1.2　分子生物学在油藏微生物多样性研究中的应用

MEOR技术从所用的微生物来看，包括激活油层内源微生物群落和注入在地下起作用的外源微生物两种方法。较外源微生物采油技术相比，内源微生物采油技术省去菌种开发与评价、菌液发酵等繁琐过程，具有适应性广、成本低的优势，是一项潜力巨大的微生物提高采收率技术。进行内源微生物采油，最关键的工作是深入调查分析地层中微生物群落以及限制微生物活跃增殖的环境因素。但目前，因为油藏中大量的贫营养微生物（uncultured microbes）和不依赖培养微生物（cultured independent microbes）在实验室纯培养的富营养培养基中不宜生长；同时，传统技术在培养过程中都不可避免地将微生物置于偏离它们原来的小环境的新的人为操纵的条件下，从而会改变有关微生物群落原来的结构，微生物有机体有可能会偏离原来自然种群的生理习性，甚至有可能偏离它们原来的基因型组合。因此，任何利用传统微生物技术来正确认识微生物生态系统的尝试都会面临障碍，也埋没了大量有实用价值的微生物资源（未培养微生物约占99%），最终导致油藏微生物多样性及生态学研究一直落后于其他群落微生物的研究水平。

另一方面，随着环境的日益恶化和人们环保意识的不断加强，石油污染问题的严重性已经引起了人们的极大关注。环境中的石油污染危害表现在土壤中石油的沉积对植物根系的损害造成植物的死亡，石油的某些有害成分在粮食中形成积累，并进入食物链；同时污染地下水体，危及人类健康；海洋中的石油污染使藻类的光合作用受到严重影响，使其产氧量减少。可喜的是，对微生物修复研究的不断深入，为石油污染的治理提供了新的方法，作为传统的化学处理方法的延伸，直接利用土著微生物菌群可以处理石油污染物，但在许多条件下，由于土著微生物菌群的生长受到限制，因而向环境中提供营养物质激活降解微生物或筛选一些降解污染物的高效菌种强化降解作用，是生物修复的必然要求。因此，对石油污染环境进行生物检测，探索微生物生态与石油污染环境之间的相互关系，并从其中分离高效菌株成为环境微生物技术亟待解决的问题。

近年来，基因组学和现代分子技术的成熟逐渐渗透到有关生命科学的整个领域，也为微生物生态学提供了新的研究方法和机遇。自1985年Pace等以核酸测序技术研究微生物的生态和进化问题以来，对微生物的多样性研究进入了一个崭新的阶段，并逐步发展形成了成型的分子微生物生态学（molecular ecological technology of microorganisms）方法和技术。国际上大量的研究和开发实践证明，微生物分子生态学方法不受微生物是否可以分离培养的限制、不受微生物在实验室中是否活泼的限制，可以快速、准确、全面和真实地分析复杂的微生物群落结构。因此，分子生态学方法的发展为研究石油微生物群落提供了一个新的工具。

1.2.1　微生物分子生态学技术及其在石油微生物研究中的应用

目前微生物分子生态学研究的焦点集中在具有保守序列的16S rRNA上，研究方法包括16S rRNA序列分析、核酸探针杂交法、PCR法、DGGE法、TGGE法、RFLP法等（表1-2）。以下分别介绍几类当前主要的分子生物学研究方法及其在石油微生物生物多样性研究中的应用。

（1）16S rRNA序列分析

16S rRNA序列测定与分析方法对不同细菌的16S rRNA序列进行同源性比较分析是推断细菌的系统发育及进化关系的一个重要方法。基本原理就是从微生物样本中的16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，从序列差异计算它们之间的进化距离，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。Gerrit Voordouw等人通过16S rRNA基因扩增克隆测序研究了加拿大北部油田微生物群落的多样性，检测到多种革兰氏阴性的SRB和许多有限数量的厌氧菌、发酵菌或产乙酸菌。Yah Takahata等人对日本新潟县Kubiki 油藏内的超嗜热菌（hyperthermophiles）及其生化性质进行研究，通过16S rRNA序列分析，发现其中的超嗜热菌主要是由热球菌属（Thermococcus）和栖热袍菌属（Thermotoga），进一步研究发现，超嗜热的球菌和杆菌能通过增强自身的抗饥饿能力和抗变温能力在地下油藏内生活，说明它们在地下会有很大的分布。

