造血微环境（niche）是机体的造血干细胞赖以生存的场所。造血微环境主要包括微血管系统、神经成分、基质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞、巨噬细胞、网状细胞等）和多种造血生长因子，共同组成了一个高度复杂而有效的调节网络，对造血干细胞的自我更新和定向分化、增殖及归巢和定位有重要作用。因此，造血干细胞和造血微环境以及调节造血的细胞因子被形象比喻为“种子”、“土壤”和“肥料”，以表示三者之间的密切关系。

来源于间充质干细胞的成骨细胞、血窦内皮细胞和窦间网状细胞，以及其细胞外基质共同构成造血微环境的主体。它们通过生成细胞因子、黏附因子和细胞表面受体与造血干细胞相互作用，调节造血干细胞的增殖分化和迁移，以及成熟血细胞释放。髓腔中血窦与骨内外血管系统的沟通，交感神经纤维与血窦间网状细胞表面受体的直接接触与信号传递，又形成了造血微环境反映外环境变化的通道。此外，从骨髓腔中央到骨内膜表面逐渐增高的钙离子梯度和逐渐减低的氧分压梯度，对造血干细胞归巢、定位和代谢方式的选择有至关重要的作用。

骨髓中除造血细胞外还有间充质干细胞及其后代。追忆到19世纪70年代，Friedenstein等首先发现小鼠骨髓中存在的基质细胞具有高增殖能力，它们黏附塑料培养板，通过增殖形成集落CFU-F，在扩散盒培养体系中能自发向骨和软骨细胞分化，也能向纤维组织分化。这些骨髓基质细胞因有向间充质细胞谱系分化潜能而有间充质干细胞之称。将包含间充质干细胞的骨髓基质移植到小鼠骨被膜下能形成小骨，小骨中央有骨髓腔和造血细胞，提示间充质干细胞可能是构成造血微环境的主要细胞成分。以后发现间充质干细胞在培养过程中会老化，随着传代次数增多而CFU-F数减少，多向分化能力减弱，端粒逐渐变短，提示间充质干细胞并非均一的细胞群体，可能包含不同分化阶段细胞。由于间充质干细胞具有临床应用前景，相关研究日益增多。为了统一对间充质干细胞的认识，2006年由国际细胞治疗协会的组织干细胞委员会宣布了间充质干细胞的定义，指出间充质干细胞的表型为CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD105 ⁺ CD45 ^- CD34 ^- CD14 ^- CD116 ^- CD79 ^- CD19 ^-，能黏附塑料培养板，能在体外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。此后数年来的研究结果更加丰富了人们对间充质干细胞的认识。

