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第二节 组织工程学与再生医学的基本原理与研究内容
一、组织工程与再生医学的基本原理
组织工程与再生医学的基本原理是从机体获取少量的活体组织,用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来并在体外进行培养扩增,然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解和可吸收的生物材料按一定的比例混合,使细胞黏附在生物材料上形成细胞-材料复合物。将该复合物植入机体的组织或器官病损部位,随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收,植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质,最终形成相应的组织或器官,达到修复创伤和重建功能的目的。生物材料支架所形成的三维结构不仅为细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间,也为植入的细胞分泌细胞外基质并最终形成相应的组织或器官提供了一个良好的环境。这种组织工程技术可以有效地解决免疫排斥、病毒感染等问题,并且可以工业化生产,所以有着重要的临床价值和社会经济效益。组织工程的发展不仅提供了一种组织再生的技术手段,并且改变了外科传统的“以创伤修复创伤”的治疗模式,迈入无创修复的新阶段,而且也将改变传统的医学模式,使得再生医学得以进一步的发展并最终用于疾病的临床治疗。
组织工程与再生医学的核心是活的细胞,可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用,这是组织工程学研究的主要科学问题。种子细胞、可降解的支架材料与细胞生长调节因子并称为组织工程的三大要素。
到目前为止,组织工程学的研究主要包括以下3方面的内容:①细胞的培养和生长的研究;②细胞外基质替代物的研究;③组织工程化组织在各种病损组织中的替代研究。目前,组织工程学方法在皮肤、黏膜、肌肉、骨和软骨、血管、神经和角膜的研制方面已经取得了巨大进展,部分产品已经应用于临床,并获得了可喜的治疗效果与市场效益。
二、组织工程与再生医学的研究内容
(一)种子细胞
对细胞的研究是组织工程学研究中最基础的一步。组织由细胞和细胞外基质构成。与此类似,组织工程组织由功能细胞复合可降解材料组成,最终由细胞自行产生细胞外基质( ECM)逐渐代替降解的支架材料,从而形成活组织。可以认为,无论是在组织工程的研究中还是在组织工程组织的构建过程中,细胞始终是被关注的焦点。组织工程研究大量的工作在于细胞培养。因此,掌握细胞在体内和培养状态下的形态、功能、增殖是十分重要的。同时,掌握和探索细胞的分离、培养、传代技术和生长调控及建立标准细胞系都是组织工程学研究的基本需要和重要内容。
确定细胞的可靠来源是组织工程的首要前提。动物细胞是个可能的来源,但它们的安全性依然是个令人关注的问题,因为免疫系统对其排斥的可能性很高。基于这些原因,人类细胞是首选对象。对人类胚胎干细胞的研究提供了解决此问题的一种方法。但是,从能够操纵培养中的胚胎干细胞到能够生产可用于创造或修复特定器官的完全分化细胞,研究人员还有很长的路要走。
一个更直接的目标是从组织中分离出所谓的起源细胞。这种细胞向分化方向发展了几步,但因为它们尚未完全分化,因而具有足够的灵活性可以补充几种不同类型的细胞。例如,Arnold及其同事已从人类骨髓中分离出起源细胞,这种细胞在实验室中经过诱导能够形成成骨细胞或软骨细胞。培养“万能供体”细胞系可能是另一种方法。为了得到这种细胞,科学家要除掉或利用其他分子去盖住细胞表面的将供体细胞视为“异己”的蛋白质,马萨诸塞州Diacrin公司现正在采用这种策略制造人类可以接受的某些类型的猪细胞。从原理上讲,这些万能供体细胞不会遭到受体排斥,并可以无限繁殖。
在颌面部各突起的发育过程中,来源于神经管和表面外胚层结合处的神经嵴经过定向迁移、增殖,到达面突中胚层,称为外胚间充质。神经嵴来源的外胚间充质干细胞为多能干细胞,具有多向分化潜能,在体内多种调控因素的作用下,可分化为神经细胞、肌细胞、成骨细胞、成牙本质细胞、牙髓细胞、成牙骨质细胞等,并最终形成上下颌骨、颞下颌关节软骨、除釉质之外的牙齿等组织结构,因此和颌面部及牙齿发育关系密切。
