2.3 酶抑制法快速检测技术的构建
基于胆碱酯酶抑制法原理设计的农药残留检测方法主要包括速测卡法（试纸片法）、比色法和酶传感器法。
酶抑制法检测农药残留的灵敏度与使用的酶、显色反应以及反应时间、温度等有密切关系。无论采用何种具体检测方法，酶是其中决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因子，酶的种类决定了检测的灵敏度和方法的可靠性。
2.3.1 酶制剂的种类和制备
酶抑制法测定农药残留所用的酶包括乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶和植物酯酶。前两种来自于动物体内，故也称作动物酯酶。
（1）胆碱酯酶的种类
①乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类农药的最适反应底物，其活性能够专一性地被有机磷和氨基甲酸酯类药剂所抑制，用其检测这两类药剂比用丁酰胆碱酯酶和植物酯酶具有明显的专一性和可靠性，检测结果的假阳性率也明显降低。
乙酰胆碱酯酶的主要来源包括动物器官（如昆虫头部和肝脏）以及动物血液（如马血清）等，以由家蝇头部获取的乙酰胆碱酯酶活性最高。来自昆虫头部的乙酰胆碱酯酶存在原料不易获取、含量低、不是单一分子型、纯化困难、稳定性差、成本高等不足，远远不能满足当前残留检测的需求。针对此问题，学者们广泛开展了不同来源的乙酰胆碱酯酶活性筛选研究，以期获得廉价易得、酶活性较高、易分离纯化的乙酰胆碱酯酶。
余孝颖（1996）用酶电极研究了有机磷农药对3种不同来源的乙酰胆碱酯酶选择性抑制的情况，结果表明家蝇中的乙酰胆碱酯酶对敌敌畏的抑制最敏感，电鳐次之，鸡肝最弱。
张慧君等（2004）研究了4种农药对鸡肝酶和电鳗乙酰胆碱酯酶的总酯酶活力以及乙酰胆碱酯酶活力的抑制灵敏度，发现鸡肝总酯酶活力与电鳗乙酰胆碱酯酶活力受农药的抑制灵敏度相近，并且鸡肝总酯酶活力在检测农残时，可获得更低的农药含量检出限，除马拉硫磷外均低于国家规定的最大农药残留限量标准。因此，以测总酯酶活力的方法替代测乙酰胆碱酯酶活力的方法，同样可以达到快速检测农药残留的目的，而且鸡肝酶具有提取简便、价格低廉的优点。
②丁酰胆碱酯酶 丁酰胆碱酯酶主要来自动物血清，是乙酰胆碱酯酶的替代品。与乙酰胆碱酯酶检测结果相比，用丁酰胆碱酯酶检测农药残留存在着专一性和可靠性低、检测结果假阳性率高等问题。
李颖畅等（2013）采用驴血清中的丁酰胆碱酯酶作为酶源，对不同的有机磷农药的检测条件和方法进行了研究。结果表明，乐果、敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷对驴血清丁酰胆碱酯酶（BChE）的IC50分别为0.094mg/mL、0.179mg/mL、0.124mg/mL、0.0078mg/mL，驴血清BChE对这4种有机磷农药灵敏度的大小顺序为：马拉硫磷>乐果>敌敌畏>敌百虫。乐果、敌敌畏对丁酰胆碱酯酶的最佳抑制时间为15min；敌百虫、马拉硫磷对丁酰胆碱酯酶的最佳抑制时间为20min。
李维等（2014）以马血清丁酰胆碱酯酶为对照，以碘化硫代丁酰胆碱为底物，采用Ellman法，研究了鸡血清丁酰胆碱酯酶的酶学性质及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性。结果发现，两种BChE在35℃、pH8.0时都达到最佳的反应活性，无底物抑制效应，对毒扁豆碱敏感，对盐酸多奈哌齐相对不敏感；鸡血清BChE对敌百虫、克百威、灭多威、速灭威、敌敌畏的IC50值分别为0.77μmol/L、31.99μmol/L、1.14μmol/L、5.49μmol/L、0.95μmol/L；马血清BChE对这五种农药的IC50值分别为3.88μmol/L、1.22μmol/L、22.58μmol/L、24.18μmol/L、5.46μmol/L。除克百威外，鸡血清BChE对供试农药的敏感性均高于马血清BChE。因此，鸡血清BChE具有较好的农药敏感性，可以作为农药残留快速检测的候选酶源。
