胚胎干细胞与早期胚胎细胞形态类似，体积小、胞核大，有一个或者多个核仁，胞质少，细胞质内细胞器较少。电子显微镜下胚胎干细胞大小均一，表面光滑，细胞呈层叠式。体外培养时，胚胎干细胞呈集落状生长，形成致密、折光性强和边界清晰的细胞集落，集落形态多呈岛状或鸟巢状。集落内细胞排列致密，没有明显的胞间界限，边缘可见少量扁平上皮细胞或成纤维样细胞。ES细胞经碱性磷酸酶染色呈棕红色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清。人胚胎干细胞和其他哺乳动物胚胎干细胞具有相似的形态和结构特征，不同类型的胚胎干细胞结构特征稍有差别。一般人类胚胎干细胞集落不如小鼠胚胎干细胞致密，且人胚胎干细胞及某些灵长类动物的胚胎干细胞形成的细胞集落想对较为扁平、松散，容易被胰蛋白酶消化成为单个细胞。

胚胎干细胞源于早期胚胎细胞，即使在体外长期培养、冻存解冻后仍能保持二倍体核型，不影响其非分化增殖能力，这是胚胎干细胞鉴定的重要指标之一。Thomson分离得到的5个细胞系中，H1、H7、H13和H14经过反复冷冻、复苏培养5到6个月后仍然能保持正常的核型。Shamblott等分离的人胚胎干细胞传至8～10代( 60～70天)时核型依然正常，检测其中5个样品，3个为XX核型、2个为XY核型，核型至少在10代内保持稳定。有人认为一个成系的胚胎干细胞系应具有70%以上核型完整的细胞。相反的实验证据也显示，随着胚胎干细胞在体外培养的延续，染色体发生变异的细胞将随之增加，完整核型细胞所占比率趋向于减少，主要表现为染色体数目增加、性染色体缺失、断裂等，而胚胎干细胞核型发生变异将导致其嵌合能力降低。胚胎干细胞保持核型完整与多种因素有关，如饲养层细胞类型、细胞传代程序、培养液构成及其稳定性、细胞来源性别以及小鼠品系等。目前建立的大多数小鼠胚胎干细胞系都是XY型，XY型小鼠胚胎干细胞比XX型的核型容易维持。XX型胚胎干细胞系在传代过程中常发生一条X染色体缺失，不容易维持其二倍体核型，2条X染色体存活似乎对细胞增殖不利。人胚胎干细胞维持核型完整的难易程度，在细胞性别上还没有发现明显的差别。受精后，单一细胞的胚胎顺输卵管而下，在经历了一系列分裂后最终成为一个桑葚胚。在囊胚形成过程中，桑葚胚的外细胞层从剩余的胚胎中分层形成外滋养层，囊胚的内细胞团将发育成为胎儿的所有组织(内胚层、中胚层、外胚层)和一些胚胎外组织，滋养外胚层发育成为发达的海绵状组织结构。

胚胎干细胞为未分化多能性细胞，能够表达一些特异性的表面标志物，包括胚胎干细胞关键蛋白( Oct-4)、碱性磷酸酶、早期胚胎细胞及胚胎癌细胞的表面抗原。

Oct-4是由Pou5f基因编码产生的，属于含POU( Pit-Oct-Unc)结构域的转录因子家族。它通过结合含有AT-GCAAA的八聚体结构域而活化相应靶基因，激活或抑制干细胞分化过程中基因表型的转变。研究表明Oct-4在干细胞中具有较强特异性表达，它参与调节胚胎发育过程中的多向性分化。Oct-4最早表达于胚胎8细胞时期，一直到细胞发育到桑葚胚期时，在每一个卵裂球中都检测到大量的Oct-4表达产物。此后，其表达局限于内细胞团( Inner cell mass，ICM)，当原肠形成后，胚胎内唯一检测到Oct-4表达的是原始生殖细胞。体外培养的未分化多能干细胞中Oct-4的表达也为强阳性。在未分化的人胚胎干细胞中高表达，但分化后下调，小鼠中也有相似的现象。因此其成为检测细胞具有多能性的一个标志分子。Oct-4不仅在多能性胚胎干细胞和原始生殖细胞中表达，而且在某些恶性生殖细胞肿瘤中也表达Oct-4。因此Oct-4可以作为生殖细胞肿瘤中某些恶性类型的特异性标志物，也可以作为该类肿瘤进行靶向治疗的新靶点。

碱性磷酸酶( Alkaline phosphatase，AKP)是一类单酯磷酸水解酶，能在碱性条件下水解磷酸单酯，释放出磷酸。通常在胚胎细胞或卵裂球以及一部分成体细胞(如成骨细胞、肠上皮细胞)中表现高的活性，多数分化细胞不表现碱性磷酸酶活性。来源于囊胚ICM的胚胎干细胞、胚胎癌细胞( embryonic carcinoma cell，ECC)和胚胎生殖细胞( embryonic germ cells，EGCs)也表现较高的AKP活性。这些多潜能性细胞发生分化后，AKP活性随之降低或消失。因此，尽管AKP不是多潜能性细胞的特异表达，但AKP活性检测仍广泛用于鉴定人、小鼠胚胎干细胞、EGCs，因而也是确定这些细胞是否处于未分化状态的标志之一。

