第2章 光谱分析技术基础

2.1 光谱分析理论基础及技术特点

2.1.1 近红外光谱技术

1.理论基础

近红外（Near-Infrared，NIR）光谱区是介于可见光（Vis）和中红外光（MIR）之间的电磁波，按ASTM（美国试验和材料检测协会）定义是指波长在780～2526nm的电磁波，波数范围为4000～12500cm^-1。利用近红外光谱对物质分子进行的分析和鉴定，简单来说，就是将一束不同波长的红外射线照射到样品的分子上，由于光具有波粒二象性，红外光从光源射出后，会与被检测样品中的分子碰撞，当光粒子与样品分子的振动频率不同时，光会通过样品而不发生任何变化；如果光粒子与样品分子的振动频率一样，样品分子将会吸收光粒子的能量从而发生振幅改变。因为每种分子都有由其组成和结构决定的独有的红外吸收光谱，所以测量样品的出射光或者反射光的衰减和吸收可以得到样品所包含的物质信息。

近红外光谱的常规分析技术包括近红外透射光谱分析和近红外漫反射光谱分析两大类。

近红外光谱透射分析技术一般用于均匀透明的溶液或固体样品，测量得到的吸光度与光程及样品的浓度之间符合朗伯-比尔定律，如图2-1所示：

一种物质的溶液对光的吸收程度，由该溶液能吸收光子的物质微粒数目和长短决定。显然，物质的浓度越大，吸收的光就越多，液体厚度越大，吸收的光也越多。朗伯-比尔定律说明了待测物质的吸光度与溶液中吸收物质的浓度以及吸收介质的厚度有关，与入射光的强度无关。

图2-1 朗伯-比尔定律

一束强度为I₀的光辐射通过一层溶液时，一部分能量I被吸收，另一部分被透射I_t，还有一部分被吸收池散射（I′_s）和反射（I_r）。如果样品浑浊或发荧光，则透射光中还包括样品的散射光（I_s）和荧光（I_f）。

如果样品为透明介质，不发射荧光，并且样品测量总是在类似的比色池中，相对参比溶液而言的I_r、I_s、I_f和I′_s均可被忽略。据朗伯-比尔定律有如下的公式：

式中，A是吸光度；c是溶液浓度；k为吸光系数，它随不同的介质、波长、环境而异，它可以表示一个物质的吸收特征，在数值上等于单位摩尔浓度在单位光程中所测得溶液的吸光度；l为介质厚度，在这里为常数；T是透光度，表示透射辐射能与入射辐射能的比。

近红外光谱漫反射分析在近红外光谱分析中占有十分重要的地位，近红外光谱早期在农业和农副产品分析中的应用大多是靠漫反射完成的。漫反射是光源出来的光进入样品内部，经过多次反射、折射、衍射及吸收后返回样品表面的光。因此，漫反射光是分析光与样品内部分子发生作用后的光，负载了样品的结构和组成信息。由于漫反射过程中样品与光的作用有多种形式，除样品的组成外，其粒径大小及分布和形状均对漫反射光的强度有一定的影响，因此漫发射光的强度不符合朗伯-比尔定律。漫反射光谱定量的基本原理遵守Kubelka-Munk方程，如下：

其中，R∞为样品厚度无穷大时的相对漫反射率；A为吸光度；K为吸收系数；S为散射系数。

2.技术特点

与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术具有诸多优点，它能在几分钟内，仅通过对被测样品完成一次近红外光谱的采集测量，即可完成其多项性能指标的测定（最多可达十余项指标）。光谱测量时不需要对分析样品进行前处理；分析过程中不消耗其他材料或破坏样品；分析重现性好、成本低。

（1）无前处理、无污染、方便快捷

近红外光具有很强的穿透能力，在检测样品时，不需要进行任何前处理，可以穿透玻璃和塑料包装进行直接检测，也不需要任何化学试剂。和常规分析方法相比，既不会对环境造成污染，又可以节约大量的试剂费用。近红外光仪器的测定时间短，几分钟甚至几秒钟就可以完成测试，并打印出结果。

（2）无破坏性

无破坏性是近红外光技术的一大优点，根据这一优点，近红外光技术可以用于果蔬原料及成品的无损检测。在果品贮藏库中安装近红外光装置，能够实现果蔬的自动检测，节省大量的人力和物力。

