实验四　酵母RNA的提取及组分鉴定

一、实验目的

1.掌握RNA的组分和鉴定方法。

2.学习稀碱法提取酵母RNA的原理与操作。

二、实验原理

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3～4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱（本实验用 0.2% NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH为2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA达 2.67%～10.0%，而DNA含量仅为 0.03%～0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

三、器材和试剂

1.器材

干酵母粉（市售），电子天平，100mL烧杯，50mL量筒，10mL量筒，0.5mL移液管，1mL 移液管，2mL 移液管，5mL移液管，离心机，锥形瓶，研钵，沸水浴装置等。

2.试剂

（1）0.2%氢氧化钠溶液　2g NaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL。

（2）浓盐酸（AR）。

（3）95%乙醇。

（4）酸性乙醇（CP）。

（5）氨水（CP）。

（6）10%硫酸溶液　浓硫酸（相对密度1.84）10mL，缓缓倾于水中，稀释至100mL。

（7）5%硝酸银溶液　5g AgNO₃溶于蒸馏水并稀释至100mL，储存于棕色瓶中。

（8）苔黑酚-三氯化铁试剂　将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl₃·6H₂O。临用时配制。

（9）定磷试剂。

四、实验内容

1. RNA的提取

称取8g干酵母粉于100mL研钵中，干研磨，转入锥形瓶后加入 0.2% NaOH溶液 40mL，沸水浴加热 30min，经常搅拌，冷却后离心5min（4000r/min）。取上清液，缓慢加入至30mL酸性乙醇中，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，离心5min（4000r/min），沉淀备用。

向沉淀中加10%硫酸液10mL，转入锥形瓶中，加热至澄清，将RNA水解，即为水解液，进行组分鉴定。

2.鉴定

（1）核糖　取水解液1mL，加苔黑酚-三氯化铁试剂 1mL，水浴加热，观察颜色变化。

（2）嘌呤碱　取水解液1mL，加氨水2mL及硝酸银溶液1mL，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置几分钟）。

（3）磷酸　取水解液1mL、定磷试剂1mL，水浴加热，观察颜色变化。

五、结果与分析

观察记录实验过程中的现象，对其中重要的现象（比如分层、沉淀产生、颜色反应等）作分析讨论。

六、思考题

1.所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化？

2. RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？

3.本法提取的RNA是否具有生物活性？为什么？

七、注意事项

1. RNA水解过程中，需要边加热边搅拌。

2.鉴定嘌呤碱时，如果现象不明显，可适当多加1mL氨水，然后加硝酸银。