③植物酯酶 农药对植物酯酶也具有抑制作用，由于植物酯酶具有酶源丰富、取材方便、制备简单、成本低、不需要低温保存且保质期长等优点，因此采用植物酯酶用于测定农药残留是一种经济实用的方法。
在植物酯酶中，小麦酯酶对农药较为敏感，但是，有学者发现不同小麦品种的酯酶对农药的敏感度不一样。肖建军等（2002）和徐斐等（2003）研究发现，豫麦39对农药乐果最敏感，豫麦18最不敏感，因此为了准确、定量测定农药残留量，必须选定一种对农药较为敏感的小麦作为酶源。这些学者还认为，对于同一品种小麦，产地不同和种植方法不同时，小麦酯酶对农药的敏感度的差异是否在容许的范围内，需要作进一步的研究，以确定可以进行定量分析而且具有互换性的植物酯酶酶源。
张宁（2006）的研究显示，玉米酯酶的活力远低于小麦酯酶的活力，不适于用来检测农药残留。
（2）胆碱酯酶的制备 当前，胆碱酯酶的制备主要是直接从动物的组织或血液中提取。从动物组织或血液提取的粗酶液中除了有ChE外，还有其他多种酶类存在，其中一些酶是解毒酶，能够催化水解农药，也有一些酯酶能够作为ChE的替代靶标，起到保护ChE的作用，这会显著影响ChE的动力学特性；此外，生物体内的乙酰胆碱酯酶并不是单一分子型，据研究表明，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）其体内的AChE主要是以疏水型的二聚体形式存在的；另据研究表明，马铃薯甲虫（Leplinotarsa decemlineata）体内的AChE存在形式主要有2种，其中一种是约占92％的亲水型二聚体，另外一种是约占8％的两性单体；不同分子型的乙酰胆碱酯酶因结构上的差异具有对农药不同的选择性和灵敏度；因此，有必要对粗酶提取液进行分离、纯化，从而提高检测的灵敏度和结果的准确性。
AChE作为一种羧酸水解酶类，它的分离纯化是应用蛋白质分离纯化的方法，分为初级纯化和液相色谱纯化。初级纯化方法主要有：离心沉淀、盐析、超滤、透析、低温有机溶剂沉淀、变性沉淀等。液相色谱纯化方法主要有：凝胶色谱、离子交换、亲和色谱等。为了使酶蛋白的纯化效果大大提高，常常需要联合使用多种技术。但是，在联合使用多种纯化技术时，由于增加了操作的步骤，易造成对温度敏感的AChE酶活的损失。
Lund等（2000）使用硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-200色谱从鲽鱼的肌肉中纯化到了胆碱酯酶，提纯倍数为2000倍。彭霞等（2008）联合采用Sephadex G-25、DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200对家蚕头部的AChE进行了纯化。贾玉玲等（2010）报道了从鲫鱼脑中提取和纯化AChE的方法，用预冷的含0.1％ Triton-X 100 PBS缓冲液（pH 8.0，0.1mol/L），冰浴条件下匀浆（匀浆比为1:4），匀浆液4℃离心（13000r/min）30min，将上清液用（NH4）2SO4（最佳浓度为40％）进行盐析，然后再进行4℃过夜透析（袋外为pH7.4、20mol/L Tris-HCl），最后用Sephadex G-100色谱纯化，实验得到了高活性较纯的AChE，酶活达到458.43μmol/（min·mg）。
