第一篇　医学免疫学实验

实验一　抗原抗体凝集反应

一、直接凝集试验

实验目的

1.掌握　玻片凝集试验和试管凝集试验的原理。

2.熟悉　常见凝集试验方法及临床意义。

基本原理

颗粒性抗原与相应抗体在适当的条件下结合，可出现肉眼可见的凝集物，称直接凝集反应。通过观察是否出现可见的抗原抗体凝集物，用已知的抗体（或颗粒性抗原）检测相应的颗粒性抗原（或抗体）。

实验内容

（一）玻片凝集试验

1.材料

（1）抗体：1∶40抗伤寒杆菌诊断血清。

（2）抗原：伤寒杆菌斜面培养物、大肠杆菌斜面培养物。

（3）生理盐水、载玻片、取菌环等。

2.方法

（1）取载玻片1块，平均分成3个格；右侧加生理盐水1滴，中间及左侧无菌操作各加1∶40抗伤寒杆菌诊断血清1滴。

（2）用接种环无菌操作取伤寒杆菌斜面培养物少许，分别与生理盐水及中间1∶40抗伤寒杆菌诊断血清混匀。同法取大肠杆菌斜面培养物与左侧1∶40抗伤寒杆菌诊断血清混匀。

3.结果　轻轻晃动载玻片，1～2分钟后，观察结果，出现细小凝集块者即为阳性反应，均匀混浊者为阴性反应。

4.注意事项

（1）在载玻片上涂细菌时，注意要先在生理盐水中涂菌，后在血清中涂菌，避免将血清误带入生理盐水中。

（2）操作过程中严格执行无菌操作。

5.临床意义　玻片凝集试验为定性试验，其操作简便、反应迅速，但敏感性相对较低。玻片凝集试验是常规ABO血型鉴定和细菌菌种鉴定的实验。

（二）试管凝集试验

1.材料

（1）抗体：免疫血清（1∶10抗伤寒杆菌“H”抗体）。

（2）抗原（诊断菌液）：伤寒杆菌鞭毛（H）抗原（用比浊法调至9亿/ml）。

（3）生理盐水、小试管7支、1ml和5ml吸管、56℃水浴箱或37℃培养箱等。

2.方法

（1）取洁净的小试管7支，排列于试管架上，依次编号；于各试管中加入生理盐水0.5ml。

（2）吸取免疫血清0.5ml，加入第1支试管中，充分混合，吸出0.5ml放入第2支试管；混合后取出0.5ml于第3支试管中；以此类推直至第6支试管，混匀后吸出0.5ml弃去。第7支试管不加血清，作为生理盐水对照。第1支试管至第6支试管的血清初始稀释度为：1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640。这种稀释方法称为连续倍比稀释法。

（3）每支试管各加入诊断菌液0.5ml，至此每支试管内的血清稀释度又增加了1倍。

（4）摇匀后，置56℃水浴箱中2～4小时、再置4℃冰箱过夜，或置37℃培养箱中18～24小时，观察结果。操作程序见表1-1-1。

3.结果

（1）抗原对照试管：上清液混浊，可有少量细菌沉于管底，呈圆点状，边缘整齐。若轻摇，细菌散开仍呈混浊状态。

（2）“H”凝集特点：“H”凝集则为絮状凝块，振摇后呈絮状沉淀物。

（3）根据凝集程度分级，以“+”的多少表示：

++++：细菌全部凝集沉于管底，上层液体澄清透明。

+++：约75%的细菌凝集沉于管底，上层液体轻度混浊。

++：约50%的细菌凝集沉于管底，上层液体中度混浊，呈半透明。

+：约25%的细菌凝集沉于管底，上层液体较混浊。

-：不凝集，液体混浊度与抗原对照管相同。

（4）血清凝集效价（滴度）：以出现明显凝集（++）的血清最高稀释倍数为血清的凝集效价。

（5）报告方式：如实报告“H”血清效价。如血清最低稀释度仍无凝集现象，报告阴性；如血清最高稀释度显“++”或“++”以上凝集者，则应报告高于1∶1280。

4.注意事项

（1）只有当抗原抗体比例适当时才会出现肉眼可见的凝集反应。血清浓度的稀释度越低，凝集反应越弱。反应中如果抗体浓度过高，则不会出现凝集反应，此为前带现象。

（2）温度、pH、电解质等因素对反应结果均有影响。在加入抗原抗体后，要充分混匀以促进抗原抗体间的接触。

5.临床意义　试管凝集试验是半定量凝集试验，其操作简单，但敏感性较低。临床上试管凝集试验主要用于诊断伤寒和副伤寒（肥达试验）、诊断斑疹伤寒与恙虫病（外斐反应）等。