目前尚未发现小鼠和人胚胎干细胞专一表达的标志抗原，现在用于鉴定小鼠、人或其他动物胚胎干细胞的标志抗原，全都是原来用于确定ECCs和造血干细胞的表面抗原。胚胎干细胞分别来源于囊胚ICM、胚胎卵裂球和胎儿原始生殖细胞( primordial germ cell，PGC)因此，胚胎干细胞具有类似于早期胚胎细胞的抗原表达模式，胚胎细胞的抗原标志是鉴定胚胎干细胞的重要指标。随着胚胎干细胞分化，多潜能性丧失，其抗原表达模式随之发生变化。目前用于鉴定胚胎干细胞的表面抗原主要是特定阶段胚胎抗原( stage-specific embryonic antigen，SSEA)和肿瘤识别抗原( tumor recognition antigens，TRA)

SSEA是一类系列连环状糖酯蛋白，用于鉴定胚胎干细胞的SSEA有三型，分别为: SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4。SSEA-1和SSEA-4为小鼠ECCs制备的单克隆抗体所识别，SSEA-3为小鼠胚胎细胞制备的单抗所识别。SSEA-1在小鼠8细胞胚胎至囊胚的各个发育阶段表达，桑葚胚表达最强，囊胚ICM和滋养层细胞也表达SSEA-1(在滋养层细胞的表达是瞬时的)，随后，SSEA-1限定在胚胎外胚层、卵圆柱阶段胚胎脏器内胚层和8. 5～14. 5天小鼠胚胎PGCs中表达。现已确定小鼠胚胎干细胞和EGCs表达SSEA-1，不表达SSEA-3、SSEA-4，分化细胞不表达SSEA-1。SSEA-1是公认的鉴定小鼠胚胎干细胞和EGCs的标志抗原。

TRA也被称为硫酸角质素相关抗原( keratan Sulfate-related antigens)是鉴定人和小鼠胚胎干细胞的标志抗原，其中最常用的是TRA-1-60和TRA-1-81，被用作鉴定人胚胎干细胞和EGCs的标志。现已确认小鼠多潜能细胞均不表达TRA系列抗原。

CD9是造血干细胞的一种表面标志抗原，属于四型跨膜超家族蛋白分子。现已确认人胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠EGCs都表达CD9。Oka等报道随着小鼠胚胎干细胞分化，CD9抗原及其mRNA的表达随之减少，培养液中添加CD9抗体能阻止小鼠胚胎干细胞集落形成。

胚胎干细胞通常增殖较为迅速，小鼠的胚胎干细胞一般每12小时分裂增殖1次，而人的胚胎干细胞生长相对缓慢些，通常每36小时分裂1次。胚胎干细胞的细胞周期与已经分化的体细胞的细胞周期有所不同。在细胞周期的整个过程中，细胞大多数时间处于S期，进行DNA合成，G1、G2期很短。

胚胎干细胞是一种高度未分化的多潜能干细胞，在一定条件下能在体外向各个胚层分化，目前已广泛用于体外定向诱导分化的研究。体外培养条件的诸多因素都会影响胚胎干细胞的生长，如培养基、血清、各种添加剂、溶液的pH值、温度、CO ₂的质量、饲养层的种类及状态等，不利的因素会导致胚胎干细胞在体外培养过程中发生分化，丧失二倍体核型，进而失去全能性。因此稳定、高效的胚胎干细胞分离培养体系，对于提高胚胎干细胞建系的成功率有着重要意义。

胚泡的质量直接影响胚胎干细胞的分离培养，研究者们获得胚泡的方法不尽相同，主要包括以下方法①自然状态下合笼获得正常胚泡;②延迟着床方法获得延迟胚泡，该方法所得的ICM在增殖方面明显地优于正常的胚泡，但是得到的胚胎数目少、处理过程也较为繁杂;③超排卵法得到超排卵胚泡;即通过给母鼠注射性激素，人为制造性周期后与公鼠合笼获得胚泡。该方法可用较少的实验动物得到较多的胚泡。可以节约实验成本，而且母鼠受精时间易于控制，同时也不影响胚胎干细胞的克隆率。

饲养层能够抑制胚胎干细胞的分化，一般认为是由于饲养层可以分泌白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor，LIF)以及α-成纤维细胞生长因子(α-fibroblast growth factor，α-FGF)β-成纤维细胞生长因子(β-fibroblast growth factor，β-FGF)前者释放到培养基中，后两者结合在饲养层的细胞膜上。胚泡在有饲养层存在时的48小时贴壁率较无饲养层时明显提高，两者差异有显著性意义。饲养层在体外模拟了体内子宫内膜的角色，为胚泡的“着床”提供依托，饲养层与胚泡间的相互黏附也起到一定作用。饲养层不仅可以分泌溶解型的LIF，同时还可分泌结合型LIF，后者对于胚泡的发育具有更大的作用。胚泡在含量丰富的LIF的作用下，ICM迅速发育增大，从而促进胚泡的贴壁。因此，原代分离胚胎干细胞时，最好应用饲养层以提高克隆率。