必 备 知 识
一、实验室的设计原则与总体要求
植物组织培养是一项技术性较强的工作。为了确保植物组织培养工作的顺利进行，在进行植物组织培养之前，不论是以实验为目的还是以工厂化生产为目的，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有较为全面的了解，便于以后工作的开展。
（一）设计原则
（1）防止污染。控制住污染，就等于组织培养成功了一半。
（2）按照工艺流程科学设计，经济、实用和高效。
（3）结构和布局合理，工作方便，节能、安全。
（4）规划设计与工作目的、规模及当地条件等相适应。
（二）总体要求
（1）实验室选址要求避开污染源，例如最好避免与温室、微生物实验室、昆虫实验室等相邻。水电供应充足，交通运输便利。
（2）保证实验室环境清洁。实验室洁净，可从根本上有效控制污染。这是组织培养工作的最基本要求，否则会使植物组织培养工作遭受不同程度甚至是不可挽回的损失。因此，过道和设备防尘、外来空气的过滤装置等设计是必要的。
（3）实验室建造时，应采用产生灰尘量最少的建筑材料；墙壁和天花板、地面的交界处宜做成弧形，便于日常清洁；管道要尽量暗装，安排好暗敷管道的走向，便于日后的维修，并能确保在维修时不造成污染；洗手池、下水道的位置要适宜，不得对培养环境造成污染，下水道开口位置应对实验室的洁净度影响最小，并有避免污染的措施；设置防止昆虫、鸟类、鼠类等动物进入的设施。
（4）接种室、培养室的装修材料还须经得起消毒、清洁和冲洗，并设置能确保与其洁净度相应的控温、控湿设施。
（5）实验室电源应由专业部门设计、安装并经验证合格之后，方可使用。应有备用电源，确保停电或掉电时能继续操作。
（6）实验室必须满足实验准备（器皿的洗涤与存放、培养基制备和无菌操作、用具的灭菌）、无菌操作和控制培养三项基本工作的需要。
（7）实验室各分室的大小、比例要合理。一般要求培养室与其他分室（除驯化室外）的面积之比为3∶2；培养室的有效面积（即培养架所占面积，一般占培养室总面积的2/3）与生产规模相适应。
（8）明确实验室的采光、控温方式，应与气候条件相适应。一般采用人工光照和恒温控制，实验室为密封式或半地下式。
二、实验室的基本组成
实验室的基本组成如图1-1所示。
1-1 植物组织培养基本实验室
G—药品柜、仪器柜、器皿柜；T—实验台；B—冰箱；H—烘箱；S—水槽；R—热空气消毒箱；
m—高压灭菌器；Q—人工气候箱；C—超净工作台；P—培养架子；K—空调
（一）基本实验室
基本实验室包括准备室、灭菌室、缓冲间、无菌操作室、培养室，是组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产组培苗4万～20万，需3～4间实验用房，总面积60m2。
1．准备室
（1）主要功能 用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗（也称试管苗）的出瓶、清洗与整理，培养基的配制、植物材料的预处理等。
（2）设计要求 小型实验室面积一般为10～20m2。要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，方便多人同时工作；有电源、自来水和水槽（池），上下水道畅通；地面耐湿、防滑、排水良好，便于清洁。
（3）仪器与用具配置 工作台、烘箱、晾干架、周转筐（塑料或铁制）、各种规格的毛刷、药品柜、电子分析天平、托盘天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴锅、电炉（或微波炉、电饭煲、液化气炉灶等）、培养基灌装机、普通冰箱、低温冰箱（低于－20℃）等仪器设备；移液管（或微量移液器）、移液管架、培养瓶（包括试管）、棕色或透明试剂瓶、烧杯（带刻度或不带刻度）、量筒、容量瓶、培养皿、吸管、皮下注射器、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压塑料薄膜等封口材料、尼龙绳、脱脂棉、纱布、工作台、蒸馏水桶、医用小推车等用品和用具。此外，配备器械柜和药品柜，分别存放接种用具和分类存放化学试剂。最好配备防尘设备，以减少灰尘污染。
2．灭菌室
（1）主要功能 用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。
（2）设计要求 专用的小灭菌室面积一般为5～10m2。要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。生产规模较小时，可与洗涤室、配制室合并在一起，但灭菌锅的摆放位置要远离天平和冰箱，而且必须设置换气窗或换气扇，以利通风换气。
（3）仪器与用具配置 压力灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。
3．缓冲间
（1）主要功能 防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌。接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。
（2）设计要求 面积不宜太大，一般在2～3m2。要求空间洁净，墙壁光滑平整，地面平坦无缝，并在缓冲间和接种室之间用玻璃隔离，配置平滑门，以便于观察、参观和减少开关门时的空气扰动。空间安装1～2盏紫外光灯，用以接种前的照射灭菌；配备电源、自来水和小洗手池，备有鞋架、拖鞋和衣帽挂钩，分别用于接种前洗手、摆放拖鞋和悬挂已灭过菌的工作服。
（3）仪器与用具配置 紫外光灯、小洗手池、搁架、鞋架、衣帽钩、拖鞋、工作服、实验帽和口罩等。
4．接种室
（1）主要功能 进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培养的成功与否起着重要作用。