亲和色谱具有高度的专一性，纯化步骤简单，纯化效率高。亲和色谱技术正在被应用于分离纯化AChE。与前面的几种纯化技术相比，简化了纯化步骤，减少诱发敏感性蛋白在纯化过程中理化性质发生变化的程度，提高了纯化的效率。朱小山等（2006）用亲和柱纯化鲅鱼的AChE，纯化倍数为415倍。魏辉等人（2009）采用CEA亲和色谱纯化家蝇AChE，纯化倍数为672倍。
2.3.2 酶法速测卡（纸片法）
速测卡法是将敏感生物的胆碱酯酶和乙酰胆碱类似物2，6-二氯靛酚乙酸酯分别经固化处理后加载到滤纸片上，在胆碱酯酶的催化作用下，2，6-二氯靛酚乙酸酯发生水解反应，生成蓝色的靛酚和乙酸。如果样品中含有机磷和氨基甲酸酯类农药，胆碱酯酶便会与其结合，失去催化靛酚乙酸酯水解的能力。因此，该方法只需通过观察最终的反应体系中有没有蓝色出现就可判断出所测样品中是否含有农药残留，即，如果有蓝色产生表示样品中没有农药残留，如果呈现浅蓝色或白色则表示样品中含有农药残留。
卫生部食品卫生监督检验所等7家单位的实验与验证数据的统计结果表明（朱赫等，2014），速测卡法（纸片法）对常用农药的检出限为0.3～3.5mg/kg（王林等，2003），均高出国家标准农药残留限量，因此在使用速测卡检验蔬菜样品为阳性时，即可视为有机磷或氨基甲酸酯类农药已超标。该方法检出时间为15～30min，对超出国家标准允许残留量或违禁使用的有机磷和氨基甲酸酯类农药的有效检出率可达80％以上。该方法不需仪器，操作简便，检测速度快，成本低，特别适用于现场对大批量样品的筛查。国内企业利用该法原理生产的商品化速测卡和农药残留速测箱都属于速测卡法。
速测卡法既能直接进行测定，也能配合专用仪器使用。直接测定是利用体温加热药片，无需专用仪器。配合配套仪器使用，一次性可以同时测定9～12个样品，由于仪器保证了温度的要求，测定结果更准确。现国内蔬菜生产基地、各大果蔬批发市场、超市都已将果蔬农药残留快速检测卡（配套仪器）作为农药残留现场检测筛查的工具。
当前对于纸片法的研究，主要集中在酶的固定化、酶的载体以及显色剂的选择等方面，以期通过对这些因素的研究来生产出实用、性能好的酶片。
（1）固定化酶 许娟等（2008）通过对酶用量、戊二醛浓度、牛血清蛋白浓度、固定化pH值和温度的参数进行优化，建立了NC膜固定化植物酯酶的方法。Wei等（2005）以戊二醛为交联剂、牛血清蛋白（BSA）为保护剂，将乙酰胆碱酯酶（AChE）交联固定到商品载体上，制备固定化酶。
（2）显色剂的选择 刘海霞等（2003）和刘文君等（2007）通过两种不同显色剂（2，6-二氯靛酚乙酸酯和固蓝B盐）的显色原理及性能对比实验，证实了采用2，6-二氯靛酚乙酸酯既兼顾了底物和显色剂双重作用，又具有底物稳定性好、灵敏、简便实用的特点。
2.3.3 酶抑制分光光度法（比色法）
酶抑制分光光度法的原理与农药速测卡法的原理相同，区别仅在于后者是在试纸上反应，而前者是在溶液中反应。将待测样品提取液与敏感生物中提取的胆碱酯酶作用，以乙酰胆碱的类似物碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱等为底物，以5，5′-二硫代-2，2′二硝基苯甲酸（DTNB）等为显色剂，胆碱酯酶催化底物水解，水解产物与显色剂反应，产生有色物质，用分光光度计在特定波长下比色，根据吸光度随时间的变化，计算农药对胆碱酯酶的抑制率或直接利用吸光度，判断样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量是否超标（黄文风等，2000；张春霞等，2010）。
