必 备 知 识

一、培养基的主要成分

培养基的主要成分包括：水、无机成分、有机营养（糖类、维生素类、肌醇、氨基酸、天然有机附加物）、植物生长调节物质、琼脂等。

1．水

水是植物原生质体的组成部分，也是一切代谢过程的介质和溶剂，是生命活动中不可缺少的物质，所以它在培养基中所占的比例是最大的。它能提供植物生长所需的C、H、O元素，在配制母液和培养基中，为保持母液和培养基配方的准确性，通常使用无菌水或蒸馏水，大规模生产时，也可用过滤的自来水。

2．无机成分

无机成分指植物在生长发育时所需的各种化学元素。根据植物对各种无机营养元素的吸收量，可将其分为大量元素和微量元素。

（1）大量元素　大量元素指培养基中浓度大于0.5mmol/L的元素，有N、P、K、Ca、Mg、S等。

① N　是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时N元素以NO和NH两种形式供应。大多数培养基既含有NO又含有NH。NH对植物生长较为有利。作为供应物质的有KNO₃、NH₄NO₃等。有时也添加氨基酸来补充氮素。

② P　是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅能增加养分、提供能量，而且也促进外植体对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH₂PO₄或NaH₂PO₄等。

③ K　与糖类合成、转移及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不宜过大，一般以1～3mg/L为好。制备培养基时，常以KCl、KNO₃等盐类提供。

④ Mg、S和Ca　Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含硫氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO₄·7H₂O提供，用量以1～3mg/L较为适宜。Ca是构成细胞壁的一种成分，对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl₂·2H₂O提供。

（2）微量元素　微量元素指培养基中浓度小于0.5mmol/L的元素，包括Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制作培养基时不用Fe₂（SO₄）₃和FeCl₃[因其在pH值5.2以上，易形成Fe（OH）₃的不溶性沉淀]，而用FeSO₄·7H₂O和Na₂-EDTA结合成螯合物使用。B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。

总之，植物必需营养元素可组成结构物质，也可是具有生理活性的物质（如酶、辅酶及作为酶的活化剂）参与活跃的新陈代谢。此外，其还在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁则细胞停止分裂；缺硫表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼则影响细胞的伸长。

3．有机营养

培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。根据不同的培养目的，基本培养基中往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类。

（1）糖类　最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好地生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%～3%，常用3%，即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%；但在胚培养时采用4%～15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解，制订配方时要给予考虑。在大规模生产时，可采用食用的绵白糖代替。

（2）维生素　这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最好的生长。主要加入的维生素有维生素B₁（盐酸硫胺素）、维生素B₆（盐酸吡哆醇）、维生素B₁₁（烟酸）、维生素C（抗坏血酸），有时还使用维生素H（生物素）、维生素M（叶酸）、维生素B₂（核黄素）等。一般用量为0.1～1.0mg/L。维生素B₁对愈伤组织的产生和活力有重要作用，维生素B₆能促进根的生长，维生素B₁₁与植物代谢和胚的发育有一定关系，维生素C有防止组织变褐的作用。

（3）肌醇　又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与六分子磷酸残基相结合形成植酸。植酸可与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，还可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为100mg/L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。

（4）氨基酸　是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，甘氨酸能促进离体根的生长。其他如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等也常用。其中丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化。半胱氨酸可作为氧化剂，有防褐变的作用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10～1000mg/L。由于它们营养丰富，极易引起污染，如在培养中无特别需要，以不用为宜。

（5）天然复合物　其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它们的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。

① 椰乳　椰乳是椰子的液体胚乳，是使用最多、效果最好的一种天然复合物。一般使用量在10%～20%，与其果实成熟度及产地关系很大。它在愈伤组织和细胞培养中具有促进生长的作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1mm时，椰乳就不发生作用。

② 香蕉　一般用量为150～200mL/L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对pH值的缓冲作用大，主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。

③ 马铃薯　马铃薯去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150～200g/L。对pH值缓冲作用也较大。添加后可得到健壮的植株。

④ 水解酪蛋白　为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100～200mg/L。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。