（2）设计要求 接种室不宜设在易受潮的地方。其大小根据实验需要和环境控制的难易程度而定。在工作方便的前提下，宜小不宜大，小的接种室面积5～7m2即可。接种室要求密闭、干爽安静、清洁明亮；塑钢板或防菌漆的天花板、塑钢板或白瓷砖的墙面光滑平整，不易积染灰尘；水磨石或水泥地面平坦无缝，便于清洗和灭菌。配备电源和平滑门窗，要求门窗密封性好；在适当的位置吊装紫外光灯，保持环境无菌或低密度有菌状态；安置空调机，实现人工控温，这样可以紧闭门窗，减少与外界空气对流。接种室与培养室通过传递窗相通。最好进出接种室的人流、物流分开。
（3）仪器与用具配置 超净工作台、空调机、解剖镜、接种器具消毒器（或高温焚化炉）、紫外光灯、酒精灯、广口瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、工作台、搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒（盛放70%～75%酒精，用于浸泡接种工具）或医院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗更换。
5．培养室
（1）主要功能 培养离体材料。
（2）设计要求 培养室的设计应从以下几方面考虑。
① 培养室的大小可根据生产规模和培养架的大小、数目及其他附属设备而定。每个培养室不宜过大，面积10～20m2即可，以便于对条件的均匀控制。其设计以充分利用空间和节省能源为原则，最好设在向阳面或在建筑的朝阳面设计双层玻璃墙，或加大窗户，以利于接收更多的自然光线，窗的高度比培养架略高为宜。培养室外最好有缓冲间或走廊。
② 能够控制光照和温度。通常根据培养过程中是否需光，设计成光照培养室和暗培养室；材料的预培养、热处理脱毒或细胞培养、原生质体培养等在光照培养箱或人工气候箱内进行。采用光照时控器控制光照时间。
采用空调机调控培养室内的温度。培养室面积较小时，采用窗式或柜式的冷暖型空调；培养室面积较大时，最好采用中央空调，以保证培养间内各部位温度相对均衡。
③ 保持整洁，防止微生物感染。要求天花板、墙壁光滑平整、绝热防火，最好用塑钢板或瓷砖装修；地面用水磨石或瓷砖铺设，平坦无缝，方便室内消毒，并有利于反光，提高室内亮度。
④ 摆放培养架，以立体培养为主。培养架要求使用方便、节能、充分利用空间和安全可靠。一般设六层，高度2m，最下一层距地面0.2m，最上一层高1.7m，层间距为30cm，架宽0.6m，架长以40W日光灯管的长度来决定，每个培养架安装2～3盏日光灯，多个培养架共用1个光照时控器。安装日光灯时最好选用电子整流器，以降低能耗。架材最好用带孔的新型角钢条，可使搁板上下随机移动。
⑤ 能够通风、降湿、散热。培养室的门窗密封性要好，有条件的可用玻璃砖代替窗户，并安装排气扇，以备在湿度高、空调有故障时可以打开排气扇通风排气、散热。南方湿度高的地方可以考虑在培养室内安装除湿机。
⑥ 培养室外应设有缓冲间或走廊。
⑦ 培养室内用电量大，应设置供电专线和配电设备，并且配电板置于培养室外，保证用电安全和方便控制。
此外，为适应液体培养的需要，在培养室内配备摇床和转床等设备，但要注意在大型摇床下面应有坚实的底座固定，以免摇床移位或因振动大而影响培养车间内的其他静止培养。
（3）仪器与用具配置 空调机、排气扇、摇床、转床、光照培养箱或人工气候箱、除湿机、光照时控器、干湿温度计、温度自动记录仪及最高最低温度记录仪、培养架、日光灯、工作台、配电盘等。
6．驯化棚室
（1）主要功能 进行组培苗的驯化移栽。
（2）设计要求 组培苗的驯化移栽通常在温室或塑料大棚内进行。其面积大小视生产规模而定。要求环境清洁无菌，具备控温、保湿、遮阴、防虫和采光良好等条件。
（3）仪器与用具配置 具备弥雾装置、遮阳网、暖气或地热线、移栽床（固定式或活动式）等设施；塑料钵、花盆、穴盘等移栽容器；草炭、沙子等移栽基质。
（二）辅助实验室
根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析等。
1．细胞学实验室
功能：用于对培养物的观察分析与培养物的计数，对培养材料进行细胞学鉴定和研究，由制片室和显微观察室组成。制片是获取显微观察数据的基础，应配备有切片机、磨刀机、恒温箱及样品处理和切片染色的设备。应有通风柜和废液处理设施。显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。
要求：明亮、清洁、干燥，防止潮湿和灰尘污染。
设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。
2．生化分析实验室
功能：以培养细胞产物为主要目的的实验室，应建立相应的分析化验实验室，随时对培养物成分进行取样检查。大型次生代谢物生产，还需有效分离实验室。
三、主要用具及仪器设备
（一）仪器设备
1．超净工作台
超净工作台原用于半导体元件与精密仪器仪表的生产，现已成为植物组织培养中最常用的无菌操作装置。优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。紫外灭菌20～30min即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常、长久地工作，超净台是很理想的设备。超净工作台功率在145～260W，装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，除去了大于0.3μm的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24～30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等进行灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。超净工作台分水平式和垂直式两种，又有单人、双人、三人等类型。
