

海拉细胞的长生不老传奇源于美国的一位女性——海瑞塔·拉克丝（Henrietta Lacks），然而她本人其实对这一切一无所知。1951年，拉克丝因癌症逝世，享年只有30岁。专家从她的肿瘤中提取出了一种细胞，并以她名字和姓氏的首字母命名，称为海拉细胞（HeLa）。时至今日，这位不幸女性的名字已几乎被人忘却了，但“海拉细胞系”却闻名世界。

时间退回到1951年2月，海瑞塔·拉克丝到她的妇科医生处就医，被诊断为疑似宫颈癌。确诊后，她入院治疗，接受了放射性疗法。在这之前，一部分肿瘤样本已经被提取出来并送至了不同实验室，巴尔的摩市（Baltimore）约翰·霍普金斯大学的乔治和玛丽·格雷（Mary Grey）也收到了一份，二人都是知名的细胞培养专家，多年来一直尝试培养人体细胞，却一无所获。他们特别希望能对肿瘤细胞进行培养，尤其是宫颈癌细胞。海瑞塔·拉克丝的肿瘤切片是他们实验室收到的第十份样本。在用其他样本做的前九次试验中，细胞在营养环境中都活不了几天，会迅速死亡，可谓屡次失败，而这一次用海瑞塔·拉克丝的样本却得到了不同结果。这些细胞被放置到培养器皿中后，玛丽就发现它们的状态很好，不仅存活了下来，而且迅速增殖。几个星期内，它们像野草一样“长了一茬又一茬儿”，这是前所未有的成功。可是呀，这些细胞蓬勃生长，就意味着海瑞塔·拉克丝要遭殃了。她不幸于1951年10月4日去世，距确诊还不到8个月。

海拉细胞的生命力很顽强，成为专家们培养细胞的范本。它被送到了美国所有的实验室，继而推广至全世界。这是一种非常适合癌症研究的人体细胞，对于病毒培养也十分有用，病毒可在其中进行数小时的繁殖。这一特性使得海拉细胞被用于制备一种脊髓灰质炎候选疫苗。此外，这一发现也促进了其他取自肿瘤的细胞系的发展，海拉细胞是人体细胞培养当之无愧的“永动机”。20世纪50年代和60年代，众多实验室都使用异倍体细胞开展了多项研究，尤其是在癌症研究领域，各实验室之间也会互相交流发送不同的异倍体细胞系。

但是很快，问题就出现了。一些病毒本来在鼠细胞中繁殖良好，但是一夜之间，突然就偃旗息鼓了。研究者们发现，这可能是因为他们将细胞的种属来源张冠李戴了，为什么这么说呢？很有可能是标记出了问题，有的实验室同时拥有多种动物的不同细胞系，发生交叉感染也不无可能：几名研究员共用1个试管，所以里面就装入过不同的细胞，那么繁殖最迅猛的细胞就会占山为王；而且不同人使用过的吸管则有可能在蘸取时污染了培养环境……感染的原因不一而足，但都会让一些细胞随之湮灭。这对于研究员们来说无疑是一场浩劫——这样的话就无法重复试验了。是时候立立规矩了。

于是，一家美国机构应运而生，即1962年成立的美国模式培养物集存库（ATCC）。这是一家不以营利为目的的非官方单位，负责从各实验室收集细胞系，并进行储存和派发，但在将细胞入库前，必须要辨别细胞的种类。动物细胞种类的核实相对容易，人体细胞的分门别类却要难得多。

这时，极其幸运的是，生物学家们获得了一位遗传学家的帮助，即斯坦利·加特勒（Stanley Gartler）博士。后者发明出了用同工酶鉴定区分人类细胞的方法，特别是可以使用一种缩写为G6PD的酶，全称为6-磷酸葡萄糖脱氢酶。这种酶可以使葡萄糖发生转化，于是加特勒被请求使用他的方法辨认多份人类细胞。加特勒共测试了18份，奇从天降——这些细胞都是一样的。更令人惊奇的是，G6PD配型结果证实所有受试细胞组都符合海拉细胞的特征。

作为遗传学家，加特勒并没有马上预见到这一发现的重大影响，他决定在宾夕法尼亚州贝德福德（Bedford）的会议上公布结果。众人看到他开头的结论已然错愕，一些生物学家并不愿相信这些数据。然而他们只能向证据投降：ATCC保存的34份人体细胞的检验表明它们与海拉细胞完全一样。我们可以想见这对当时的研究者们是当头一棒：一些肿瘤学家在那之前已经通过培养肾细胞、肝细胞和肺细胞论证过不同肿瘤具备不同的特征，而现在他们却需要面对这些细胞都与海拉细胞一致的事实。其中一些人原来甚至还觉得自己发现了不同肿瘤的共同之处，现在则需承认这是海拉细胞的标志。这真是犹如晴天霹雳，多年的研究工作因为培养细胞遭到海拉细胞污染而付诸东流，所有涉及该研究的实验室都未能幸免。