干细胞的特性在于能定向分化和自我更新。体内干细胞的分化受多种因素的影响,非常复杂。在体外,已建立造血干细胞( HSC)、骨髓间充质干细胞( BMSC)、脂肪来源干细胞( ADSC)等成体干细胞的诱导分化体系。BMSC与ADSC等干细胞作为成体干细胞越来越受到重视,在组织工程和细胞的分化以及发育生物学研究中占有重要的一席之地。
BMSC与ADSC作为多能干细胞,其多向分化潜能已被证实。目前利用多种生长因子,已在体外成功诱导出神经胶质细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、成牙本质样细胞、色素细胞、树突状细胞等多种细胞。诱导条件分别为Forskoline,含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的矿化诱导液,TGF-β、rhBMP-2和TGF-β1、牙本质非胶原蛋白等。相信在不久的将来BMSC与ADSC等多种成体干细胞能为组织工程研究中成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、平滑肌细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、牙周膜细胞等提供可靠的细胞来源。
总之,种子细胞的研究内容包括:自体、异体、异种各种组织细胞的分离培养技术,细胞生物学行为的研究,多种细胞的复合培养技术;细胞因子的有序作用、信息传递及其调控;建立实验标准细胞系,改造种子细胞,延长细胞寿命及生长期;改变细胞表面结构,研究细胞黏附及抗黏附力的技术及其影响机制;研究降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受的方法,等。
(二)生物支架材料
生物支架材料是组织工程研究的关键。组织工程自1987年由美国国家基金会正式提出以来仅有20多年的历史,但却很快成为世界各国研究的热门课题。
器官和组织中的细胞,其行为不仅取决于细胞内在的基因序列,还在很大程度上受到外界环境因素的影响,包括细胞与支架材料的相互作用。支架材料不仅为细胞生长提供支持和保护,更重要的是细胞与支架材料的相互作用调节细胞的形态发生过程,影响细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。因此,在组织工程研究中挑选和制备利于种子细胞黏附、增殖和分化的支架材料是十分重要和迫切的任务。
理想的组织工程细胞外基质材料的要求有:①良好的生物相容性。除满足生物材料的一般要求,如无毒、无致瘤性等外,还应利于种子细胞黏附、增殖;降解产物对细胞无毒害作用;不引起炎症反应,甚至利于细胞生长和分化;②良好的生物降解性。基质材料在完成支架作用后应能降解,降解率应与组织细胞生长率相适应,降解时间应能根据组织生长特性做人为调控;③具有三维立体多孔结构。基质材料可加工成三维立体结构,孔隙率最好达到90%以上,具有较高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空间,利于细胞黏附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入、代谢产物排出,也有利于血管和神经长入;④可塑性和一定的机械强度。基质材料具有良好的可塑性,可预先制作成一定形状,并具有一定的机械强度,为新生组织提供支撑,并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性;⑤良好的材料-细胞界面。材料应能提供良好的细胞界面,利于细胞黏附、增殖,更重要的是能激活细胞特异性基因表达,维持细胞正常表型。
应用生物活性因子( HA、BGC、β-TCP等)和生物可降解聚合物( PLLA、PGA和PLGA等)研制组织工程支架材料中存在的某些问题,可以应用复合材料的原理加以解决。复合材料的最大优越性在于充分利用组分材料的性能,以两种或两种以上具有互补特性的生物可降解材料为组分材料,通过优化及仿生设计、模拟和实验验证,在此基础上可以研制出适用于不同组织器官所需的结构与性能优异的组织工程复合材料。因此,组织工程支架复合材料是今后组织工程材料研究发展的主要方向之一。