1.4　高效液相色谱分离

1.4.1　方法及优化

由于直流电弧放电法合成的烟灰中，含有的富勒烯、金属富勒烯的种类繁多，因此，为了得到单一组分的富勒烯或金属富勒烯，必须对烟灰的提取液进行分离。最常用的分离方法是高效液相色谱技术（HPLC），利用富勒烯、金属富勒烯各个组分在色谱柱中的保留时间不一样的特点将各个组分分离开来。必要的时候，利用分离特性不同的两种或多种色谱柱进行分离。

（1）色谱柱

最常用的分离富勒烯、内嵌金属富勒烯的色谱柱是Buckyprep（BP）和Buckyclutcher（BC）。其中，富勒烯、内嵌金属富勒烯在Buckyprep色谱柱的分离特性如下：体积/分子量越大，保留时间越长；极性越大，保留时间越长；同样的分子量、同样极性的时候，球形的保留时间短。具体组分的保留时间是上面三个因素共同作用的结果，对保留时间的影响力依次降低。对于Buckyprep柱，在通常的操作条件下，提取溶液中主要组分的保留时间是10～60min，目标产物金属富勒烯在50～60min，因此，通常选这样的色谱柱对提取溶液进行第一步分离。对于Buckyclutcher 柱，富勒烯、内嵌金属富勒烯的分离特性如下：极性越大，保留时间越长；体积/分子量越大，保留时间越长；同样分子量、极性的时候，球形的保留时间短。上面三个因素中，第一个因素对保留时间起到绝对主导作用。对于Buckyclutcher柱，在通常的分离参数下，组分的保留时间在14～18min，也就是说各个组分的保留时间范围远远小于在Buckyprep中的范围，因此，这样的柱子不适宜分离样品中含有多个组分的体系。但是由于各个组分在这种柱子之中的保留时间比在Buckyprep柱中的短得多，所以利用这样的柱子进行循环分离时会有很高的工作效率。结合以上分析，在Y@C₈₂的分离中，先用Buckyprep柱进行初次分离（将空心富勒烯和内嵌金属富勒烯分开），后用Buckyclutcher 柱进行循环分离。

（2）进样量

尽管HPLC每次进样量可以到达20mL，但是根据经验，每次进样12mL时的综合分离效果最佳，因此将每次进样量控制为12mL。当然，根据分离阶段、样品浓度、分离要求的不同，可以适当改变进样量从而获得最佳分离方案。

（3）流速

当流速大时，完成一次进样分离时间会短；流速小时，完成一次进样的分离时间会变长。但是并不意味着流速大就有利于提高工作效率，因为流速太大的话，所有物质的保留时间都会相应地减小，组分之间的保留时间差也相应地减小，这不利于组分之间的分离；当流速太小时，当然工作效率太低。综合以上因素，在分离过程中，将流速设定为12mL/min。在这样的操作参数下，各个主要组分的保留时间见表1-1。

由表1-1可以看出，C₆₀、C₇₀是非常容易分离开的；C₇₆与C₇₈则有一些重叠，要完全分离开来，则要经过循环操作才行；对于C₈₄，由于它本身有多个异构体且含量也仅仅次于C₇₀，因此峰宽很大，要实现对C₈₄的各种异构体的分离，也需要通过循环分离的操作才能够实现；C₈₆的量比C₈₄少得多，如果用对金属富勒烯有选择性提取性能的DMF试剂的话，在色谱图上几乎看不见C₈₆；Y@C₈₂是目标产物，因此较详细地讨论。尽管Y@C₈₂的碳笼的原子数目小于C₈₄，但是由于内嵌了Y原子，分子量大于C₈₆，且这一分子有很强的极性。因此，其保留时间甚至比C₈₆的都长，而几乎与C₉₀的保留时间一样。

（4）样品收集

为了将Y@C₈₂与C₉₀分离开来，收集这一区间的组分，将其浓缩到适当的浓度作为下一级分离的样品。实验经验表明，尽管收集的目标产物的区间是含C₉₀和Y@C₈₂的，但经过质谱或HPLC测试都显示里面仍然含有少量的C₈₄，甚至C₆₀、C₇₀等空心富勒烯。为了减小这些空心富勒烯对下一级分离操作的干扰，需将浓缩的样品再次用Buckyprep柱进行分离，这次分离就能够非常有效地除去C₆₀、C₇₀、C₈₄等空心富勒烯，而所收集的区间就几乎只有C₉₀与Y@C₈₂了。