之后，这件事便蒙上了政治色彩。1973年，尼克松（Nixon）总统决定向癌症“宣战”。专家们十分肯定：通过对肿瘤研究的大力投资，在几年内攻克癌症不无希望。尼克松通过国家抗肿瘤研究院（National Cancer Institute）为这一倡议提供了大力支持。美国最优秀的生物学家都动员了起来，寄希望于迅速找到引发人类癌症的病毒并研发出特色疗法。

尼克松对这一计划还有政治上的考量（这在后面也确实起到了破冰作用），他希望就此事与苏联的研究者们建立合作关系，从而为结束“冷战”状态找到突破点。苏联当局对这一联合计划同样踊跃，两国旋即展开了交流。然而，当美国研究者们风尘仆仆地从苏联回国时，却对他们苏联同事取得突破的可能性忧心忡忡：苏联的实验室建成已久，设备不足，缺乏资金来源；而美国一方尼克松计划的预算却十分可观。

然而，苏联的研究者们迅速公布了重大发现，其中就包括甄别出多个肿瘤中的病毒。为证实这些现象级成果，一些细胞组织被送到加州大学伯克利分校的沃尔特·尼尔森-雷斯（Walter Nelson-Rees）实验室。这些细胞来自6位罹患不同肿瘤的病人，几周后，病毒学和细胞学检验结果令人们惊愕：确实有一种病毒在所有细胞中都存在，但是它竟来自猴类；而那些送检细胞正是海拉细胞。

这一消息被通报给美国一方负责该癌症研究项目的主管。他要求尼尔森-雷斯不要立刻散布该消息，而是在1973年11月12日苏联代表团到访贝塞斯达（Bethesda）时再予以公布。该代表团由维克多·日丹诺夫（Victor Zhdanov）教授领衔，他是一位杰出的病毒学家、院士，也是苏联卫生部副部长和世界卫生组织统筹的天花根除计划的缔造者。当尼尔森-雷斯博士宣布他的结果后，众人沉默良久。随后，日丹诺夫教授对他说：“您的结果说明什么呢？”尼尔森-雷斯把他的上级要求他谨言慎行的事忘到九霄云外，径直答道：“你们的工作没有任何价值，要全部推倒从零开始。”众人听后颇为震惊，但日丹诺夫教授回答说：“请到苏联来与我们的研究者们见面吧，给他们制定规则。”尼尔森-雷斯马上回应：“没问题，只要您到时还允许我返回美国！”在这次充满戏剧性的会议上，参会者们脸上重新展开了笑颜。

尼尔森-雷斯和他的团队完全掌握了细胞识别技术和海拉细胞的染色体描绘技术。1974年，他们决定在久负盛名的杂志《科学》一刊中公布他们在该领域获得的数据。该文章的发表犹如一石激起千层浪，被媒体报道后，引起了人们对该抗癌战争结果的广泛关注。《洛杉矶先驱考察家报》（Los Angeles Herald Examiner）这样写道：“20多年来，在全世界不同实验室中使用的同一组肿瘤细胞让投进癌症研究领域的数百万美元经费都打了水漂。”《迈阿密先驱报》（Miami Herald）说得更直白：“细胞生物学最优秀的专家之一沃尔特·尼尔森-雷斯博士撰文称许多研究者在实验室中使用的细胞并不是他们实际上想要用的。”

这一事件犹如海啸，影响巨大，甚至波及了野心勃勃的尼克松抗癌计划，该项目当时的预算高达10亿美元。从这时起，尼尔森就踏上了漫漫长路，开始甄别被海拉细胞感染了的细胞。他在全世界都有所发现——德国最为严重，中国也被波及。全球众多实验室都有海拉细胞，而后者已经偷偷感染了他们的细胞库。当然，尼尔森-雷斯在同行中变得颇为不受欢迎。他们拒绝接受其结论，因为一旦承认了，就说明他们的工作是竹篮打水一场空了。

除这件事外，海拉细胞还被卷入了疫苗的研发。1978年10月，一次科技会议在美国纽约旁的普莱西德湖村（Lake Placid）召开。其主题为：将不同细胞注入肿瘤患者机体以驱动免疫系统的意义。言下之意就是，注射不同于有机体的细胞——例如猴细胞——有可能诱发对人类肿瘤细胞同样适用的免疫反应。其结果就是，在注射了异类细胞之后，我们就有可能驱使免疫系统将异类细胞和肿瘤细胞一并干掉（如此的推理在今日是不可想象的）。