该法所用的酶可以是来自动物的胆碱酯酶［包括乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）］，也可以是植物酯酶。GB/T 5009.199—2003推荐使用AChE，NY/T 448—2001推荐使用BChE，GB/T 18630—2002推荐使用小麦酯酶。因所用的酶不同，底物和显色剂也有所不同，表2-1列出了国家标准和行业标准各自的推荐用酶、所用底物、显色剂以及检测波长的比较。
表2-1 酶抑制比色法国家标准和行业标准的比较
相比于速测卡法，比色法具有更高的灵敏度，检出限一般在0.05～5.00mg/kg，检出时间为30min，对超出国家标准允许残留量或违禁使用的有机磷和氨基甲酸酯类农药的有效检出率可达80％以上。国内企业按GB/T 5009.199—2003或NY/T 448—2001对分光光度计进行了改装，使之适合比色法检测要求。目前，常用国产农药残留速测仪均为多通道光路设计，可同时检测多个样品，直接显示检测结果，还带有数据接口，通过数据管理软件上传检测数据，实现数据共享和网上传输，自动化程度较高，是目前各省市和县区质检监督部门日常检测的主要速测仪器。
但是比色法也存在一定的缺点，比如所用的胆碱酯酶易失活，检测时需要控制的条件较多，易受温度影响等；且该方法仅限于实验室检测，并不适合现场的快速检测。
该领域的研究方向主要集中在优化酶促反应的条件，选择合适的显色剂、底物以及如何消除检测样品中叶绿体等的干扰等。
（1）酶反应最佳条件 酶是一种生物催化剂，其反应速度受反应温度和时间、pH值、酶和底物的浓度、环境中离子、酶抑制剂等因素的影响（杜美红等，2010）。
李顺等（2007）研究了抑制时间、抑制温度、底物加入量和酶液加入量4个因素对检测条件的影响，通过正交试验和极差分析，得出4因素的主次关系为抑制时间>底物量>酶液量>温度，确定了蔬菜中有机磷农药残留的最佳检测条件为：抑制时间15min，抑制温度35℃，底物加入量100μL，酶液加入量100μL。
王文祥等（2006）研究了磷酸缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物、酶用量对兔血清AChE活力测定的影响，结果表明，供试AChE的最佳活力条件是：磷酸缓冲液（pH8.0）3.0mL，0.6％二硫双对硝基苯甲酸显色剂50μL，0.75％酶液（pH8.0）100μL，反应温度35℃。混匀稳定后加入1％碘化硫代乙酰胆碱底物50μL，反应180s后在波长412nm处测定吸光度。在上述条件下，有机磷杀虫剂丙硫磷浓度0.0125～0.4g/mL范围内，温育时间5～30min，与AChE抑制率之间存在良好的相关性。
杨东鹏等（2004）提出了新的最适条件确定标准，即保证酶的活性保持在一定水平的基础上（0.1333min-1≤k1≤2667min-1），选择抑制率（以甲胺磷为抑制剂）最高时的温度和pH值作为最适条件。为此，确定了抑制时间为10min时的最适条件为：抑制温度47.0℃，pH7.7。进而在此最适条件下确定了新的检测结果判断标准：当酶抑制率≥58％时，蔬菜中含有某种有机磷或氨基甲酸酯类农药残留为阳性。
裘正军等（2007）通过单因素对比试验研究了吸光度随反应时间的变化关系、温度对酶活性的影响及农药残留浓度与酶抑制率的关系，结果表明，吸光度随反应时间逐渐增加，反应前期增速快，线性度好，适合测量；酶在20～40℃时具有最佳的活性，灵敏度高；农药残留对酶的抑制作用明显，当抑制率高于70％时可判定农药残留超标。