我们通过一系列基础研究，拓展了前期对间充质干细胞的科学认识，在国际上首次提出“间充质干细胞系统”的理论概念，指出间充质干细胞是一个复杂混合的细胞群体，包含了源自胚胎不同发育胚层和整个生长发育过程的多个不同阶段及不同组织来源的间充质干细胞。这些细胞均具有自我复制多系分化特性、平衡机体组织微环境与组织代谢及突出的免疫调控功能的三大重要生物学特征。它们通过三胚层多谱系分化、调控组织微环境及代谢平衡、调控免疫三大功能方式来维持组织更新、代谢、损伤修复和免疫平衡。该理论概念为扩展可用于临床治疗的间充质干细胞群体来源范围、制定分化调控策略和开发干细胞治疗难治性疾病关键技术提供了理论依据。骨髓中的间充质干细胞具有高度异质性，既体现在细胞等级分化形成不同发育阶段细胞方面，也体现在间充质干细胞发育来源方面。构成造血微环境的间充质干细胞可能来自中胚层。小鼠或人胚胎干细胞在ESC/EB培养体系中能产生具有造血分化潜能的细胞集落BL-CFC，也产生具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化潜能的间充质干细胞集落MS-CFC。在MS-CFC生成过程中，细胞相继表达中内胚层基因Brachyury、MixL1和Eomes，侧板中胚层和胚外中胚层基因FOXF1、Gata2和HAND1、HAND2等，提示MS-CFC是胚胎发育过程中由内细胞团向中胚层分化的后代。追查骨髓中间充质干细胞基因表达，的确有中内胚层特征的Brachyur和中胚层特征基因FLK-1。但是也有些间充质干细胞表达神经嵴干细胞标志Nestin，提示它们来自神经外胚层。这些Nestin阳性细胞有间充质干细胞特征，能向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化，在体外培养中也能形成可传代的球状集落，移植到体内能形成小骨。人骨髓中的Nestin阳性细胞有明显的等级分化阶段性，其早期分化阶段细胞的免疫表型为CD271 ⁺ CD146 ^-，相继分化为CD271 ⁺CD146 ⁺细胞和CD271 ^- CD146 ⁺细胞。不同分化阶段Nestin阳性细胞在骨髓中的定位不同，调节造血的功能也有差别，并随年龄的增长而老化。青少年人骨髓中的Nestin阳性细胞以早期分化阶段为主，CD271 ⁺ CD146 ^-和CD271 ⁺ CD146 ⁺细胞占90%以上，而55岁以上老年人骨髓中很少CD271 ⁺ CD146 ^-细胞。中胚层来源的造血微环境细胞也有等级分化阶段性和随年龄增长而老化的现象。实验结果证明老化的造血微环境支持造血细胞的功能减弱。造血干细胞在分化过程中产生所有的血细胞，分化过程中也涉及了广泛的表观遗传学调控。最新研究提出了造血干细胞相关DNA甲基化动力学的全基因组参考图谱。该研究即使用大数据表观基因组学方法，将DNA甲基化谱结合在许多小细胞池上，并进行单细胞甲基测序，以评估细胞与细胞的异质性。所得数据不仅鉴定了来源于胎儿肝脏、脐带血、骨髓和外周血的造血干细胞之间的特征差异；还观察到髓系和淋巴祖细胞、特异性的未成熟多淋巴祖细胞的谱系特异性DNA甲基化，并发现了成熟巨核细胞的进行性DNA甲基化差异。研究将这些基因与基因表达、组蛋白修饰和染色质重塑联系起来，用机器学习方法从DNA甲基化数据中直接推导出人类造血分化的模型。这些结果有助于更好地了解人类造血干细胞的分化，并为研究血液相关疾病提供了一个指导框架。

造血干细胞自我更新和增殖分化调节一直是血液学领域的核心研究课题。早在1977年Schofield提出了壁龛“niche”假说，认为由骨髓基质细胞构成的壁龛细胞是造血干细胞自我更新的必要结构，只有定位于壁龛内的造血干细胞才能进行不对称分裂，分裂后的子细胞留在壁龛中能保持未分化状态，离开壁龛的子细胞则进入增殖分化程序。多年来有大量研究验证壁龛假说，结果证明壁龛结构有细胞学基础，由不同间充质干细胞传代后形成的各种壁龛，其表面分子和分泌因子不同，对造血干细胞自我更新和增殖分化的调节也各有侧重。已经发现骨髓中至少有两种功能不同的壁龛，即由成骨细胞为主要细胞成员的骨内膜壁龛和由血窦内皮细胞为主要成员组成的血管壁龛。

学术界对骨内膜壁龛的认定较早。2003年在 Nature杂志同时发表了两篇报道，证明由成骨细胞构成的骨内膜壁龛能调节体内造血干细胞池大小。他们用棘基因小鼠分别观察了骨形成蛋白和副甲状腺素对骨内膜壁龛数量的影响。结果发现骨形成蛋白通过结合成骨细胞表面的骨形成蛋白受体负性调节造血，减少骨内膜壁龛数量，使造血干细胞减少，重建骨髓造血的功能减弱；副甲状腺素则通过结合骨细胞表面的副甲状腺素受体而减少骨内膜壁龛数量，从而增加造血干细胞胞池大小和骨髓造血功能。此后关于骨内膜壁龛的细胞学组成的功能完整性的研究日益增多。有报道指出，骨内膜表面的钙离子浓度是血清钙离子浓度的30倍，从骨髓腔中央到骨内膜表面的钙离子浓度梯度是调节造血干细胞归巢和定位到骨内膜壁龛的重要因素，只有表达钙离子敏感受体的造血干细胞才能定位于骨内膜壁龛。有报道指出，骨内膜壁龛的功能完整性还需要CD169阳性巨噬细胞的参与，清除巨噬细胞会减弱骨内膜壁龛的贮留造血干细胞的能力，造成大量造血干细胞迁移出壁龛。定位于骨内膜壁龛的造血干细胞是少数静止状态的LT-HSC，骨内膜壁龛的主要功能是保存LT-HSC于静止状态。近期对骨内膜壁龛中的骨髓内皮干细胞研究较多。