（3）在线检测

由于近红外光技术能够及时、快捷地对样品进行检测，在生产中，可以在生产流水线上配置近红外光装置，对原料和成品及半成品进行连续再现检测，有利于及时发现原料及产品品质的变化，便于及时调控，维持产品质量的稳定。光纤导管和光纤探头的开发应用使远距离检测成为现实。且远距离检测技术特别适用于污染严重、高压、高温等对人体和仪器有损害的环境应用，为近红外光网络技术的发展奠定了基础。

（4）多组分同时检测

多组分同时测定，是近红外光技术得以大力推广的主要原因。在同一模式下，可以同时测定多种组分，比如在测小麦的模式中，可以同时测定其蛋白质含量、水分含量、硬度、沉淀值、快速混合比等指标，这样大大简化了测定操作。不同的组分对测定结果都有一定的影响，因为在测定过程中，其他组分对近红外光也有吸收。

（5）测定速度快

近红外光谱的信息必须由计算机进行数据处理，统计分析一个样品取得光谱数据后可以立即得到定性或定量分析结果，整个过程可以在不到2min内完成，而且可以通过样品的一张光谱计算出样品的各种组成或性质数据。

（6）投资及操作费用低

近红外光谱仪的光学材料为一般的石英或玻璃，仪器价格低，操作空间小，样品大多数不需要预处理，投资及操作费用较低，而且仪器的高度自动化降低了操作者的技能要求。

当然，近红外光谱分析也有其固有的缺点：首先，它的测试灵敏度比较低，相对误差比较大；其次，由于它是一种间接测量手段，需要用参考方法（一般是化学分析方法）获取一定数量的样品数据，因此测量精度永远不能达到该参考方法的测量精度，建立模型也需要一定的化学计量学知识、费用以及时间；最后，近红外光的测量范围小，只适合对含氢基团的组分或与这些组分相关的属性进行测定，而且组分的含量一般应大于0.1%才能用近红外光进行测定。对于经常质量监控是十分经济且快速的，但对于偶然做一两次分析或分散性样品的分析则不太适用。因为建立近红外光谱方法之前，必须投入一定的人力、物力和财力，才能得到一个准确的校正模型。当然，近红外光谱分析技术目前在实际应用中也存在一定的局限性，需要进一步探索和改善：

1）对痕量分析和分散性样品分析有很大困难，其检测限常在100×10^-6；

2）模型建立需要投入一定的人力、财力和时间，而且建立后的模型还需要不断修正；

3）模型的适用受一定的地域或者环境影响，不容易建立通用模型。

2.1.2 傅里叶变换红外光谱衰减全反射技术

1.理论基础

衰减全反射（ATR）原理可以简单地概括如下：当入射角大于临界角时，入射光在透入光疏介质（样品）一定深度后，会折回射入全反射晶体中。进入样品的光，在样品有吸收的频率范围内光线会被样品吸收而强度衰减，在样品无吸收的频率范围内光线被全部反射。ATR光谱就是置于晶体上样品的红外光谱，反映出来的是光线经过的那部分样品的化学键分子运动特征，亦即表面或界面的化学特征。

用水平ATR测试仪测得的是样品吸收光谱，光路示意如图2-2所示。

当入射角θ大于临界角时，还有部分光束透过反射表面进入样品，穿透一定深度后，再反射回棱镜。光线全反射示意如图2-3所示。

图2-2 水平ATR附件的光路示意图

图2-3 光线全反射示意图

从式（2-4）可以看出，增加L，减小T和θ可以使反射次数增加。但在实际中受到材料来源和整个装置的设计尺寸限制，一般L不超过50mm。T减小，使进光斜面减小，会造成光能利用率减小。为保证获得好的光谱质量，入射角不能等于或接近临界角，否则将会产生波峰畸变。

ATR光谱强度取决于有效穿透强度、反射次数和样品与反射晶体的紧密贴合程度以及样品本身吸收的大小。而有效穿透强度取决于3个因素：

1）光波波长；

2）反射晶体与样品的折射率比（n₁/n₂）；

3）入射角。

影响样品与反射晶体接触程度的主要因素是样品与晶体间的压力。

ATR技术主要用于研究有机化合物的红外光谱，而大多数有机物的折射率小于1.5。因此，根据发生全反射条件（n₁>n₂）要求，要获得ATR光谱需使用折射率大于1.5的红外透过晶体。常用的ATR晶体材料有Ge、ZnSe和KRS-5等。但由于KRS-5质软、有毒性，已少用。

