第一章　肿瘤免疫治疗技术及原理

第一节　肿瘤免疫治疗简介

一、肿瘤免疫治疗基础

1.肿瘤免疫治疗史概述

肿瘤免疫治疗开始于1891年，当时纽约外科医生William B.Coley（1862—1936）发现，细菌产物“科莱毒素”（Coley toxins）对肿瘤有疗效，他开发出了一种专治肿瘤的细菌疫苗，成功地使许多患者肿瘤缩小并治愈^［1］。经历了近一个半世纪的发展，现在肿瘤免疫治疗主要包括三类：肿瘤的主动特异性免疫治疗——肿瘤疫苗（包括肿瘤细胞疫苗、DC疫苗、肿瘤多肽疫苗、独特型疫苗和核酸疫苗）、过继性免疫治疗（包括淋巴因子活化的杀伤细胞LAK、肿瘤浸润淋巴细胞TIL、细胞因子诱导的杀伤细胞CIK、供者淋巴细胞输注DLI）和非特异性免疫调节剂。表1-1列举了肿瘤免疫研究中的一些大事件^［2］。

表1-1　肿瘤免疫研究中的大事件^［2］

1976年， IL-2的发现激发了人们对细胞免疫反应的广泛研究。1985年，发现使用IL-2后转移性黑色素瘤和肾癌出现持久性的消退。1992年，IL-2获准用于治疗转移性肾癌。1998年，IL-2获准用于治疗转移性黑色素瘤^［2］。2012年，耶鲁大学的Vincent T. DeVita和NIH的Steven A. Rosenberg联合在《新英格兰医学》杂志发表“癌症研究200年”^［3］。文中肯定了免疫调节剂、过继性免疫细胞治疗和基因工程修饰的免疫细胞在癌症治疗方面的临床效果，这为今后免疫疗法治疗肿瘤提供了有力的证据。2014年，耶鲁大学等机构的研究表明，接受免疫检验点PD-1单抗nivolumab治疗黑色素瘤后，出现了令人鼓舞的结果，1年生存率可达62%，2年生存率达43%^［4］。2014年，纪念斯隆-凯特琳癌症中心对16名成人难治性、复发性急性淋巴细胞白血病患者进行嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治疗后，患者的完全缓解率达88%，远高于补救性化疗的完全缓解率^［5］。

2.抗肿瘤免疫应答基本原理简介

（1）机体免疫系统组成　免疫系统分为天然免疫系统和获得性免疫系统两部分^［6］。天然免疫是免疫系统的第一道屏障，发生应答的时间非常快。参与天然免疫反应的细胞类型有粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞等。获得性免疫是一种特异性的免疫应答反应，与天然免疫相比，具有一定的优势。它能特异识别各种抗原，并对同种抗原具有记忆能力。获得性免疫和天然免疫之间没有明显的界限，两者相互关联。比如NK细胞和γδ T细胞同时兼具天然免疫和获得性免疫的特征（图1-1）。免疫系统诱发机体对外源病原体和内源异常细胞产生保护性免疫力非常重要。正常情况下，体内的某些免疫细胞能及时发现并杀伤体内经常出现的少量异常细胞。免疫细胞能够识别机体内产生的带有新抗原决定簇的突变细胞，并能及时清除这些突变细胞，进而阻止肿瘤的发生、发展。

图1-1　天然免疫系统（innate immune system）和获得性免疫系统（adaptive immune system）^［7］

天然免疫系统对外源物质提供了速发型应答，这一系统主要由大量的可溶性因子、蛋白质和一系列的细胞组成，包括粒细胞（granulocyte）、巨噬细胞（macrophage）、树突状细胞（dendritic cell）、肥大细胞（mast cell）和自然杀伤细胞（natural killer cell）等。获得性免疫应答由抗体、B细胞、CD4⁺/CD8⁺ T细胞组成。NK样T细胞和γδ T细胞同时具有天然和获得性免疫的特征