⑤ 其他　酵母提取液（0.01%～0.05%），主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液（0.01%～0.5%）、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。

4．植物激素

植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各种成分中，植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。

（1）生长素类　在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下（10^－8～10^－5mg/L）就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。

IAA（indoleacetic acid，吲哚乙酸）是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。

IBA（indolebutyric acid，吲哚丁酸）是促进发根能力较强的生长调节物质。

NAA（naphthaleneacetic acid，萘乙酸）在组织培养中的启动能力要比IAA高出3～4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温、高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。

2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）启动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。

生长素配制时可先用少量95%乙醇（俗称酒精）助溶；2，4-D可用0.1mol/L的NaOH或KOH助溶；生长素常配成1mg/mL的溶液贮于冰箱中备用。

（2）GA（gibberellic acid，赤霉素）　有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是GA₃，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。

赤霉素溶于乙醇，配制时可用少量95%乙醇助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70%～100%失效，应当采用过滤灭菌法加入。

（3）细胞分裂素类（cytokinin）　这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、KT（kinetin激动素）、ZT（zeatin玉米素）等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。

在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽；②促进细胞分裂与扩大；③抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。

生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是产生愈伤组织，还是长根或长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。

生长调节物质的使用浓度甚微，一般用“mg/L”表示。在组织培养中，生长调节物质的使用浓度因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素的使用浓度为0.05～5mg/L，细胞分裂素为0.05～10mg/L。

5．培养材料的支持物

（1）琼脂（agar）　在固体培养时，琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子糖类，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂的用量在6～10g/L，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去；若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关。长时间的高温会使凝固能力下降；过酸、过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。

加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比，优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等；但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。

（2）其他　有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是其排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。

6．抗生物质（antibiotic）

抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5～20mg/L。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其在快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%～10%的抗生素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为用了抗生素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生出来造成的。

7．抗氧化物（antioxide）

植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以至黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。木本植物，尤其是热带木本及少数草本植物培养中，此现象较为严重。目前还没有彻底解决的办法，只能按不同的实际情况，采用添加一些药物并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及维生素C，可用50～200mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇及二乙基二硫氨基甲酸酯等。

8．活性炭（active carbon）

活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松、孔隙大、吸水力强，有很强的吸附作用，其颗粒大小决定着吸附能力，粒度越小、吸附能力越大。温度低，吸附力强；温度高，吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5～10g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质，以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；其效力优于维生素C和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阈值，一般为0.1%～0.2%，不能超过0.2%。

活性炭对生根有明显的促进作用，其机制一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA遇可见光易被氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长。由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好的作用。

活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基中加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。但是，活性炭也具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100mg左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此需要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性炭放入培养基的做法，会带来不良的后果。因此，在使用时要有量的意识，使活性炭发挥其积极作用。

9．染色剂的使用

有时为了对不同培养基进行标记，可在培养基中加入染色剂。染色剂一般用亚甲蓝、中性红、甲基紫等。使用时配制成1%的浓度，在每升培养基中加入1～3滴。由于染色剂的剂量极微，所以不会对实验产生影响，且节省时间。

二、培养基的pH值

培养基的pH值因培养材料不同而异，大多数植物要求pH值为5.6～5.8，常用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH来调节培养基的pH值。

注：①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2～0.8，故调整后的pH值应高于目标pH值0.5个单位；②pH值的大小影响琼脂的凝固能力，一般pH＞6时培养基会变硬，pH＜5时琼脂不能很好地凝固。

三、常用培养基的种类、配方及特点

1．培养基的种类

培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的，需选用不同的培养基。

最早应用培养基的是Sacks（1680）和Knop（1681），他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土壤中主要是吸收无机盐营养的特性，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在20世纪40年代用得较多，现在还常用。而到20世纪60年代和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，它可以保证培养材料对营养的需要，并且生长快、分化快，而且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分含量有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。

培养基的名称一直根据沿用的习惯，多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基（简称MS培养基），也有对某些成分进行改良称作改良培养基。