2.技术特点

衰减全反射不需要通过样品信号，而是通过样品表面的反射信号获得样品表层有机成分的结构信息。因此，衰减全反射具有如下特点：

1）非破坏性分析方法，能够保持样品原貌进行测定。常用的KBr压片法，对样品研磨或挤压可能改变样品的微观状态。

2）对样品的大小、形状没有特殊要求，甚至可测极微小物，如纤维、毛发等。

3）可测定含有水和潮湿样品。

4）红外辐射通过穿透样品与样品发生相互作用而产生吸收，因此，ATR光谱具有透射吸收光谱的特性和形状，因红外光谱数据库中多以透射谱形状出现，ATR光谱的这一特性使它便于与透射光谱比较。但由于不同波数区间ATR技术灵敏度不同，因此，ATR光谱吸收峰相对强度与透射光谱相比并不完全一致。

5）操作简便、自动化程度高，可用计算机进行选点、定位、聚集、测定。

2.1.3 拉曼散射光谱技术

图2-4 拉曼光谱能阶图

印度物理学家拉曼（Raman）在1928年发现了光的非弹性散射效应拉曼散射，单色光照射在分子表面会发生散射，小部分散射光因为会跟分子发生能量交换，光谱的波长会发生改变，这种光谱就是拉曼光谱。同年稍后在前苏联和法国也被观察到。在透明介质的散射光谱中，频率与入射光频率ν₀相同的成分称为瑞利散射；频率对称分布在ν₀两侧的谱线或谱带ν₀±ν₁即拉曼光谱，其中频率较小的成分ν₀-ν₁又称为斯托克斯线，频率较大的成分ν₀+ν₁又称为反斯托克斯线。靠近瑞利散射线两侧的谱线称为小拉曼光谱；远离瑞利线两侧出现的谱线称为大拉曼光谱。瑞利散射线的强度只有入射光强度的10^-3，拉曼光谱强度大约只有瑞利线的10^-3。小拉曼光谱与分子的转动能级有关，大拉曼光谱与分子振动-转动能级有关。拉曼光谱的理论解释是，入射光子与分子发生非弹性散射，分子吸收频率为ν₀的光子，发射ν₀-ν₁的光子（即吸收的能量大于释放的能量），同时分子从低能态跃迁到高能态（斯托克斯线）；分子吸收频率为ν₀的光子，发射ν₀+ν₁的光子（即释放的能量大于吸收的能量），同时分子从高能态跃迁到低能态（反斯托克斯线）。分子能级的跃迁仅涉及转动能级，发射的是小拉曼光谱；涉及振动-转动能级，发射的是大拉曼光谱。图2-4所示是拉曼光谱的能阶图，其可以更好地表示出不同的能阶相对应的拉曼信号（图中线的粗细大致与描述信号的强度成比例）。与分子红外光谱不同，极性分子和非极性分子都能产生拉曼光谱。拉曼光谱的应用范围遍及化学、物理学、生物学和医学等各个领域，对于纯定性分析、高度定量分析和测定分子结构都有很大价值。

随着拉曼光谱学、仪器学、激光技术的发展，拉曼光谱技术作为一种成熟的光谱分析技术，已发展了多种不同的分析技术，如傅里叶变换-拉曼（FT-Raman）光谱、表面增强拉曼光谱（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）、激光共振拉曼光谱（Resonance Raman Spectrome-try）、共焦显微拉曼光谱等。表2-1列出了各种拉曼光谱技术的原理、优缺点及主要的应用领域。

表2-1 典型拉曼光谱技术

2.1.4 紫外-可见光分光光度法

1.理论基础

紫外-可见光（UV-Vis）谱区电磁波波长范围为200～900nm，波数范围为50000～10000cm^-1。物质对紫外光谱区光的吸收具有选择性，这种选择性的特征吸收光谱使得使用紫外分光光度法检测农产品农药残留成为可能。物质中的分子或原子与紫外光子碰撞后吸收了紫外光子的能量，导致分子能级和电子能级发生跃迁从而形成物质的紫外光区吸收光谱。不同物质内部分子或原子结构的不同反映在光谱吸收上即不同物质对紫外光谱区的吸收波段不同，因此可根据其特有的吸收光谱曲线进行定性或定量分析。定量分析的基础是朗伯-比尔定律：物质在一定浓度时的吸光度不仅与物质种类有关且与介质的厚度和浓度成正比。紫外可见光区域可以反映许多有机化合物的特征信息，因此可用紫外-可见光分光光度法定性和定量分析有机物结构及含量。

2.技术特点

1）同一浓度的待测溶液对不同波长的光有不同的吸光度；

2）对于同一待测溶液，浓度愈大，吸光度也愈大；

3）对于同一物质，不论浓度大小如何，最大吸收峰所对应的波长（最大吸收波长λ_max）相同，并且曲线的形状也完全相同。