2．无菌手套箱（接种箱）
接种箱可以自制也可购买，前面有玻璃便于观察，左右两侧各有一孔，孔内有一手套袖，避免污染。两侧有拉门。在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净工作台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。
3．空调机
接种室和培养室的室温保证都需要空调机，空调机应安置在室内较高的位置，以便于排热散凉。
4．除湿机和加湿器
培养室的相对湿度应为70%～80%。湿度过高，易长杂菌；湿度过低，培养器皿内的培养基会失水变干，影响培养物的生长。
5．恒温箱
恒温箱用于植物材料的培养，可以控制温度、湿度及光照等。有条件的话，可选择全自动的人工气候箱。
6．烘箱
烘箱用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80～100℃；进行干热灭菌需保持150℃，达1～3h；若测定干物重，则温度应控制在80℃，烘至完全干燥为止。
7．高压灭菌锅
高压灭菌锅是植物组织培养中最基本的设备之一，用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅，通常以电作能源。
8．冰箱
冰箱分为普通冰箱和低温冰箱。主要用于贮存母液，各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。
9．电子分析天平和托盘天平
电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品，精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。
10．显微镜及解剖镜
显微镜及解剖镜种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5～80倍。放大40倍以上的操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。
11．水浴锅
水浴锅用于溶解难溶药品和熔化琼脂条。
12．摇床与转床
摇床与转床用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟100次左右，在解离原生质体时为每分钟80次左右。
13．磁力搅拌器
磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。
14．电蒸馏水器
电蒸馏水器采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配制培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。
15．酸度计
组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计；若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。
首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度钮使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。
16．离心机
离心机用于收集原生质体，转速要求较低。一般为1000～4000r/min即可。
17．培养基分装器
将配制好的培养基分装于试管，为了节省时间和避免浪费，在工厂化组配车间，可用培养基分装器进行灌装。
18．电炉等加热设备
电炉等加热设备用于固体培养基配置时溶解琼脂，可选择电炉、电磁炉、微波炉等。
（二）各类器材
1．培养器皿
在组织培养中配制培养基和进行培养时需用大量的玻璃器皿。其要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压、高温，能方便地放入培养基和培养材料，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。
最常使用的是三角瓶，规格有100mL、250mL、500mL等。一般使用100mL三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好，且瓶口较小，亦不易污染。
培养皿常用90mm、120mm直径等规格，要求上、下能密切吻合。它在游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养，无菌种子的发芽，植物材料的分离等过程中都要用到。
试管常用18mm×180mm或20mm×200mm规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不易污染。
培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200mL罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。
目前，培养容器和制备培养基所用的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点。如培养容器多为平底方盒形，能一层层地叠摞起来，从而节省空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。
瓶口封塞可用多种方法，但要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞，这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸，经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。