（1）根据态相不同固体培养基

（2）根据培养物的培养过程初代培养基

（3）根据作用不同

（4）根据营养水平不同

2．几种常用培养基的特点

目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下。

（1）MS培养基　MS培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。

（2）White培养基　White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又做了改良，提高了MgSO₄的浓度和增加了硼素，称作White改良培养基。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。

（3）N₆培养基　N₆培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO₃和（NH₄）₂SO₄含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

（4）B₅培养基　B₅培养基是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知，有些植物在B₅培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。

（5）KM-8P培养基　KM-8P培养基是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。

3．几种常用培养基的配方

几种常用培养基的配方见表2-1。

四、培养基配方试验设计与筛选

在进行植物组织培养时，选择最佳培养基是成功的关键。为了能研制出一种适用的培养基，最好先选用一种已被广泛采用的基本培养基（如MS、B₅、White、H等）。当通过一系列的实验，对该种基本培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。在改动培养基的时候，无机成分和有机成分应当分别处理。

在植物组培快繁中，最常改动的因子是生长调节物质（植物激素），尤其是生长素和细胞分裂素。

例如，进行不定芽的诱导培养时，开始可选用一种基本培养基（如MS），再附加细胞分裂素类（如6-BA）、生长素类（如IBA）；细胞分裂素和生长素分别设定不同的浓度，如6-BA、IBA各设5种不同浓度 （见表2-2），这两种激素5种浓度的所有可能组合，即构成了一个具有25项处理的实验。由这25项处理中选出最佳的一个组合，然后在保持浓度不变的情况下，再试验其他种类的生长素和细胞分裂素。当改变细胞分裂素的种类时，保持原生长素不变，反之亦然。另外，虽然高浓度盐分培养基对若干实验体系来说都已证明效果很好，但有些培养物在低浓度盐分培养基上生长得会更好。因此，在保持生长调节物质最佳组合不变的情况下，就还有必要试验一下1/4和1/2水平的基本培养基盐分的效果。最后，还要进行一系列的实验以确定最适合的蔗糖浓度（2%～6%以至更高）。通过上述这些实验，常常就足以研制出一种适合的培养基。不过，要对这种培养基做进一步的改良，还有很多其他可能性值得探讨。

为了能为一个新的实验体系选出最适合的培养基，De Fossard等（1974）介绍了“广谱实验法”。与上面介绍的方法相比，这一方法比较复杂。但若利用简单的方法解决不了问题，就有必要用该方法试验一下。

这种广谱实验法是把培养基中的所有组分分为4大类，即无机盐、生长素、细胞分裂素、有机营养物质（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。对每一类物质再选定低（L）、中（M）、高（H）3种浓度（见表2-3），4类物质各3种浓度的不同组合构成一项包括81个处理的实验。在这81个处理中，筛选出适宜的处理。达到这个阶段以后，即可再试验不同类型的生长素和细胞分裂素，以筛选出它们的最佳类型。有些实验系统对于生长素和细胞分裂素这两类生长调节物质的具体形式非常敏感。

在植物组织培养中，影响因素较多，如基本培养基、细胞分裂素、生长素、糖浓度、光照、pH值等。要筛选出最佳培养基和培养条件，需要进行大量的实验。为了减少实验次数，节约时间，常采用正交实验设计。

正交设计是多因素分析的有力工具，它可以很方便地从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平，因其可以用较少的实验次数得到较多的信息。如7因素2水平的实验，要将各因素水平全部组合都做一次，需要做128次实验，而正交设计只需做8次实验就基本代表了全部实验情况，可收到事半功倍的效果。正交设计的主要工具是正交表，在进行组培快繁多因素分析时，可参照生物统计学有关章节，选择与实验相符合的正交表，然后进行实验和分析。

五、培养基的配制和保存

1．母液的配制和保存

在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制营养液的浓缩液，这样做不但可以保证各物质成分配制时的准确性及快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液浓度为所需浓度的10～100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca^2＋和SO，Ca^2＋、Mg^2＋和PO一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。