骨髓内皮干细胞可以促进培养中的造血干细胞长期重建。骨髓窦状脉管系统对辐射敏感，但在亚致死辐射暴露后3～4周内可恢复和重建。辐射后在骨髓内皮干细胞共培养下可以营救辐射损伤的造血干细胞，且移植后具有多种造血系统重建能力。此外，Chute等人证明，在没有移植造血细胞的情况下，将自体或异基因小鼠的骨髓内皮干细胞注入致死性辐射小鼠，可以加速骨髓血管和造血再生，显著提高存活率。Salter等人认为移植的骨髓内皮干细胞不能移植归巢到骨髓血管系统中，提示再生效应是通过间接作用或由骨髓内皮干细胞衍生的可溶性因子介导发挥的功能。这与临床研究表明的骨髓脉管系统的重建主要源自宿主骨髓内皮干细胞，而非供者来源的内皮干细胞观点相一致。

最近研究证据表明骨髓内皮干细胞在造血干细胞再生中发挥必要的作用。采用VEGFR2的基因缺失或抗体介导的血管内皮-cadherin介导的血管生成模型证实了可阻断辐照小鼠的骨髓血管再生，导致长时间的造血毒性作用和延迟的造血干细胞再生。功能增益模型研究也表明了，骨髓内皮干细胞促进了造血干细胞的维持和更新：Tie2Cre、Bak1 ^2/2、Baxf ^1/2小鼠，与Tie2 ⁺内皮干细胞中保留BAX外源介导细胞的小鼠相比，Tie2 ⁺内皮干细胞中BAK和BAX具有骨髓血管系统和造血系统的辐射保护作用。同样，人类主要靠骨髓内皮干细胞中Akt-mTOR通路的基因激活发挥增强造血干细胞自我更新能力，而促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）有利于造血干细胞在共培养中的分化。最近研究证实，在表达干细胞因子的小鼠模型中内皮干细胞也发挥了促进脾脏内髓外造血作用。同一研究中也证实，Tcf21 ⁺基质细胞通过分泌CXCL12等在维持脾脏髓外造血中具有必要作用。

血管壁龛主要由VEGFR2 ⁺ VEGFR3 ⁺ VE-Cadherin ⁺Sca-1 ^-血窦内皮细胞组成，血窦外还有a-SMA ⁺周细胞和Nestin ⁺网状基质细胞外见于内皮细胞单层。造血干细胞迁移出入骨髓腔时要定位于血窦中，因此血管壁龛是造血干细胞归巢的门户。有研究报道血窦内皮细胞支持LT-HSC自我更新。作者将永生化的血窦内皮细胞E4ORF1 ⁺ EC单层与Sca-1 ⁺Lin ^-造血干细胞共培育于无血清体系，增补干细胞因子SCF 10ng/ml，每周分离Sca-1 ⁺Lin ^-造血干细胞到新的E40RF1 EC单层，发现4周后仍有Sca-1 ⁺Lin ^-造血干细胞扩增，并向成熟血细胞分化。从培养3周的细胞群中分离1000个造血干细胞移植到致死量辐射小鼠，观察竞争性嵌合，结果发现在移植后12个月的受者体内有经过培育的细胞；取受者骨髓细胞作二次移植，仍有嵌合的培育细胞，证明血窦内皮细胞能支持造血干细胞自我更新和增殖分化。骨髓中遍布血窦，定位于血管壁龛的造血干细胞远比定位于骨内壁龛的造血干细胞多，而且也比较活跃地增殖分化，说明血管壁龛是造血干细胞应对外周血需求的场所，而骨内膜壁龛则是静止状态造血干细胞的贮留场所。