（2）核酸探针杂交技术

核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术。核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。探针可以是长探针（100～1000bp），也可以是短的寡核苷酸（10～50bp）；杂交方式可以是全细胞杂交（whole-cell hybridization）、数量印迹杂交（quantitative dot blot）、原位杂交（in situ hybridization）及生物芯片（biochip）。

（3）聚合酶链式反应法（PCR）

目前依靠在PCR试验中使用具有类群特异性的引物，不进行酶切、变性、克隆和电泳等后续手段，也能够用来鉴别特定微生物类群的存在。竞争性PCR（competitive PCR）是其中较为常用的方法，具体操作是在同一反应条件下，同一试管内同步扩增一段靶序列和另一段内参序列，作为竞争模板的内参序列与靶序列使用相同的引物，并以相同效率扩增。扩增后，当二者的终浓度相同时，理论上其模板浓度也应相同。将待测标本与10倍系列稀释的竞争模板混合，扩增后分别用各自的荧光探针杂交，当混合标本中目的基因和内参序列信号值相同时，待测标本浓度即为该份混合物中竞争模板的稀释浓度。Kazuya Watanable等人使用8对通用古生菌引物对地下储油罐中排出的地下污水中的古菌进行16S rRNA序列分析，将其分为5个基因型，分别是KuA1、KuA6、KuA12、KuA16和KuA22，通过竞争性PCR的进一步研究发现在所有古菌拷贝中，KuA12含量最丰富，达到50%。

（4）基于PCR的基因指纹图谱技术

环境样品中的微生物DNA提取物必然是不同微生物的DNA混合物，被称为宏基因组（metagenom）。将宏基因组经PCR扩增，其产物是序列等长但不同源DNA片段的混合物。混合物中序列的多样性和不同序列的丰富度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。如果可以将这些序列等长但不同源DNA片段分离开，则可对样品中微生物群落的组成进行初步的分析。经过多年研究，现在已经有多种DNA指纹技术，如变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段长度多态性分析（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）。其中DGGE、TGGE和RFLP在石油微生物研究中使用较为广泛，下面将着重加以介绍。

a.变性梯度凝胶电泳（DGGE）

DGGE技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，可以检测到一个核苷酸水平的差异。Röling等对被石油污染的海岸进行模拟研究，分析营养物质的投放及投放方式对微生物群落降解石油的影响。他们利用DGGE对微生物群落结构的变化进行表征，结果显示，与没有营养物质的投放相比，固体营养物质的投放能够使石油降解速度加快，使微生物群落结构的变化加快，而液体营养物质的效果要更加明显，并发现营养物质的投放会使具有相同结构的微生物种群产生不同的降解速率。

b.温度梯度凝胶电泳（TGGE）

TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCR产物及目的片段。但TGGE与DGGE相比，梯度形成更加便捷，重现性更强。Pu-Yi Cheung等人对石油污染土壤微生物降解多环芳烃（PAH）进行研究，他们使用分枝杆菌（Mycobacterium）的特异性引物对环境样品进行扩增，对产物进行TGGE分离，TGGE图谱显示，重度污染土壤中微生物群落的多样性低于轻度污染的土壤中微生物群落。

c.限制性片段长度多态性分析（RFLP）

1980年，Botsein提出DNA限制性片段长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记。RFLP最初比较简单，但是当时该技术需要依赖southern blot技术，克隆基因作探针，工作量很大；而且DNA用量较大（5～10μg），纯度要求高。为克服RFLP技术的缺点，学者们将PCR应用于RFLP分析，发明了PCR-RFLP技术。PCR-RFLP法是将PCR引物中的一条加以荧光标记，反应后用合适的限制酶切、电泳分析，再根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同分析群落的结构及组成多样性，或检测因环境改变引起的微生物群落的变化。因此，现在很多研究人员利用PCR-RFLP来研究环境微生物的多样性。Orphan等人对美国加利福尼亚州高温富硫油藏内的嗜热微生物群落进行研究。他们分别用细菌通用引物和古生菌引物对环境DNA样品进行PCR扩增，建立了细菌克隆文库和古生菌克隆文库，然后利用RFLP对克隆文库分别进行分析，通过结果分析发现硫降解菌、产甲烷菌在油藏内部具有广泛的分布，并且对C、H、S的地球生物化学循环有重要作用。