（5）循环分离

经过上一阶段的分离，收集的溶液中主要含C₉₀和金属富勒烯Y@C₈₂，因此本阶段的分离采用Buckyclutcher 柱。具体操作：将第一阶段分离得到的样品浓缩到适当的浓度作为进样；由于现在的总进样量远远少于第一阶段的进样量，分离的总时间也会远少于第一阶段所耗的时间，而实验的根本目的是得到高纯度的Y@C₈₂样品，因此，完全可以将进样量以及流动相的流速都设定小一些从而最大限度地发挥色谱柱的分离效能。实际的流速设定为9.0mL/min，进样量为8.0mL。在这些操作条件下，Y@C₈₂与C₉₀都大约在16min出现，此时两种物质没有任何分开的迹象，而且峰的强度很大。当看到色谱曲线（紫外吸收强度）开始较快地上升时，不要收集，点击“Recycle”继续进行循环分离，照此进行，待到第三个循环时，在Y@C₈₂主峰的前面出现较矮的平滑的峰或拐点（由于Y@C₈₂的极性比C₉₀的大，保留时间大于后者），此时将这一峰切除（也就是说将其收集而不进行进一步的循环），继续循环后面的主峰，同样切除前面的小拐点。待第五个循环时，切除主峰后面的拖尾部分，并再次循环。到第七个循环时就可收集到较高纯度的Y@C₈₂，估计此时的纯度可以达到99%。若要得到更高的纯度，将收集的样品浓缩之后再次用Buckyclutcher循环就可以得到纯度为99.5%的样品。图1-4是经过上述分离操作之后得到的样品的质谱图，图中插图是Y@C₈₂的同位素分布图，实验分布与理论分布完全一致。结果显示，得到的Y@C₈₂样品的纯度是非常高的。将分离得到的样品蒸干，加入二硫化碳低温保存。

需要指出的是，金属富勒烯的制备、提取以及分离操作是一个非常烦琐而耗时的工作，而且也没有一个通用的最优方案。因此，必须结合目标产物的特性，综合考虑各个环节耗费的时间以及分离效率来确定具体的操作方法。

由于金属Sc的内嵌富勒烯的种类比其他任何元素的都多，分离过程相当繁杂，而目标产物Sc₃C₂@C₈₀的含量又极低，分离困难。因此，我们同样利用多级分离方法实现对Sc₃C₂@C₈₀的分离。第一步：利用Buckyprep分离柱将大量的空心富勒烯C₆₀、C₇₀除去；第二步：利用Buckyprep分离柱将Sc@C₈₂以及一些与目标产物有较大保留时间差异的 Sc₂@C_2n （2n＝76～82）等分离开；第三步：利用Buckyclutcher 柱进行循环分离，除去与Sc₃C₂@C₈₀具有非常接近保留时间的C₉₀和Sc₂@C₈₄，从而得到高纯度的Sc₃C₂@C₈₀。图1-5是利用HPLC进行分离的最后一级色谱图。

从色谱图中可以看出，第一、二个峰的前部都有小尖峰，表明有杂质存在。在具体的操作中，从第二个循环时开始就将小峰去掉，只循环主峰。到第三个循环时，可以看出已经没有小峰出现，但此时并不意味着色谱柱里只有Sc₃C₂@C₈₀。从第三个循环开始，尽管没有看到其他小峰的出现，仍对主峰的前后都切除一点，到第七个循环时，发现峰形已接近标准的高斯分布曲线，停止切除，继续循环。直到第十个循环时仍然没有发现任何杂质峰的出现，到第十一个循环时进行收集。将收集的样品浓缩，装入试剂瓶之中，取少量进行质谱测试以确定分离样品的纯度，将剩余的样品浓缩并保存在二硫化碳中备用。

1.4.2　分离中的注意事项

① 在进行初次分离时，一定要收集各个流出时间段的样品并对它们进行质谱测试，比较准确地确定特定操作条件下的目标产物的保留时间以确保收集时收集的区域不是太宽，这样能够使得后续分离中的组分数目少而利于分离。

② 进行循环分离之前，一定要对Buckyclutcher色谱柱清洗2h以上，当然包含用蒸馏后的新甲苯溶剂作为进样的清洗。很多人容易忽略后一操作，实际上，后一操作能够清洗整个管路，而单纯的启动流动相是不能够清洗全部管路的。

③ 保证色谱仪工作时环境温度基本恒定且不要有快的空气流动。实验中发现，色谱曲线与分离时的周围环境有较大的联系，当有风或分离过程中前后温差太大时，曲线基线容易漂移，因而影响循环分离中切除操作的准确性。

1.4.3　质谱测试时的注意事项

① 一定要用正离子方法和负离子方法都测试。一般地，金属富勒烯比空心富勒烯更容易被氧化，而空心富勒烯是很容易被还原的。因此在质谱测试中，利用正离子方法时，金属富勒烯的响应是强烈的。如果此时的质谱图显示只有一个对应于金属富勒烯的分子离子峰，并不意味样品一定是高纯度的，因为很可能是空心富勒烯的信号没有显示出来。利用负离子方法，会有相反的问题。因此，只有当两种方法测试的结果显示只有目标分离物的分子离子峰时，才可以认为所分离得到的样品是高纯度的。

② 信号取值范围一定要大，一般取700～1400为宜。因为直流电弧放电法得到的最丰富的产物是C₆₀，其质谱信号位置是720, 当检测区域大于720时，就可能漏掉C₆₀的检测；而当检测信号区域只比目标信号大一点时，会检测不到可能存在的高分子量的金属富勒烯。