（2）抗肿瘤免疫应答机制　无论是天然固有免疫，还是获得性抗肿瘤免疫，都需要经历三个主要步骤^［7］，才能获得有效的抗肿瘤免疫应答反应（图1-2）。①免疫细胞识别、摄取、加工处理肿瘤抗原阶段。免疫应答启动阶段，专职抗原递呈细胞——树突状细胞（DC），必须首先获取肿瘤抗原。这些肿瘤抗原通过在原位被消化，或者被传递到其他组织等形式，成为治疗性疫苗的一部分。DC摄取抗原后被激活，通过对肿瘤抗原肽段的加工、处理等过程，通过MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子，将肿瘤抗原递呈到DC表面。②免疫细胞活化、增殖、分化、成熟阶段。在淋巴组织内，负载肿瘤抗原的DC刺激T细胞，产生特异性T细胞免疫应答，效应细胞以能发挥强烈细胞毒性作用的CD8⁺ T细胞为主。DC也可以刺激特异性抗体的产生，与NK（natural killer）细胞或者NK样T（natural killer T，NKT）细胞一起，共同参与抗肿瘤免疫应答。③免疫效应阶段。肿瘤特异性T细胞进入肿瘤组织，发挥抗肿瘤免疫杀伤效应功能，同时，Treg等免疫细胞也开始发挥免疫抑制调节作用^［7］。了解抗肿瘤免疫应答的三个主要过程，可以在三个方面进行抗肿瘤免疫治疗：促进和优化肿瘤抗原的递呈过程；促进T细胞的活化；改善肿瘤免疫抑制微环境。

图1-2　抗肿瘤免疫调节

肿瘤细胞释放的肿瘤相关抗原，被DC吞噬、加工、处理后，进入局部引流淋巴结内。在淋巴结内，根据DC所接受的成熟肿瘤抗原的类型，和DC表面分子与T细胞表面不同受体间的相互作用，产生不同的抗肿瘤免疫应答。T细胞表面CD28或者OX40分子，通过与DC表面CD80/86或者OX40L受体的相互作用，激活T细胞产生抗肿瘤免疫应答。若T细胞表面CTLA4与DC表面CD80/86结合，或者T细胞表面PD-1分子与DC表面PD-L1/PD-L2相互作用，则抑制T细胞的免疫活性，并且可能促进Treg细胞的产生。特异性肿瘤抗原刺激活化的T细胞（与B细胞和NK细胞一起），将从淋巴结进入到肿瘤周围。肿瘤细胞通过多种机制产生肿瘤免疫抑制微环境，抵抗效应T细胞的活性。这些免疫抑制形成的机制包括肿瘤细胞表面上调PD-L1/L2，肿瘤细胞释放PGE2、精氨酸酶（arginase）和IDO（indoleamine 2，3-dioxygenase）、VEGF（通过瘤内低氧环境激活），进而抑制T细胞进入肿瘤床和浸润到肿瘤组织中^［7］

（3）肿瘤免疫抑制微环境　1959年，Burnet和Thomas提出了“免疫监视（tumor immune surveillance）”假说^［8］，该假说认为免疫系统能够识别并清除恶性肿瘤，从而抑制了肿瘤的发生发展。尽管机体内具有一系列的免疫监视机制，但仍难以阻止肿瘤的发生和发展。少量肿瘤细胞不易引起机体应答，待肿瘤生长至一定程度，超越了机体免疫应答的能力，肿瘤细胞即得以逃逸。T细胞是肿瘤免疫监视过程中的一个重要成员，是抑制肿瘤微环境的关键因素。正常T细胞通过识别MHC-肿瘤相关抗原复合体来消除肿瘤细胞。由于肿瘤微环境的免疫抑制作用，肿瘤组织中T细胞的活性明显下降。通过检验点（CTLA-4和PD-1）抑制剂降低T细胞的活化阈值，或回输一定数量的活化T细胞对晚期黑色素瘤患者有明显的效果^［9］，提示解除肿瘤免疫抑制微环境能治疗肿瘤。

肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫应答的机制有许多。①可以通过下调其表面MHC-Ⅰ类分子的表达、表达PD-L1等信号分子^［7］，产生免疫抑制的微环境，进而抑制T细胞的杀伤活性。②肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌作用，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。肿瘤细胞也可以通过释放免疫抑制因子IDO（indoleamine 2，3-dioxygenase）、TGF-β和IL-10等，来阻止T细胞的免疫监视功能，进一步抑制抗肿瘤免疫应答。释放的免疫抑制因子TGF-β可诱导T细胞分化成为Treg，IL-10能促进M2巨噬细胞的分化。Treg对免疫反应有负向调节的作用。有研究表明，B细胞白血病和淋巴瘤患者体内Tregs水平增高，与B细胞恶性肿瘤的预后成负相关^［10］。髓源性抑制细胞MDSC（myeloid derived suppressor cell，MDSC），在肿瘤抑制的微环境中扮演着另一个重要的角色。肿瘤招募免疫抑制细胞，不仅抑制了免疫反应，而且通过释放促进血管生成的因子（VEGFA、FGFβ等）来诱导血管生成。MDSC能够直接抑制NK细胞的功能，并促进免疫抑制T细胞的数量。Tregs、MDSCs和M2巨噬细胞等一起，共同参与肿瘤免疫抑制的微环境、负向调节T细胞的功能，也是肿瘤细胞免疫逃逸的一个重要原因^［11］。③血管周细胞也是肿瘤微环境中的重要细胞成分，通常与肿瘤血管的结构相关。在肿瘤组织中，周细胞较少，会使肿瘤组织血管出现渗漏^［12］。Hamzah等^［13］的研究表明：RGS5作为主要的调控基因，影响着周细胞的成熟，进而出现不正常的血管形态。RGS5缺乏的小鼠中，肿瘤组织中的周细胞呈正常成熟形态，且肿瘤内血管与正常组织中血管的结构类似。

（4）免疫调控信号通路简介　免疫应答的精细调节是通过大量的配体、受体（包括协同刺激分子）的相互协调而实现的，它们负责扩大或者抑制初始的免疫应答。通常T细胞受体（TCR）会特异性地识别抗原递呈细胞（APC）递呈的MHC-多肽复合物，这些相互作用既可以发生在二级淋巴器官（此时幼稚T细胞第一次遇到抗原），也可以发生在淋巴结外^［14］。有两个独立的信号途径参与T细胞与APC细胞的相互调节作用。第一信号通过T细胞上的TCR识别APCs上肿瘤抗原-MHC复合物。第二信号独立于肿瘤抗原，通过共刺激分子传递。除了T细胞正向调控的共刺激分子，最近也发现了越来越多的T细胞负向调控的共刺激分子， T细胞的耐受或者功能可能由这些因子一起决定（图1-3）^［14］。

图1-3　在免疫突触中的共刺激和共抑制受体^［14］

B7RP1—B7-相关蛋白1；BTLA—B和T淋巴细胞减弱子；GAL9—半乳凝素9；HVEM—疱疹病毒进入调节子；ICOS—可诱导的T细胞共刺激信号；TIM3—T细胞膜蛋白3

①T细胞正向调控共刺激分子。正向共刺激信号主要是由表达在幼稚T细胞上的CD28受体来调节的，CD28会与B7.1（CD80）和B7.2（CD86）分子结合，后者表达于激活的APCs上。这种相互作用引起T细胞的增殖并促进T细胞的活化，同时也会产生多种细胞因子如IL-2等。小鼠实验显示，若CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞存在CD28或者其配体B7.1和B7.2分子的缺陷，将会严重削弱二者增殖和产生效应细胞因子的能力^［15］。除了CD28以外，ICOS也是CD28家族一个重要的共刺激分子，影响T细胞的激活和功能^［16］。ICOS表达在激活的T细胞上，与表达在B细胞、巨噬细胞、内皮细胞和非淋巴结组织上的配体B7RPL结合。在基因敲除小鼠的研究中发现，ICOS与CD28不同，仅影响T细胞一部分功能。ICOS在效应CD4⁺ T细胞中通过提高NFATc1的表达和下游c-maf的表达，调节IL-4的表达。ICOS还参与IL-21和IL-17表达的调节^［17］。最近的研究表明，ICOS也可调节Treg细胞IL-10的分泌^［14］。缺乏CD28或者ICOS共刺激信号，仅会导致免疫功能缺陷，但是观察不到绝对的CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞免疫耐受^［18］。没有CD28和ICOS共刺激激活的T细胞，会成为免疫耐受的T细胞，并且出现基因转录缺陷^［16］。T细胞免疫耐受不仅受正向共刺激分子缺乏的调节，同时也受负向共刺激分子的调节。