d.末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）

T-RFLP又被称为16S rRNA基因的末端限制性片段（terminal restriction fragment，TRF）分析技术，是一种最近才出现的研究微生物多态性的分子生物学技术。相对于其他的分子生物学手段，T-RFLP技术具有三个明显的优势：①序列数据库具有直接参考意义，即从消化产物中获得的所有的末端片段大小，可以与序列数据库中的末端片段相对比，从而可以做系统发育的推断；②核酸测序技术要比DGGE或者SSCP所依赖的电泳系统获得的结果更为可靠；③T-RFLP的毛细管凝胶电泳分析更为快速，而且结果是以数据的形式输出。T-RFLP技术的这三个明显的优势必然使其成为一种理想的群落对比分析的方法。因此，T-RFLP已经越来越受到相关研究人员重视。Wen Tso Liu等人利用T-RFLP法分析了活性污泥、生物反应器内污泥、含沙水层中微生物种群的多样性，是最早利用T-RFLP技术进行微生物群落对比分析的研究之一。因此，我们可以考虑将这门新出现的分子生物学技术应用到对石油微生物群落结构的检测中，建立环境中各优势菌群的峰值图谱，可在短时间内确定石油微生物种群的丰度及均匀度等各特征值，为快速检测石油微生态系统的变化提供可靠的检测标准。

1.2.2　变性梯度凝胶电泳DGGE的原理和应用

变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

1.2.2.1　原理

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域（meltingdomain，MD）和解链行为（melting behavior）。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图1-1）。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而使双链DNA完全解链。图1-1显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA片段共有3个解链区域。MD1是解链温度最低的一个解链区域，MD3是温度最高的一个解链区域。

不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行DGGE时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。

然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30～50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中每个碱基处的序列差异基本上都能被区分开。

当用DGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR扩增技术，用PCR扩增的16S rRNA产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16S rRNA基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE分析。

DGGE有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向与电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的PCR扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范围。垂直电泳时，胶从左到右是变性剂梯度或温度梯度。在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA一进入胶立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于DNA片段最低的解链区域时，DNA的迁移速率有急剧的变化。因此，DNA片段在垂直胶中染色后呈S形的曲线。根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品。

通过各种染色方法可以看到DGGE胶中的DNA条带。最常用的几种染色方法是溴化乙啶（EB），SYBR Green Ⅰ，SYBR Gold和银染法。EB法染色的灵敏度最低。SYBR Green Ⅰ和SYBR Gold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它们的检测灵敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色时，双链DNA能很好地显色，单链DNA基本上不能显色。银染法的灵敏度最高，它不但能染双链DNA，也能染单链DNA，但它的缺点是不能用于随后的杂交分析。

1.2.2.2　PCR-DGGE在微生物生态学中的应用

PCR-DGGE技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析微生物群落结构组成。Muyzer等人于1993年首次将该技术用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性。此后，该技术被广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤、活性污泥、人体和动物肠道、温泉、植物根系、海洋、淡水湖、油藏等。绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的16S rRNA基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也有用真菌的通用引物扩增18S rRNA基因，从而研究真菌的群落多样性。

除了通过核糖体RNA基因来分析微生物群落结构外，还可以通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。氨单加氧酶（ammonia monooxygenase gene，amoA）基因被用来研究氨氧化菌群；氢化酶基因被用来研究硫酸盐还原菌群；多组分苯酚羟化酶大亚基基因（the largest subunit of the multi-component phenol hydroxylase，LmPH）被用来研究降酚菌群。PCR-DGGE技术的另一大优点是能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。

除了上述两个主要用途外，PCR-DGGE技术还有很多其他用途。它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响；可以检测单个纯菌rRNA基因的微异质性；可以用来比较不同的DNA提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆文库以及检测PCR和克隆过程中的偏差。