（2）酶抑制所用底物 酶抑制剂显色反应可使用的底物和显色剂很多，不同的酶与底物配合使用，其检测限不尽相同。
侯学文等（2003）利用胆碱酯酶水解碘化酰胆碱后形成的硫代胆碱，与二硫双对硝基苯甲酸发生化学反应生成黄色产物，在波长412nm下测定，研究了酶和底物的添加量、保温温度和保温时间对酶活力的影响，以及不同浓度与保温时间的辛硫磷对胆碱酯酶活力的抑制情况，获得了胆碱酯酶优化的反应条件。
宛梅丹等（2007）建立的乙酸靛酚酯-丁酰胆碱酯酶反应体系比传统的胆碱酯酶-碘化硫代乙酰胆碱法测定步骤更简便，保温所需时间更短。
刘畅等（2009）以二次盐析后的鸭血清丁酰胆碱酯酶（BChE）为农药残留的检测用酶，碘化硫代丁酰胆碱（BTChI）为底物，5，5′-二硫代-二硝基苯甲酸（DTNB）为显色剂，410nm下比色测定吸光度变化，计算胆碱酯酶的抑制率，从而推算农药残留情况。当抑制率大于35％时，表明农药含量超标。检测过程只需20～40min，并可同时检测多个样品。
（3）消除基质干扰 除了有机磷和氨基甲酸酯类物质对酶产生抑制作用外，食用植物中某些成分如氯代烟碱类似物质对ChE也有抑制作用，因此检测过程可能出现假阳性。此外，一些农产品含有大量的叶绿素或其他色素，易对显色造成干扰。
桑园园等（2009）选用实际检测中易出现假阳性现象的韭菜、蒜苗、蒜黄、大蒜4种蔬菜为材料，利用酶抑制法检测农药残留，并对样品前处理步骤进行改进，增加了对样品提取液加热处理，达到消除假阳性的目的。结果表明，对样品提取液进行适当加热可以起到消除假阳性的作用，且不会造成残留农药的损失。蒜苗、蒜黄、大蒜、洋葱的最佳处理温度分别为110℃、100℃、120℃、80℃，在达到相应最佳消除温度后，假阳性影响消失，且加热时间对假阳性影响不显著。
钟树明等（2002）应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的有机磷及氨基甲酸酯类农药。用小柱对样品进行预处理，可去除叶绿素的干扰，提高检测灵敏度。
2.3.4 酶抑制传感器
20世纪80年代以来，国际上农药残留分析新技术的研究非常活跃，不断有新方法、新技术涌现，生物传感器（biosensor）法就是其中的一种。生物传感器是由生物敏感部件与信号转换器紧密配合，从而实现检测目标化合物的分析装置。其基本原理是：传感器中生物敏感部件与待测样品中的目标物发生特异性识别，发生生物化学反应，产生一些物理或化学信号（如热、光、声音、颜色、pH、电化学）的变化，这些不同的变化通过不同原理的信号转换器（如热学热敏原件、光极光敏电阻、声学压电晶体、离子选择电极等）的转换，变成可以定量处理的电信号、光信号等，放大后显示或记录，就可对目标物进行定性和定量检测（Kumar等，2006；杨靓等，2012；刘永杰等，2004；杨海等，2005）。根据生物传感器中生物敏感物质的不同可分为酶生物传感器、免疫生物传感器和微生物传感器等。其中的酶生物传感器法是当前农药残留速测技术中的研究热点之一。酶生物传感器具有体积小、灵敏度高、选择性强、响应快、可实现连续检测及在线分析等优点。
（1）酶生物传感器的种类 酶生物传感器是以酶为识别元件的一种传感器，所采用的酶有抑制型的胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶）和直接水解的有机磷农药水解酶，其中被研究较多的是胆碱酯酶传感器。
①胆碱酯酶生物传感器 该生物传感器的原理是基于有机磷和氨基甲酸酯类农药对ChE的抑制作用，实现对农药残留量的检测。