二、间接凝集试验

实验目的

1.掌握　间接凝集试验的原理。

2.熟悉　间接凝集试验的方法及临床意义。

基本原理

可溶性抗原与相应抗体直接反应是不出现凝集现象的，但将可溶性抗原结合在与免疫无关的颗粒载体表面形成致敏颗粒后，再与相应抗体反应，则会出现凝集现象，称为间接凝集反应。如果是将抗体结合于颗粒载体表面从而应用于检测相应抗原，则称反向间接凝集试验，其试验操作与间接凝集试验基本一致。实验室常用的载体有人“O”型红细胞、绵羊红细胞、乳胶颗粒等。若颗粒载体是红细胞，称间接凝集试验；若颗粒载体为乳胶颗粒，则称为乳胶凝集试验。本次试验为乳胶凝集试验。

实验材料

待检血清、抗链球菌溶血素“O”试剂盒（溶血素“O”包被的乳胶颗粒试剂5ml，阳性对照血清0.5ml，阴性对照血清0.5ml）。

实验方法

（1）试剂使用前，平衡至室温。轻轻混匀乳胶颗粒试剂，核对阴性和阳性对照。

（2）在反应板孔中加1滴待检血清（50μl），然后加1滴乳胶颗粒试剂在血清中，搅匀、轻轻摇动使其充分混合，2分钟后观察结果。

（3）阳性和阴性对照同前文。

实验结果

本次所用的乳胶颗粒试剂是由溶血素“O”包被乳胶颗粒，并校正测定灵敏度至抗溶血素“O”抗体（ASO）＜200U/ml，超过上述含量即出现肉眼可见的凝集颗粒。出现凝集现象即可判断样本中ASO＞200U/ml，阳性；无凝集出现可判断样本中ASO＜200U/ml，阴性。

注意事项

（1）加乳胶颗粒试剂和阴性、阳性对照血清时，保证液滴大小一致。

（2）试剂盒应贮存于2～8℃的环境中，受热会导致试剂阳性率偏高，切勿冷冻。

（3）待检血清与阴性、阳性对照血清必须小心处理，严格执行无菌操作。

临床意义

间接凝集试验具有敏感性高、快速、简便等优点，在临床上得到了广泛的应用。如用乳胶凝集试验测定相关抗体，可用于辅助诊断类风湿关节炎、钩体病、血吸虫病等。

三、间接凝集抑制试验

实验目的

1.熟悉　间接凝集抑制试验的原理。

2.了解　间接凝集抑制试验的方法和临床意义。

基本原理

间接凝集抑制试验是利用已知抗原致敏的颗粒与待测标本中可溶性抗原竞争有限抗体的经典血清学方法。将可溶性抗原与相应抗体混合，再加入抗原致敏的颗粒性物质（如乳胶颗粒），则能抑制凝集现象。间接凝集抑制试验常用于检测抗体、自身抗体、变态反应抗体，也可检测抗原。本次试验以妊娠免疫试验为例。

实验材料

人绒毛膜促性腺激素（HCG）致敏乳胶颗粒试剂、抗HCG血清、生理盐水（阴性样本）、孕妇尿液标本（阳性样本）及待检尿液，以及载玻片、滴管、玻璃棒等。

实验方法

（1）所有试剂使用前先平衡至室温。

（2）取载玻片1块，平均分成3个格，同时标记好阳性、阴性及待测标本记号。

（3）用滴管吸取孕妇尿液标本（阳性样本）1滴置于载玻片的左侧格，中间及右侧分别加1滴生理盐水（阴性样本）及待检尿液。

（4）在载玻片上的3个格均加抗HCG血清1滴，轻轻摇动载玻片，使其充分混匀，反应1分钟。

（5）再在3个格中各滴加HCG致敏乳胶颗粒试剂1滴。

（6）用玻璃棒搅动混匀，缓慢摇动载玻片2～3分钟后观察结果。

实验结果

生理盐水（阴性样本）对照侧应出现明显凝集颗粒，而加入孕妇尿液标本（阳性样本）的试验侧呈均匀乳白状。待检尿液若出现凝集，表明HCG阴性，如仍呈均匀乳白状则为HCG阳性。

注意事项

（1）孕妇尿液标本最好为晨尿（晨尿HCG含量高），在使用前先经37℃水浴并充分混匀。

（2）吸取样品的器具不能交叉使用。

（3）试验过程中严格注意标本及各试剂的加入顺序。

临床意义

间接凝集抑制试验在临床上常用于疾病的早期诊断，如检测血清中的乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）等，同时亦可用于妊娠检测。