②T细胞负向调控共刺激分子。目前，已发现了多种负向共刺激因子，比如CTLA-4、PD-1、B7-S1和B7-H3等。CTLA-4仅在激活的T细胞上受到诱导表达。相对于CD28，CTLA-4是T细胞激活和增殖的负向调节因子。CTLA-4缺陷小鼠在新生期便可由于大量的T细胞激活和组织浸润，出现自发的自身免疫反应甚至死亡^［19］。封闭CTLA-4的表达，能抑制CD4⁺ T细胞的活性，但对于CD8⁺ T细胞则无作用。大量的研究已经提示CTLA-4通过调控Treg细胞的抑制功能，在诱导免疫耐受中发挥重要作用。封闭CTLA-4的表达或者与细胞疫苗结合、放射治疗、手术切除或者热疗等，会提高T细胞介导的免疫应答^［20］。ipilimumab，一种人源化的抗CTLA-4单克隆抗体，在治疗黑色素瘤的过程中，可明显提高患者的总体生存率，已经被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤等^［21］。PD-1是表达在激活的T细胞、B细胞、单核细胞和NKT细胞表面的另外一种抑制性受体，其配体是PD-L1 （B7-H1）和PD-L2 （B7-DC）^［22］。PD-L1在血液系统、胰岛、心脏、内皮、小肠和胰腺中表达上调。PD-L2的表达则相对局限，主要表达在DC和单核细胞上，可上调激活IFN-γ、GM-CSF和IL-4。在PD-1缺失的小鼠中可以观察到明显的自身免疫反应，提示PD-1在免疫耐受中发挥重要作用。PD-1缺陷会加速NODLtJ小鼠Ⅰ型糖尿病的发生，促进C57BL/6小鼠模型出现关节炎和狼疮性肾小球肾炎。PD-1、PD-L1信号通路通过抑制CD4⁺T细胞和CD8⁺ T细胞的增殖以及抑制IL-2的产生来发挥作用。PD-1配体，PD-L1和PD-L2在免疫耐受中的作用存在争议，最近的研究认为，PD-L1和PD-L2在体内能下调免疫应答反应，并且维持T细胞对抗原的免疫耐受^［23］。PD-L1已经被发现在多种肿瘤中表达，并且显示可以诱导肿瘤特异性T淋巴细胞的凋亡^［14］。在使用PD-1抑制剂治疗的临床Ⅰ期试验中，使用人单克隆抗体MDX-1106，已经显示可导致黑色素瘤、结肠癌和肺癌患者的肿瘤转归^［24］。

B7-H3属于B7/CD28共刺激分子超家族成员，表达在人类DCs上，可以刺激人类T细胞增殖和IFN-γ的产生^［25］。初期的研究提示B7-H3可作为正向共刺激分子促进T细胞活化，但后来的研究却给出了相反的结论，认为B7-H3可抑制CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的增殖并减少TCR信号激活引起的细胞因子分泌。虽然B7-H3表达于肿瘤细胞中，但其在抗肿瘤应答调节中的功能仍存在争议^{［14，26］}。B7-S1/B7x/B7-H4属于B7超家族，并且广泛表达在淋巴组织和非淋巴组织中。类似于B7-H3，B7-S1在激活的而不是幼稚的T细胞表面有一个受体^［27］。体外研究表明，B7-S1可以抑制CD4⁺T细胞和CD8⁺ T细胞的增殖、细胞周期、细胞因子和毒性T细胞的产生。在体内抑制B7-S1也会导致T细胞依赖的免疫应答的增强和EAE疾病的加重。与PD-L1相似，B7-S1在肿瘤中由TAMs表达。由巨噬细胞TAMs表达的B7-S1，可以抑制肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞的增殖和效应功能。在淋巴细胞缺乏的小鼠中阻抑B7-S1，能降低移植肿瘤细胞的生长^{［14，28］}。

随着人们对肿瘤抗原、肿瘤免疫应答和肿瘤免疫抑制微环境等机制的理解，抗肿瘤免疫治疗已逐渐成为可能。