2.1.1 溶栓酶研究进展
2.1.1.1 溶栓酶概述
1987年，从日本传统发酵食品纳豆中，日本学者须见洋行提取出一种具有溶栓性质的酶，将其命名为纳豆激酶。研究发现纳豆激酶是一种安全性好、作用迅速而且持久、成本低、注射与口服均有很好疗效的辅助溶栓新药。因此，纳豆激酶有希望开发为新型溶血栓药物，目前已经引起国内外医药界与食品界的广泛关注。
在我国豆豉是人们喜闻乐见的传统大豆发酵食品，历代医籍认为其具有消积化滞、开胃增食、驱风散寒等功效。不同地方有自己不同的豆豉制作方法，其中所含的微生物种类也不同。尤其是有一些传统地方特色产品，通过传统手工生产，微生物区系较多。90年代以来，我国科研工作者受日本学者的启发，从豆豉等原料中分离出了几株能产生溶栓酶的枯草杆菌。研究发现这类溶栓酶具有溶栓效果好、安全无毒等优点，在心脑血管疾病的防治等领域具有广阔的开发应用前景。
近几年，国内外许多科研工作者对溶栓酶产生菌的筛选与鉴定，溶栓酶的分离纯化方法，不同溶栓酶的生理生化特征，溶栓效果以及克隆表达等方面进行了研究。
2.1.1.2 溶栓酶的理化特性
近年来国内对豆豉溶栓酶进行了大量的研究，发现大部分溶栓酶为丝氨酸蛋白酶，少数溶栓酶为金属蛋白酶，还有少数溶栓酶同时有丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的活性。
目前通过广泛深入的研究，发现溶栓酶的分子量范围很广，分子量从18～45kDa不等。Liu等人从一株华根霉的代谢产物中分离到一种分子量为18kDa的溶栓酶。Kim等人从一株芽孢杆菌的代谢产物中分离到的一种分子量为29kDa的溶栓酶Subtilisin DJ-4。阎家麒从豆豉中分离到一种单链溶栓酶，运用SDS-PAGE凝胶电泳测得其分子量为31kDa。李江伟等人也从豆豉中分离到一种分子量为36kDa的溶栓酶。韩润林等人从豆豉中分离分子量为20、27、28、30kDa的一系列溶栓酶。Kim等人从发酵鱼制品中分离到一种分子量为41kDa的溶栓酶。Paik等从一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis KCK7）的代谢产物中分离到一种分子量为44kDa的溶栓酶。Lee等从芽孢杆菌Bacillus sp KDO 13的代谢产物中中分离到一种分子量为45kDa的溶栓酶。
人们对溶栓酶的耐高温及耐低温特性进行了研究，发现溶栓酶在高温下容易失活，在低温下具有较强的稳定性。Wang等人研究发现溶栓酶在45℃以下稳定性很强，酶活性没有损失，当温度升高到55℃，溶栓酶活力开始降低，当温度升高到65℃以上时，溶栓酶活力完全消失。将溶栓酶溶液在18℃反复冻融4次后，溶栓酶活性仍保持在93%以上。阎家麒等人对从豆豉中分离出来的一种分子量为31kDa的单链溶栓酶的稳定性进行了研究，发现其在40℃以下具有很好的稳定性，当温度升高到50℃，溶栓酶活性损失严重，当温度升高到60℃溶栓酶活性全部丧失。将溶栓酶溶液在-18℃反复冻融5次，溶栓酶活性仍保存95%以上。
人们对溶栓酶的酸碱稳定性及在离子存在时的稳定性进行了研究。Wang等人研究发现一种溶栓酶在pH值7.0～10.0范围内活性较稳定。研究了金属离子对这种溶栓酶活性的影响，结果表明一价金属离子Na+、K+及二价金属离子Ca2+、Mg2+、Cu2+、和Ba2+对溶栓酶的活性有抑制作用，Al3+、Zn2+可提高溶栓酶的活性。阎家麒等研究确定一种豆豉溶栓酶酶等电点为8.6，这种溶栓酶在pH值7.0～9.0的范围内稳定，而当pH值低于5.0时，溶栓酶很快失活。
2.1.1.3 溶栓酶的分离纯化
豆豉溶栓酶的是一种多肽或蛋白质。目前常用的提取方法主要有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析及高效液相色谱等方法。首先要从发酵液中提取出溶栓酶，主要是根据发酵液和溶栓酶的性质选择不同的提取方法。在分离纯化的过程中，必须考虑尽量减少溶栓酶活力的损失，尽量提高溶栓酶的收得率和纯度。这就要求纯化操作应尽量在低温下进行。
