实验十 抗体制备技术（多克隆抗体制备）
抗体是机体B细胞在抗原刺激下活化增殖转化为浆细胞所产生的特异性免疫球蛋白，其根据重链稳定区的分子结构与抗原性的不同，可分为五类，即IgG、IgM、IgA、IgD与IgE。抗体在临床免疫学诊断、防治及科研工作中具有广泛的用途，常需大量人工制备，如多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体和纳米抗体等。本章简要介绍多克隆抗体的制备方法和应用。
实验目的
1.熟悉 制备多克隆抗体的基本方法。
2.了解 多克隆抗体的应用。
基本原理
抗原分子通常具有多个表位，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对抗原不同表位的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（PcAb）。本实验以伤寒杆菌多克隆抗体为例介绍多克隆抗体制备技术。伤寒杆菌“O”“H”抗原是常用于临床诊断和实验室分型鉴定的抗原。“O”抗原是伤寒杆菌细胞壁特异多糖，理化性质稳定。“H”抗原是伤寒杆菌鞭毛蛋白质成分，理化性质不稳定，经甲醛固定后可成为遮盖菌体成分的表面抗原。利用上述特性制备伤寒杆菌“O”和“H”抗原，分别免疫动物后，即可获得抗伤寒杆菌“O”“H”抗原的多克隆抗体。
实验材料
（1）菌种：伤寒杆菌。
（2）实验动物：家兔（2.5kg）若干只。
（3）0.4%甲醛生理盐水、生理盐水、碘酊、酒精棉球、0.01%硫柳汞、普通培养基等。
（4）平皿、克氏培养瓶、37℃培养箱、MC Farland比浊管、试管、吸管、注射器、无菌三角瓶、针头及水浴箱等。
实验方法
（1）伤寒杆菌培养：制备普通固体培养基（普通平板和克氏培养瓶）和普通液体培养基。将伤寒杆菌划线接种于普通平板上，37℃培养24小时后挑选光滑型菌落接种于液体培养基中培养8小时后转种于克氏培养瓶中，再置37℃增菌培养24小时，分别供制备“O”“H”抗原菌液用。
（2）伤寒杆菌“H”抗原制备：用适量0.4%甲醛生理盐水冲洗刮下增菌培养后的菌苔，移入无菌三角瓶，置4℃冰箱4天固定杀菌。经普通液体培养基培养检验无活菌后，用生理盐水对照MC Farland比浊管将其稀释成5亿～10亿/ml的H抗原（菌液），4℃冰箱保存备用。细胞比浊方法见表1-10-1。
表1-10-1 MC Farland比浊管组成及相应菌数表
（3）伤寒杆菌“O”抗原制备：用适量生理盐水冲洗刮下菌苔，移入三角瓶，100℃水浴2小时杀菌，经检验无活菌后再用生理盐水按上法稀释成5亿～10亿/ml的“O”抗原（菌液），4℃冰箱保存备用。
（4）免疫动物：①选择2.5kg的健康家兔，耳静脉抽少量血液分离血清，检测有无与伤寒杆菌相关的抗体。②将适合的家兔分成两组，按表1-10-2程序分别用伤寒“H”和“O” 抗原进行免疫注射。③末次注射后1周试血，从兔耳静脉抽少量血液分离血清，与相应菌液做试管凝集反应，若抗体效价达到1∶1280以上，即可收取血清。若抗体效价偏低，可再用相应抗原3ml强化免疫1～2次后收取血清。
表1-10-2 伤寒杆菌“H”和“O”抗原免疫家兔程序
（5）收取免疫血清：收取免疫血清采用兔心脏采血。兔左侧胸部剪去被毛，消毒，从左前腋水平向上2～2.5cm（3～4肋间），可摸到心脏跳动，即为体表进针点，但不可于心脏跳动最明显处为进针点，因为从体表感到心跳最明显处为心尖而非心室，进针后针头偏向胸骨并与水平面呈45°，当深入约3.5cm可抽血。
将采集的血液置37℃培养箱1小时，再放入4℃冰箱过夜，待血凝块收缩后吸出血清，经2000r/min离心20分钟除去沉淀的红细胞，56℃水浴30分钟灭活补体，测血清效价后加0.01%硫柳汞防腐，密封分装，低温保存备用。
实验结果
参照实验一（试管凝集试验）。
注意事项
细菌接种严格执行无菌操作。
注意事项
（1）预防、治疗感染性疾病（特异性较差，可发生超敏反应）。
（2）临床诊断。