借开会的契机，乔纳斯·索尔克公布了一个令众人震惊的事实：他确认过去曾经为治疗一些肿瘤而进行过这样的注射。但是回溯起来，他以为当时注射的是猴细胞，但事实可能并非如此，很大概率是海拉细胞。索尔克进一步说明，在注射的区域出现了脓肿，但是接受注射的病人并未因此而并发其他肿瘤。于是索尔克得出结论，海拉细胞对人体并不致癌。参会的研究者们为此震惊不已，他们要求索尔克对外只字不提。尼尔森-雷斯建议索尔克将其保留的细胞样本转交自己，这一建议与后者一拍即合。而索尔克的猜想也得到了证实，他提供给尼尔森-雷斯实验室的细胞正是海拉细胞。为什么乔纳斯·索尔克会有如此惊人的发现？接下来我们马上就会揭晓，其实他是醉翁之意不在酒……

会议期间，人们还获得了另一个消息，20世纪50年代初，美军曾在一些志愿者们身上试用过由海拉细胞制备的腺病毒疫苗，这是一种能造成呼吸系统感染的病毒。从1980年起，疫苗的制备不再有被海拉细胞污染之虞，因为，每一组在给定细胞系（人胚胎成纤维细胞或非洲绿猴肾细胞）基础上制成的疫苗都会使用基因印记技术，测定细胞的种类是否与之前保持一致。

现在让我们把目光转向另一种给疫苗产业带来革命性转变的细胞：非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）。

非洲绿猴肾细胞：一场工业革命

“海拉细胞系”是从肿瘤上取下的，就是变异细胞的一种（这种细胞是从正常细胞变异而来，并无序繁殖、引发癌症）。它能够在培养中无限增殖，且呈现多种变异，尤其是染色体的构成会发生改变，是典型的异倍体细胞。

但不是所有异倍体细胞都是从肿瘤提取而来，非洲绿猴肾细胞就是一个明证。这个细胞是日本研究者安村义博（Yosihiro Yasumura）博士于1962年发现的，他彼时就职于日本千叶大学医学院，这一发现为疫苗产业做出了决定性贡献。

那时，安村是众多致力于病毒和癌症关联研究的科学家之一，他对刚刚在美国被发现的SV40病毒尤为感兴趣。这种病毒被证实可使实验室的动物患上癌症（见第二章），可在非洲绿猴细胞中进行培养，即属于原代细胞的培养。但是所有培育猿猴异倍体细胞系、将之用于繁殖SV40病毒的尝试都以失败告终。安村义博将失败的原因归结于猿猴病毒的存在，其入侵导致了细胞的迅速死亡。这种感染性病毒来源广泛，它们有可能早前已在动物体内存在，也有可能是在后来被带入了培养环境，还有可能是细胞增殖所需的营养成分——牛血清带来的。

这次安村极其小心，杜绝了感染性病毒存在的可能性，终于成功基于非洲绿猴的肾脏培养出一组异倍体细胞系。他将这种细胞命名为“Vero”，结合了世界语中的绿色（Vert）和肾（Rein）两个词。

像其他的细胞系一样，非洲绿猴肾细胞也经由长途跋涉后传播至全世界。它们也被存储到了美国模式培养物集存库中，梅里厄研究所1979年获得的非洲绿猴肾细胞正是来自于此。这一年一场非同凡响的冒险开始了，抗病毒疫苗的工业化生产掀开序幕。

我们再回到数年前，第一支脊髓灰质炎疫苗，即乔纳斯·索尔克制出的灭活疫苗，自1955年起开始在美国销售。1961年，它被阿尔伯特·萨宾的减毒疫苗所替代。乔纳斯·索尔克开始了一段漫长的无人问津的时光，人们纷纷抛弃他的疫苗，转投其竞争对手——萨宾的疫苗。法国巴斯德研究所的莱皮纳博士从1955年起就研发出了与索尔克版十分类似的灭活疫苗。1957年，里昂的梅里厄研究所获得了生产巴斯德式疫苗的许可，几年之中，疫苗的年产量达到500万支。由于这些疫苗是从猴肾原代细胞中制出的，上千只非洲猴子为此付出了生命的代价。这种质量可靠的疫苗制作起来十分困难，数量也就十分有限了。

查尔斯·梅里厄那时希望他在里昂当地实验室制作出的脊髓灰质炎疫苗能实现量产并行销世界。为此，他着手与乔纳斯·索尔克开展合作。后者也一直在等待着向其终生对手阿尔伯特·萨宾“复仇”的那一刻，他梦想有一天自己的疫苗能够重回世界舞台的中央。