根据所用分子识别元件的敏感材料的数量，胆碱酯酶生物传感器有单酶、双酶和三酶3种类型；根据信号转换的原理不同，酶生物传感器总体上又可分为电位式、电流式、光学式等3种类型（金盛烨，2004；朱赫等，2014）。其中，以电流式单酶传感器研究为最多，其基本原理是将ChE固定在载体上，样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药对固定化酶膜上酶的活性产生抑制作用，使酶对底物水解反应的速率和程度发生改变，电流频率随之发生变化，通过测定电流频率判断ChE被抑制的程度，从而对农药残留进行检测。
韩恩等（2014）利用海藻酸钠将乙酰胆碱酯酶包埋固定在玻碳电极表面，以氯化硫代乙酰胆碱ATCl为底物，当溶液中存在一定浓度的久效磷农药时，由于乙酰胆碱酯酶的活性受到抑制，从而导致传感器对ATCl的响应电流减小。根据该生物传感器响应电流的变化与农药浓度的关系实现对久效磷农药的快速检测。在优化的试验条件下，该传感器对久效磷农药的线性检测范围为4.5～98.0ng/mL，检测限为2.0ng/m L。伍周玲等人（2014）以双醛纤维素（dialdehyde cellulose，DAC）为固载酶基质材料，通过固定化酶化学键联技术制备固定化乙酰胆碱酯酶（DAC-AChE），采用自组装法制备多层壳聚糖/固定化乙酰胆碱酯酶/功能化碳纳米管生物传感器（Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE），利用交流阻抗法、循环伏安法及差分脉冲伏安法考察新型传感器对农残的检测性能。结果显示，新型传感器对氨基甲酸酯杀虫剂1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯具有良好的响应，检测方法响应快速，线性范围宽，灵敏度高，最低检出限可达3.5μg/L。
Mionetto等（1992）将ChE与胆碱氧化酶（ChOx）耦合构建了电流式双酶生物传感器，对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测限可达到3×10-11g/mL。Andreescu等（2002）将AChE与酪氨酸酶耦合，使用丝网印刷电极的电化学双酶生物传感器对毒死蜱和对氧磷的检测限分别为5.2×10-9g/mL和0.56×10-9g/mL。干宁等（2008）将乙酸胆碱酯酶（AChE）及胆碱氧化酶（ChOx）固定于组装在丝网印刷电极表面的Fe3O4/Au纳米复合微粒上，构建了双酶传感器（AChE-ChOx/Fe3O4/Au SPCEs），该双酶传感器电流响应在乙酸胆碱浓度为0.5～12.5mmol/L之间呈良好线性关系（R2=0.998），其对克百威和敌敌畏的检测范围在0～1.00μg/mL之间均呈良好线性关系（R2=0.977），检测限均可达0.01μg/mL，应用于实际样品白菜的添加回收率在95％～110％之间。
Karousos等（2002）则将过氧化物酶添加到AChE与酪氨酸酶耦合的双酶系统中制成三酶生物传感器，使用石英晶体微天平（QCM）可以检测浓度低于1×10-9g/mL的西维因和敌敌畏。
由于有机磷类农药能够抑制抗坏血酸氧化酶的活性，Rekha等（2000）采用基于抗坏血酸氧化酶的安培型生物传感器检测乙基对氧磷，抗坏血酸的最佳底物浓度为5.67mmol/L，在1～10mg/L范围内酶底物反应的抑制率与乙基对氧磷的浓度呈线性关系，相关系数达到0.9942。