下面以MS培养基制备为例，概述其制备方法（配方见表2-4，具体制备方法见任务1）。

（1）大量元素母液　可配成为所需浓度10倍的母液。用分析天平按表2-4称取药品，分别加100mL左右蒸馏水溶解后，再用磁力搅拌器搅拌，促进溶解。注意Ca^2＋和PO易发生沉淀。然后倒入1000mL定容瓶中，再加水定容至刻度，成为10倍母液。

（2）微量元素母液　可配成为所需浓度100倍的母液。用分析天平按表2-2准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000mL。

（3）铁盐母液　可配成100倍的母液，按表2-4称取药品，可加热溶解，混合后加水定容至1000mL。

（4）有机物母液　可配成500倍的母液。按表2-4分别称取药品，溶解，混合后加水定容至500mL。

（5）激素母液的配制　每种激素必须单独配成母液，浓度一般为1mg/mL。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成50mL或100mL。另外，多数激素难溶于水，要先溶于可溶物质，然后才能加水定容。

它们的配法如下。将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95%乙醇溶液中，再加水定容。NAA可先溶于热水或少量95%乙醇溶液中，再加水定容。2，4-D可用少量1mol/L NaOH溶解后，再加水定容。KT和BA先溶于少量1mol/L的HCl中再加水定容。将玉米素先溶于少量95%的乙醇中，再加热水定容。配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。

2．培养基的制备

以配制1L MS培养基为例，简要介绍培养基的配制过程。

（1）在烧杯中放入一定量的水，再按母液的顺序依次加入需要的量。

（2）加入蔗糖并溶解。

（3）定容至所要求的体积。

（4）调节pH值，可用pH试纸或酸度计进行测量。

在用酸度计测量前，首先要对其进行校准，常用的校正液有三种：邻苯二甲酸氢钾（pH4.00，25℃）、混合磷酸盐（pH6.86，25℃）、四硼酸钠（pH9.18，25℃），选择合适的校正液进行校准，校准后才可测定pH值。

（5）加入琼脂，并加热溶解，溶解过程中搅拌，以免造成浓度不均匀。

（6）培养基分装。将配好的培养基在其未凝固的情况下（40℃）尽快分装到试管、三角瓶等培养容器中，分装时要掌握好培养基的量，一般以占试管、三角瓶等培养容器的1/4～1/3为宜，分装时要注意不要将培养基沾到壁口，以免引起污染。

（7）封口：分装后的培养基应尽快封口，以免培养基中的水分蒸发。

（8）灭菌：封口后的培养基应尽快进行高压蒸汽灭菌，灭菌不及时会造成杂菌大量繁殖，使培养基失去效用。

灭菌过程中应注意：灭菌前应检查一下灭菌锅底部的水是否充足，应添加到水位线处；灭菌加热过程中应使灭菌锅内的冷空气排尽，以保证灭菌彻底。

排气的方法有两种：一种是开始时就打开放气阀，等大量冷空气排出后再关闭放气阀；另一种是先关闭放气阀，当压力升到0.05MPa时，打开放气阀排出冷空气后，再关闭放气阀进行升温、升压。

灭菌时，应使压力表读数为0.1～0.15MPa即121℃保持20min即可，灭菌时间不宜过长，否则蔗糖等有机物会在高温下分解，使培养基变质，甚至难以凝固，灭菌时间也不宜过短，否则灭菌不彻底易造成培养基污染。

灭菌后应切断电源，使灭菌锅内的压力缓慢降下来，接近“0”时，才可打开放气阀，排出剩余蒸汽后，打开锅盖取出培养基。（若切断电源后急于取出培养基而打开放气阀，造成降压太快，使容器内外压强差过大，会使液体溢出造成浪费、污染，甚至危害人身安全。）

某些生长调节物质（如IAA、IBA、ZT及某些维生素、抗生素、酶类等）湿热易分解，不能进行高压、高温灭菌，需要进行过滤灭菌。

3．培养基的存放

经过高温高压灭菌的培养基取出后，放在洁净、无灰尘、遮光的环境中进行贮存。贮存的时间不宜过长，尽可能在两周内用完。含有生长调节物质的培养基最好能在4℃低温保存，效果更理想（注意在培养基凝固过程中不要移动容器，待凝固后再进行转移。）