李江伟等人采用葡聚糖凝胶Sephadex G100柱层析及葡聚糖凝胶Sephadex G50柱层析等对溶栓酶进行纯化操作。
韩润林等人首先对枯草芽孢杆菌的发酵液进行离心除去菌体，然后向无菌上清液中加入0.2%的无水CaCl2沉淀，通过超滤进行脱盐，然后用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行柱层析，对层析出来的产物进行丙酮沉淀，并通过葡聚糖凝胶Sephadex G75再次进行柱层析，收集具有溶栓酶活性的部分，通过冷冻干燥得到溶栓酶产品。
阎家麒等人将发酵液在5000r/min离心20min，取无细胞上清液，进行饱和度为25%和60%的硫酸铵进行梯度层析，首先加入硫酸铵使溶液的饱和度为25%，通过搅拌溶解后在冰箱中静置过夜，通过离心除去杂蛋白，然后再加入硫酸铵使溶液的饱和度为60%，继续在冰箱中静置过夜，然后再次离心收集沉淀，通过超滤除盐，然后进行葡聚糖凝胶Sephadex G100层析，层析过程中用含有Nacl的pH值7.4的磷酸盐缓冲溶液洗脱，收集含有溶栓酶活性的组分。再经过柱层析，分管收集成单一对称峰的具有溶栓酶活性的组分，经透析，浓缩，真空冷冻干燥，最终获得溶栓酶的比活为31020UK/mg。
2.1.1.4 溶栓酶对血栓的溶解功能
人们研究了从豆豉中分离出的溶栓酶对血栓的溶解性，研究发现豆豉溶栓酶为枯草芽孢杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，有助于血管内形成的血栓或栓塞溶解。
王金英等人对豆豉溶栓酶在体内的溶栓作用进行了研究。以家兔为实验动物，首先使家兔体内形成血栓，然后将豆豉溶栓酶进行提取纯化，采用不同的溶栓酶剂量灌喂家兔。实验结果表明，当溶栓酶剂量为150～300mg/kg时，溶栓酶能有效地抑制实验动物家兔体内动脉血栓的形成，而小剂量的溶栓酶提取液起到预防血栓形成的作用。
李江伟对人血凝块进行了溶栓酶的水解实验，研究发现同等条件下，豆豉溶栓酶、尿激酶和生理盐水的溶栓特性进行比较，豆豉溶栓酶在反应2h和6h后血块溶解率分别为50%和100%，而尿激酶的血块溶解率只有45%和75%。
王金英等人对豆豉溶栓酶溶解纤维蛋白的机理进行了研究。在未加热的纤维蛋白平板和加热的纤维蛋白平板上分别检测豆豉溶栓酶对纤维蛋白的溶解能力。研究表明在未加热的纤维蛋白平板上，豆豉溶栓酶表现出来的对血栓的溶解是由于溶栓活性和纤维蛋白溶酶原激活活性的共同效应。在加热的纤维蛋白平板上，豆豉溶栓酶表现出来的对血栓的溶解只是由于溶栓酶具有的溶解血栓的作用。这个研究体现出豆豉溶栓酶不仅具有溶栓作用，还可以激活纤维蛋白溶酶原，从而间接达到溶解血栓的目的。
2.1.1.5 豆豉溶栓酶的分子生物学研究
近几年对豆豉溶栓酶的报道主要集中在对豆豉溶栓酶的分离纯化和溶栓酶的生化性质研究上，对豆豉溶栓酶分子生物学的研究相对较少。
彭勇等人对编码豆豉溶栓酶的基因序列进行了解析和表达。首先彭勇等人以产豆豉溶栓酶的解淀粉芽孢杆菌DC-4的总DNA为模板进行PCR扩增，对扩增后得到的重组质粒的阳性克隆进行了双向测序。测序结果表明，这种豆豉溶栓酶的成熟肽编码区含有825bp，编码的氨基酸残基有275个，通过推算确定豆豉溶栓酶的分子量为27.7kDa，这个结果与从解淀粉芽孢杆菌DC-4菌株的发酵液中分离纯化的出的豆豉溶栓酶的分子量28kDa是一致的。
通过以上的研究确定了解淀粉芽孢杆菌DC-4分泌的豆豉溶栓酶的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌溶栓酶的同源性很高。彭勇等在枯草芽孢杆菌WB600菌株中进行了溶栓酶目的基因的表达，得到的重组酶的豆豉溶栓酶与从解淀粉芽孢杆菌DC-4中提取的溶栓酶具有相同的分子量和生物学性质，但是溶栓酶的表达效率很低。