1.2.2.3　DGGE技术的缺陷及优化

在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体RNA拷贝数不同；提取基因组总DNA时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化时有偏差；PCR扩增过程中有偏差。除了这些，在应用DGGE技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷。DGGE一般只能分析500个碱基对以下的DNA片段，因此得到的系统进化相关的信息就很少。

（1）在研究复杂环境生态系统（如土壤、人体肠道）时，涉及的微生物种类很多。但DGGE图谱中一般只有一二十个条带，这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在总的微生物群落中占1%以上的种群才能被检测出来，系统中的弱势菌群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度，一种方法是先根据GC含量的不同，将基因组总DNA分成各个部分，再分别通过PCR-DGGE分析。另一个方法是使用类群特异性（group-specific）引物对基因组总DNA进行PCR扩增，再用于DGGE分析。

（2）在设计PCR引物去扩增某些特定菌群时，由于某些菌群的序列相互之间同源性不是很高，因此需要设计兼并性引物。此时，相同的微生物会有2个条带，这会对微生物群落结构组成造成高估。另外，同一个细菌也可以有多个核糖体RNA操纵单元，它们的序列可以有微小差异，这也会高估微生物群落多样性。

（3）DGGE的电泳条件不一样，即使相同的样品所得的图谱也会有差异。在应用DGGE时，如果所用电压太低，需要的电泳时间就很长，变性剂梯度会有变化，因此导致图谱也会有变动。

（4）DGGE的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究，得到它们的序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息。以前研究DGGE胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16S rRNA克隆文库，然后再对文库中的克隆进行扩增，通过将DGGE和原始样品的条带进行对比，能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列。然而，已有研究表明，不同的DNA条带在DGGE胶中可以迁移到相同的位置，因此单一DGGE条带可能含有不止一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会更多。

（5）研究DGGE胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收DNA，然后构建其克隆文库，再对其中的克隆进行测序。然而，PCR过程中产生的异源双链（heteroduplex）和单链DNA（single-stranded DNA）也会对分析单一条带序列造成偏差。

1.2.3　基于16S rRNA的分子生物学方法的组合

考虑到一般的分子生物学方法虽然各有优点，但又都有不足之处，在实际进行微生物群落生物多样性研究时，往往需要将两种以上的方法组合起来使用，这样可以有效地提高检测的精度，简化实验步骤，并且可以克服一些实验中存在的困难。在一般的克隆中，为了使回收的序列具有代表性，通常需要选取相当数量的单菌落进行序列回收。回收的序列最好全部进行测序，但限于测序费用，不可能将回收的全部序列测序，就需要先进行筛选，剔除重复序列，仅将代表性的、丰度较大的序列测序。序列筛选一般采用前面提到的DNA指纹技术，例如DGGE、RFLP、ARDRA等。Gisele Laguerre等人应用ARDRA技术对48株根瘤菌菌株进行了分析，所得的结果与其他分类学方法进行了比较。显示ARDRA法所得到的PCR-RFLP 16S rDNA的基因型与16S rDNA测序所得结果一致。所得数据反映的基因型关系与DNA-rRNA杂交及16S rRNA测序结果相符合，并对未知根瘤菌进行了有效的区分和归类。Lisa Øvreås等人将ARDRA、寡核苷酸探针杂交、REP-PCR、DGGE等方法结合起来对两个微生物生态系统的可培养细菌和细菌总量的多样性，以及微生物群落结构进行了分析和比较。这些实验结果显示将多种分子生物学方法结合可以获得相比于单个方法更广泛的微生物群落信息。

另外，John Dunbar等人认为对克隆基因文库进行RFLP法或测序法分析能够提供关于微生物群落多样性的最详细、最可靠的信息。柳承璋等则认为，克隆+克隆文库分析试验方案的精确度不适于用来做群落结构空间和时间尺度上定量的生态学研究，但若将克隆+克隆文库分析法与T-RFLP结合使用，则可以取长补短，因为T-RFLP可以提供微生物的种类和相对数量的信息，尽管还是无法确定是何种微生物，定性信息不足，但将其与16S rRNA克隆文库分析或者核酸杂交分析结合，即可确定微生物的种类，获得最优化的信息。JoséM González等人对赤潮海域的细菌做了16S rDNA克隆文库测序和T-RFLP分析，对其中的优势菌群进行了分析。