②有机磷水解酶生物传感器 有机磷水解酶生物传感器的研究在深度和广度上仅次于胆碱酯酶生物传感器。通常，有机磷水解酶（OPH）能催化有机磷农药中P—O、P—S和P—CN键水解生成酸和醇，这些水解产物通常是电活性或光活性物质，可以被转换成可测量的电或光信号，实现对有机磷农药浓度的测定，这是有机磷水解酶生物传感器的检测原理。已开发出用OPH制成的电位（Mulchandani等，1999）、电流（Chough等，2002）、光学（Russel等，1999）等多种类型有机磷水解酶生物传感器。然而，与胆碱酯酶生物传感器相比，有机磷水解酶生物传感器灵敏度较低即检出限较高；而且，有机磷水解酶生物传感器只能检测部分有机磷化合物。目前OPH尚未商品化，主要原因是OPH在天然菌株中含量太低，难以大量生产，生产成本高昂，这是导致有机磷水解酶生物传感器研发较晚和进展较慢的重要原因。
（2）酶生物传感器的研究内容 目前国内外在酶生物传感器方面的研究内容主要有酶的选择、酶的固定化方法、电极材料的选择及改良等。
①酶的选择 目前用于生物传感器的乙酰胆碱酯酶主要是从果蝇和电鳗中获得的，也有利用鸡和鲤鱼提取的乙酸胆碱酯酶进行农药残留检测的实验研究。Tan等（2011）从家蝇中获取AChE基因，采用定点突变的方法获取A262G、Y327F、Y327D、I374D突变基因，利用毕赤酵母进行表达，结果显示这些突变体可以改善催化剂的活性并提高对杀虫剂的敏感性，三重突变体GDD（A262G/Y327D/I374D）对灭多威、呋喃丹、毒死蜱、甲基对硫磷的敏感性均有显著的提高。
②酶的固定化方法 酶生物传感器技术的关键是酶的固定技术，主要包括酶的固定方法和固定酶的载体材料的选择。酶的固定化是指以一定的固体材料为载体将其包埋起来，使酶仍具有催化活性并可回收及重复使用的方法。酶的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价法、交联法等，近些年来也出现一些新的固定化技术如定向固定（即将酶的特定位点连在载体上，使酶按一定的方向排列在载体表面）、多酶共固等。
刘鹂等（2006）以戊二醛为交联剂将丁酰胆碱酯酶交联固定在ISFET电极的敏感栅极上来测定敌敌畏农药，最小检出限可以达到10-7mol/L。
王金梅等（2004）以海藻酸钠为载体包埋固定乙酰胆碱酯酶，考察了影响酶固定化的重要因素，获得了最佳固定化条件，制备的凝胶酶珠机械强度高，活力重现性好；在20g/L氯化钙溶液中3℃下保存40d，活力基本不变。周祖新等（2007）以尼龙网为载体，分别用硫酸二甲酯和三乙基四氟化硼作烷基化试剂使尼龙网活化，利用共价键法将乙酰胆碱酯酶固定化，获得了较好的固定化效果，酶膜活性分别达到4.2U/cm2和11.1U/cm2，固定化效率分别达到24.2％和64.1％，重现性好，稳定性好，5个月后活性无明显下降。
③电极材料的选择及改良 乙酰胆碱酯酶传感器的关键在于生物膜电极的制备。生物膜电极由敏感膜和电化学转换器两部分构成。随着COPC、TCNQ、亚甲基蓝、普鲁士蓝等各种电子传递媒介的引入，生物传感器法测定的灵敏度越来越高。另外，纳米修饰电极，例如纳米金、纳米线、碳纳米管、Cds-石墨纳米复合材料等，为生物传感器提供了更具潜力的性能。通过使用人工神经网络（ANN）的传感器输出的数据分析与化学计量学的结合，可以分辨出农药种类并计算出浓度。
生物传感器灵敏度高、简便、快速，检测样品既不需要预处理，也不需要额外的试剂，样品用量少，响应快，并可反复使用，可以进行连续在线检测，容易实现自动化测量等。但是生物传感器在检测过程中的稳定性、重现性和使用寿命等方面存在问题，并且当前胆碱酯酶等生物材料在固定化过程中容易失活等问题还没有得到很好的解决，这些因素影响了该技术的推广使用。