2．分注器
小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用“下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一个弹簧止水夹，使用时非常方便。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。
3．离心管
离心管用于离心收集原生质体，一般用5mL、10mL规格。
4．刻度移液管
刻度移液管常用的有0.1mL、0.2mL、0.5mL、2mL、5mL、10mL，用于配制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开使用。
5．细菌过滤器
培养基中有些生长调节物质以及有机附加物，如吲哚乙酸、赤霉素等，在高温条件下易被分解破坏，可用细菌过滤器除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22μm微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头、注射器或采用抽滤装置（真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等）。
6．实验器皿
在组织培养中配制培养基、贮藏母液、材料的消毒等需要用到的各种化学实验玻璃器皿，包括100mL、250mL、500mL、1000mL的烧杯，10mL、100mL、1000mL的量筒，100mL、1000mL的试剂瓶（棕色）等。
（三）器械用具
1．镊子类
常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，若用100mL的三角瓶作为培养瓶，可用20cm长的镊子。镊子过短，容易使手接触瓶口，造成污染；镊子太长，使用起来不灵活。如在分离茎尖幼叶时，则用钟表镊子。
2．剪刀类
可采用医疗五官科用的中型剪刀，主要用于切断茎段、叶片等；也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。
3．解剖刀
切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。
4．解剖针
解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织，也可用于分离微茎尖的幼叶。可以自制。
5．接种工具
接种工具包括接种针、接种钩及接种铲，由白金丝或镍丝制成。
6．钻孔器
钻孔器常在取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时采用。一般为“T”字形，口径有各种规格。
7．其他
其他包括酒精灯、电炉、试管架、搪瓷盘、玻璃棒等多种。
四、实验室的管理
（一）洗涤
1．器皿的清洗
植物组织培养中对各种培养器皿要求洗涤清洁，以防止带入有毒物或影响培养效果的化学物质或微生物等，对那些常用的玻璃器皿的清洁要求更为严格。清洗玻璃器皿用的洗涤剂主要有肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤剂（由重铬酸钾和浓硫酸混合而成）。新购置的器皿，先用1%的稀盐酸浸泡，后用肥皂水洗净，清水冲洗，再用蒸馏水淋一遍。用过的器皿，先要除去其上的残渣，再用试管刷沿壁上下刷动和旋转刷洗。刷后用清水冲洗，再用肥皂水或洗涤剂洗净，再用清水彻底冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一遍，干后备用。已被污染的器皿则必须在高压灭菌后，用肥皂水或洗涤剂洗净，再用清水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗一遍，干后备用。洗好的瓶子应该透明光亮，内外壁水膜均匀，不挂水珠。
移液管之类的仪器，可用洗耳球和热洗衣粉水吸洗，再放在水龙头下流水彻底冲净，垂直放置晾干后使用。
2．金属用具的清洗
新购置的金属用具表面有一层油脂，需擦净后再用肥皂水洗净，清水冲洗干净后，擦干备用。用过的金属用具，清水冲洗干净后，擦干备用即可。
（二）灭菌
灭菌是进行植物组织培养的关键环节之一，包括对植物材料、培养基、器皿器械、实验室等的灭菌。不同的灭菌对象所采用的灭菌方法也不同，可参见表1-1。
表1-1 灭菌方法
现介绍几种常用的灭菌方法。
1．干热灭菌
干热灭菌是适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌方法，即利用烘箱或热空气消毒箱等加热到160～180℃，1～3h杀死微生物的方法。但由于此方法灭菌时能源消耗大、时间长，所以一般不常用。
2．湿热灭菌
湿热灭菌是植物组织培养中最常用的灭菌方法，即利用高压灭菌锅灭菌的方法，适用于培养基、玻璃器皿、金属器械、布制品等的灭菌。通常灭菌温度121℃，压力108kPa，20～30min。
3．熏蒸灭菌
为了确保无菌室和培养室无菌，每年要进行1～2次熏蒸灭菌。对无菌室可以直接熏蒸。对培养室进行熏蒸时，须将培养物取出放置于无菌环境下，待熏蒸灭菌完成后用75%的酒精棉球擦拭培养瓶后方能将其放入培养室。具体方法是用甲醛和高锰酸钾或乙二醇加热熏蒸，用量一般是每立方米用甲醛2mL、高锰酸钾1g或用乙二醇6mL。
（三）准备室及灭菌室的管理
保证房间干燥、清洁卫生，药品管理要有专门的药品柜，各种药品要求合理摆放，最好建立入柜登记制度，做到同一药品先入先出。各类器皿使用后要按照规范洗涤干净后放入药品柜存放。小型仪器使用后也要求清理干净后入柜。
（四）无菌室及培养室的管理
无菌室及培养室要求清洁并无菌。可采用每年1～2次熏蒸灭菌及75%酒精擦拭地面及台面的方式灭菌。