然后，彭勇等人继续将编码成熟的豆豉溶栓酶的DNA片段重新克隆到表达载体上，成功表达出了具有溶栓活性的豆豉溶栓酶。在研究过程中，构建出了两种重组质粒pET32PDFE和pET32DFE。而且他们在E.coli BL21内成功进行了豆豉溶栓酶DFE的表达。研究发现质粒pET32PDFE重组蛋白有溶解形式和包涵体两种形式，但是只在可溶解的重组蛋白部分检测到溶栓酶活性，并发现溶栓酶活性部分的酶活性达到277U/mL。质粒pET32DFE重组蛋白同样也在可溶部分和不可溶部分两种表达方式，但是这两种都以融合蛋白形式存在。研究发现在所有的重组大肠杆菌细胞溶解产物中并没有检测到溶栓酶的活性。这暗示了溶栓酶合成的前导序列在豆豉溶栓酶活性的构成过程中起到非常重要的作用。
刁苗通过PCR技术，从豆豉中筛选出来的产豆豉溶栓酶的枯草芽孢杆菌中进行了豆豉溶栓酶的编码基因片段的扩增，然后将扩增出来的片段连接到pET-28a（+）载体上，再将其转化到E coli BL21（DE3）细胞中。将其中的阳性克隆子用IPTG进行诱导表达了豆豉溶栓酶。为了提高重组溶栓酶的活力，在研究中还通过易错PCR和交错延伸技术对枯草芽孢杆菌产生的豆豉溶栓酶的编码基因进行了改造。然后将改造得到的突变基因连接到UpET-28a（+）载体上，再将其转化到E coli BL21（DE3）宿主菌细胞中，对得到的重组大肠杆菌进行两步筛选，筛选到4株相对于出发菌株溶栓酶活性显著提高的重组大肠杆菌。
2.1.1.6 基因工程技术在溶栓酶高产菌株上的应用
可以通过自然选育和诱变育种等方法来获得溶栓酶高产菌株，但自然选育存在工作量较大，周期较长的特点，采用物理或化学诱变剂进行的诱变育种也存在着突变具有不定向性，后期的筛选的工作量较大的缺点。基因工程技术可以有针对性地将目的基因导入受体细胞，并能实现在受体细胞中的高效表达。因此随着基因工程技术的发展，通过重组DNA技术获得编码溶栓酶的目的基因，并在细胞中实现表达产物已成为又一种提高溶栓酶产量的有效技术手段。
国内外研究者们在溶栓酶基因的表达系统上进行了研究，主要集中在溶栓酶基因在原核生物系统中的表达。通过这些溶栓酶基因的表达，获得的产物有的有溶解血栓的活性，有的缺乏溶栓酶活性。有些研究表明，溶栓酶基因的成熟肽编码序列在基因表达具有溶栓酶活性；有的在表达产物形成的包涵体蛋白经复性后仍无溶栓酶活性。
彭勇克隆了解淀粉芽孢杆菌豆豉溶栓酶基因，而且对溶栓酶基因表达进行了初步研究。通过PCR技术获得的溶栓酶基因的全长为1811bp，含有一个全长为1146bp的开放阅读框，共编码382个氨基酸。这些氨基酸中包括由77个氨基酸残基组成的前肽，由30个氨基酸残基组成的信号肽和由275个氨基酸残基组成的成熟肽。通过PCR技术获得的溶栓酶基因与枯草芽孢杆菌K-54的纤溶酶的核苷酸的同源性高达98.2%，测定这两种溶栓酶的氨基酸的同源性为97.8%。
目前常用的基因工程宿主菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。在溶栓酶基因的克隆和表达上采用枯草芽孢杆菌更具有优势。枯草芽孢杆菌作为一种常用的基因工程宿主菌，具有一些特殊的优势。首先枯草芽孢杆菌安全高效，无致病性，它不像大肠杆菌那样具有热源性脂多糖；另外枯草芽孢杆菌的遗传学特性较清楚，很多噬菌体和质粒适合于用作枯草芽孢杆菌的克隆载体；同时枯草芽孢杆菌分泌蛋白酶的能力强，当分泌的蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到细胞的培养基中，这使得酶的回收和纯化较为简单；另外枯草芽孢杆菌生长速度快，稳定性强、适应能力强，便于培养和发酵。因此，枯草芽孢杆菌已被成功地用于多种原核基因及真核基因的表达。目前已经成功在枯草芽孢杆菌体内表达的蛋白质有淀粉酶、碱性蛋白酶、链激酶及植物甜蛋白等多种基因。由于目前分离到的产溶栓酶的微生物均为革兰氏阳性细菌，如纳豆杆菌、解淀粉芽孢杆菌和藤黄微球菌等。这些来自革兰氏阳性细菌的基因的表达元件与革兰氏阴性细菌大肠杆菌的表达元件不完全相同。因此，今后可以采用枯草芽孢杆菌作为溶栓酶基因表达的载体进行研究和应用。目前商业化的表达载体主要来自大肠杆菌，缺乏商业化的来自枯草芽孢杆菌的表达载体，因此，为了在枯草芽孢杆菌能高效表达这些溶栓酶基因，必须选择或重新筛选一些在枯草芽孢杆菌细胞中具有很强的启动转录效率的启动子，进行转基因枯草芽孢杆菌的培养条件的优化。今后这些研究对加快具有我国自主知识产权的新型高效溶栓酶药物的开发和应用具有重要的现实意义。