分布在骨内膜壁龛和血管壁龛之间的nestin阳性网状细胞被认为是正宗的“niche”细胞，它们为造血干细胞提供龛位。Nestin阳性CD271 ⁺ CD146 ^-网状细胞靠近骨内膜，表达成骨细胞特异性转录因子osterix，具有成骨细胞分化潜能。靠近血窦内皮的nestin阳性网状细胞多为CD271 ⁺ CD146 ⁺细胞，可表达周细胞特征性分子a-SMA。这些广泛分布于骨髓腔的nestin阳性网状细胞都生成大量趋化因子CXCL12和干细胞因子SCF，能吸引和保持大量造血干／祖细胞，调节造血干细胞归巢和释放，也调节造血干细胞增殖分化，可视为独立的壁龛结构，也可作为骨内膜壁龛或血管壁龛的组成部分。Nestin阳性网状细胞也表达肾上腺能受体β 3-AR，并有交感神经纤维与之直接接触，传递信号减少CXCL12表达，促进造血干细胞释放出壁龛。因此，nestin阳性网状细胞也是交感神经系统节律性调节造血干细胞的生物钟组成部分。

在胚胎内部，造血系统的发育发生在多个不同的部位，包括胚外卵黄囊、胎肝、脾脏，最后是成体骨髓。在发育后期，造血干细胞存在于胎儿肝脏。关于胎儿肝脏血管壁龛仍然存在许多问题，特别是关于出生后造血干细胞从胎儿肝脏向骨髓迁移的过程。最近的一项研究表明，nestin阳性的NG2 ⁺周细胞与门静脉血管相关，形成了促进造血干细胞扩张的胎儿血管壁龛。在出生后肝脏中造血干细胞的快速丢失与出生后门静脉血管循环的剧烈变化有关——在出生时确定了脐入口。因为门静脉血管经历了从ephrin-B2 ⁺动脉到EphB4 ⁺静脉表型的转变，相应的基质细胞丢失，包括nestin阳性的NG2 ⁺周细胞。这表明，出生后血液循环和血流动力学的变化改变了肝脏的脉管系统，并与造血干细胞支持细胞的丢失有关。造血干细胞随后迁移到骨髓，在这种情况下，长期造血持续到出生后。

大多数哺乳动物造血发生在扁平骨的轴向骨架（即所谓的红骨髓），如骨盆、胸骨、颅骨、肋骨、椎骨，以及长骨的干骺端和骺端。其他的骨髓，由高脂肪含量（“黄骨髓”）组成，可以在长骨的二联体（轴）的中空内部找到。动脉通过骨皮质进入，终止于骨内膜（结缔组织-位于致密骨内壁的结缔组织），并在长骨的干骺端或深部分支。大部分的分支动脉位于干骺端，而中央骨干中几乎没有分支动脉。一些远端在内膜终止于毛细血管，虽然大部分终止点在骨干骺端。在骨头附近，小动脉打开并与静脉窦丛吻合。这些静脉窦通过收集小静脉排出，并集中到中央纵向静脉。这些小动脉与内皮细胞联系更紧密，并被罕见的NG2 ⁺（也被称为CSPG4 ⁺）、nestin阳性周细胞所包裹，这种细胞与窦状相关的leptin受体（LepR） ⁺或nestin弱阳性血管周细胞不同。静脉位于中枢性骨干，在那里它们与干骺端毛细血管相连。静脉窦是薄壁的，由一层几乎没有基底膜的扁平鳞状上皮细胞组成，覆盖着周细胞和血管周间质细胞，包括C-X-C motif chemokine ligand 12 （CXCL12）的CAR细胞和Lepr ⁺细胞。骨髓没有淋巴引流，所有血管都在小梁骨网内。这个解剖建立了一个循环的血液流动模式，从骨髓腔的中心向外周，然后再返回。

骨内膜壁龛的主要功能是保持龛内LT-HSC静止。实验结果证明由成骨细胞生成的TPO和Aug-1通过结合LT-HSC表面受体MPL和Tie传递信号，上调周期素激酶lyclinD1的抑制分子P21cip1和P57kin2，同时抑制C-Myc，使定位于骨内膜壁龛的LT-HSC退出增殖周期，保持静止状态。此外，骨内膜壁龛亦参与Wnt和Notch信号调节造血功能。