第一重限制因素就是疫苗生产数量，为实现梅里厄的愿望，必须要大力提高疫苗的产能。这时又有一位人物登场了：就职于荷兰皇家公共健康和卫生学院（RIVM）的工程师图恩·范·韦策尔（Toon Van Wezel）。后者有一个极妙的想法，即将微珠悬挂在摇晃的大型发酵罐中，培养猴肾细胞。实际上，细胞培养的限制性因素正在于其繁殖的环境物料，也就是器皿。

这一时期，人们还用大型玻璃容器（400平方厘米起）培养细胞，其体积庞大，很难操控，培养出的细胞数量必然有限，每次病毒培养最多能使用500—600个玻璃容器。20世纪70年代末，人们开始使用玻璃珠培养细胞，细胞附着在滚珠周围并增殖，这就大大增加了可用的培养面积。我们可以算出，1500升容量试验罐的培养面积与10万个玻璃容器相当，产能可以被提升200倍——疫苗产业应运而生了。

还有一个重要问题有待解决：猴肾细胞的供应。毫无疑问，产能的提升必然伴随着非洲猴进口数量的增加，后者从此不再以千数计，而是以数十万计。梅里厄仿佛面临着物料供应上的绝境。于是乔纳斯·索尔克向他提议，用具有无限增殖能力的猿猴异倍体细胞替代，他们最终选中了Vero细胞。

但使用这种细胞必须得到当局许可，索尔克承担了这一使命。我们之前也看到了，海弗里克让他的二倍体细胞WI-38得到认可是多么困难，只不过因为其中可能存在一些未知病毒就引起了恐慌。可是，20世纪70年代末，里面潜在的病毒感染风险已经不是卫生当局的主要担忧。索尔克面对的是当局对疫苗诱发癌症的忧虑，作为转化细胞的非洲绿猴肾细胞是否会引发癌症呢？

很明显，人们无法验证这一猜想。但是我们现在能更加领会为什么乔纳斯·索尔克要在1978年的普莱西德湖会议上阐明“他很有可能给癌症患者注射了海拉细胞但任何事都未发生”了。他当时其实是希望为在灭活疫苗生产中使用异倍体细胞开辟道路。索尔克的论据简单明了：如果向一个健康的受体注射肿瘤细胞，它的有机体会把它们当作异类细胞迅速摧毁，那么什么事都不会发生。

但是这一解释太过大而化之，要说服当局，仍然需要其他论据。梅里厄研究所的团队完成了这一工作，提出了如下补充论据：细胞的致癌性与其基因（DNA）有关，所有促使摧毁或改变其基因的方法都能降低风险，比如过滤掉这类细胞和DNA大分子、福尔马林处理以转变DNA、提纯。研究所的工作人员证实非洲绿猴肾细胞最终残留在灭活疫苗里的DNA成分十分微弱，含量低于100pg注1。他们最终用这一点说服了国家卫生部门。

注1 皮克（pg），1pg=10^-12g。

大功告成的梅里厄研究所于1980年新建了一座大楼，用于新型疫苗的生产。这座大楼由当时的卫生部长西蒙娜·韦伊（Simone Veil）剪彩，时任总理雷蒙·巴尔（Raymond Barre）也一并出席。梅里厄研究所的技术员们得以在这座庞大的大楼里进行工作，里面有由小到大排列的发酵器，世界各地的制药商都慕名前来参观。很快，3000万支灭活脊髓灰质炎疫苗就在这座大楼里被制造出来，而到了2007年，其年产能力已升至1亿支。欧洲首先采用了这种疫苗，美国从1999年开始也予以批准，用它取代了萨宾版减毒疫苗。可惜乔纳斯·索尔克已于1995年与世长辞，并未来得及品尝成功的果实。

梅里厄研究所（即赛诺菲巴斯德制药公司的前身）的辉煌之路这才刚刚开始，该机构在20世纪80年代末还用非洲绿猴肾细胞制出了狂犬疫苗。

但异倍体细胞的前景并没有止步于这两种已经广泛应用的疫苗，大流行流感的预防有可能成为这种细胞的下一个用武之地，我们会在第五章讲到这个故事。

让我们以疫苗制备技术在不断变化中留下的线索为这一章作结并请世人公论。我们来看看当下的现状：还有一些疫苗是利用动物制备的，如流感疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗和蜱媒脑炎疫苗是由动物胚胎制成的；狂犬病、日本脑炎的疫苗是基于鼠脑制备的。还有其他一些疫苗是由二倍体细胞制成，如风疹疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗等。而最新的疫苗则是用异倍体细胞制成，它们被用在了脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、轮状病毒疫苗、流感疫苗和日本脑炎疫苗上。制备方式的统一化还没有被提上日程：因为人们不会轻易更改一种尚且行之有效的疫苗！