血管壁龛的主要功能是调节造血干细胞迁移和增殖。骨髓中的造血干细胞70%以上定位于血管壁龛，黏附于血窦内皮细胞。窦周nestin ⁺网状细胞和一些nestin受体阳性周细胞生成的趋化因子CXCL1和膜结合型干细胞因子SCF，不但通过结合其相应受体CXCR4和c-kit把造血干细胞定位于龛内，而且调节造血干细胞增殖。实验结果证明膜结合型干细胞因子是造血干细胞在骨髓内扩增不可缺少的因子。血窦内皮细胞条件性缺失SCF的转基因小鼠骨髓中造血干细胞明显减少，骨髓移植后不能重建受者骨髓造血的功能。由血窦周网状细胞高表达的CXCL12，不但是吸引和贮留造血干细胞的重要分子，也可通过结合造血干细胞表面受体CXCR4传递信号，控制造血干细胞的扩增。实验结果证明CXCL12-CXCR4信号轴能直接促进P57kip2表达，使细胞保持G期，说明血窦周网状细胞通过CXCL12- CXCR4信号途径调节造血干细胞的增殖状态，避免过度扩增而衰竭。骨髓移植后进入血窦周龛位的造血干细胞，经条件缺失CXCR4阻止CXCL12-CXCR4信号途径，会显示过度扩增，对5-Fu的杀伤作用十分敏感，乃至失去重建造血的能力。

Wnt基因编码长度为350～400个氨基酸的分泌型糖蛋白，其特征为含有22～24个保守型半胱氨酸残基。Wnt蛋白家族作为一种分泌型信号分子，参与胚胎形成、组织器官发育和生殖系统发生。Wnt蛋白、Frizzled（Fzd或Frz）、Dishevelled（Dsh或Dvl）、GSK3、CK1、β-Catenin和TCF/LEF是Wnt信号通路中的重要蛋白。最近研究发现，经典Wnt信号Wnt3a导入OP9基质细胞后，与造血干细胞共培养，则其向B细胞、NK细胞和树突状细胞分化和增殖均受阻。能抑制造血祖细胞进入细胞周期，而使其保持静止状态。而OP9细胞同时向成骨系分化，其有关间充质干细胞特性的angiopoietin-1、c-Kit配基和VCAM-1细胞因子表达下降。说明经典Wnt信号抑制造血祖细胞的增殖。另有研究发现，N-cadherin ⁺成骨细胞表达非经典Wnt配体，并抑制稳态条件下经典Wnt信号。而在应激条件下，激活的LT-HSC非经典Wnt信号被削弱，同时经典Wnt信号被增强。因此，骨髓微环境中成骨细胞参与了非经典Wnt信号维持LT-HSC静息状态的调节。也有报道发现，当成骨细胞过表达可同时阻滞经典及非经典Wnt信号的抑制因子Wlf1时，前者能够打破造血干细胞的静止状态，造成自我更新能力的缺失，促使造血干细胞和祖细胞在骨髓和脾增殖。

Notch通路是在进化上高度保守的信号转导通路，通过调节细胞-细胞间的相互作用使细胞的分化和自我更新处于平衡状态进而控制分化过程。几乎所有组织和器官中都有表达。Notch家族成员共有4个（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）。目前在哺乳动物发现5种Notch配体，分别为Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4（Dl11、Dl13、Dl14）和Jagged1、Jagged2（与果蝇Serrate/Lag 2蛋白同源），亦可被共同称为DSL（Delta/Serrate/Lag2）。研究发现，Notch信号通过Hes或Hey蛋白抑制Runx2转录活性，从而抑制成骨细胞分化而维持骨髓间充质干细胞池。研究表明，Notch信号调节造血干细胞处于未成熟状态，减少其分化。Notch受体（Notch1～Notch4）以及配体（Delta-like1、Delta-like4和Jagged1）同时表达于造血干细胞和基质细胞，说明Notch信号能够在造血干细胞或者邻近造血干细胞或造血微环境中的基质细胞中活化，从而发挥调节造血功能的作用。临床研究发现，骨髓增殖性疾病发生与骨髓微环境中造血细胞的Notch信号启动受阻密切相关。