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第五节 心血管毒性生物标志物
据预测，到2020年心血管疾病将超过传染性疾病和癌症而成为导致死亡的主要原因，这不仅会出现在发达国家，同时也会在发展中国家出现。与治疗平行的方法是建立预防性策略，尤其是对高危个体的早期预防和诊断。尽管有许多传统的风险预测因子用于预测心血管疾病的发生、发展，但这些还无法完全解释心血管疾病在易感人群中的复发和遗传倾向。因此，相关替代方法或检测因子如心血管生物标志物的研究取得了快速的发展，目前在临床上广泛应用的心血管生物标志物有很多，另外，随着检测技术的不断进步，又开发出了很多新的生物标志物，根据主要的心血管系统疾病发病机制主要分为下面几类:①心血管炎症的标志物: C反应蛋白等;②粥样硬化斑块不稳定或破裂标志物:妊娠相关血浆蛋白A等;③血栓形成标志物:血栓前体蛋白、血小板选择蛋白等;④心肌缺血缺氧标志物:糖原磷酸化酶同工酶BB、脂肪酸结合蛋白、脑钠尿肽等;⑤心肌坏死的标志物:肌酸激酶-MB、心肌肌钙蛋白、肌红蛋白等。
一、目前常用的及国际上热门的心血管系统生物标志物
1.血脂( blood cholesterol)
临床常规血脂测定一般包括总胆固醇( TC)、甘油三酯( TG)等，脂蛋白测定包括高密度脂蛋白( HDL)、低密度脂蛋白( LDL)等。其中血清总胆固醇和甘油三酯是临床诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称“冠心病”)的最灵敏的生物标志物之一。当血清总胆固醇达到或超过5. 72mmol/L，甘油三酯达到或超过1. 70mmol/L，则可以分别诊断为高胆固醇血症和高甘油三酯血症，两者均异常升高则称混合型高脂血症。高密度脂蛋白胆固醇，如果低于0. 91mmol/L也属血脂代谢紊乱，称为低高密度脂蛋白血症。
2.肌酸激酶( creatine kinase，CK)
肌酸激酶为细胞内重要的能量代谢酶，分布广泛，以肌细胞中最多，由两个亚基组成二聚体，有两种亚型，CK-MB 1(血清型)和CK-MB 2(组织型)。当发生心肌损伤时CK-MB 2释放入血。CK-MB 2/CK-MB 1比值变化是反映心肌损伤较好的早期生化标志物，其特异性优于肌红蛋白。
3.心肌肌钙蛋白( cardiac troponins，cTns)
心肌肌钙蛋白是心肌损伤标志物之一，属横纹肌功能蛋白，主要由TnT( troponin T)、TnI( troponin I)、TnC( troponin C)三个亚基组成，大部分以结合型形式存在于细肌丝中，少部分以游离形式存在于胞浆内。其中TnT及TnI是心肌特有的，与骨骼肌无交叉反应。cTnT在心肌胞浆中含量丰富，因其分子质量比CK-MB小，当心肌细胞发生微小损伤时，容易释放到血液中。心肌细胞中的肌钙蛋白T( TnT)和肌钙蛋白I( TnI)是存在于心肌细胞中的收缩蛋白，对心肌坏死或损伤有高度的敏感性和特异性，血液循环中肌钙蛋白的半衰期为15天。cTnT和cTnI是目前心肌损伤最具特异性的生物标志物。
肌钙蛋白I( cTnI)是近年来发现的高敏感性、高特异性，反映心脏坏死的标志物。在健康人的血液中几乎无法测到cTnI，在心肌细胞受损早期，游离于胞浆中的cTnI快速释放入血液循环，平均4～6小时升高，其后以结合形式存在的cTnI不断释放入血，12小时达到高峰，可持续7天。另外，cTnI在诊断心肌损伤方面，特别在微小心肌损伤方面具有较高的敏感性和特异性。
4.乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase，LDH)
乳酸脱氢酶是一种能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的糖酵解酶。乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的细胞质内，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。LDH有五种同工酶，即LDH-1( H 4)、LDH-2( H 3M)、LDH-3( H 2M 2)、LDH-4( HM 3)及LDH-5( M 4)。LDH同工酶的分布有明显的组织特异性，正常人血清中LDH-2＞LDH-1。如有心肌酶释放入血则LDH-1＞LDH-2。乳酸脱氢酶活性增高可作为诊断心肌梗死的一个有用指标。
5.肌红蛋白( myoglobin，Mb)
肌红蛋白于1975年首先报道，和CK-MB亚型同列为早期标记物，主要存于横纹肌(心肌、骨骼肌)细胞中，在细胞膜的氧化功能中具有重要作用。因其为小分子物质(相对分子质量17 000～18 000Da)，当心肌细胞发生损伤时，Mb是最早进入血液的生物标志物，其扩散入血的速度比CK-MB mass或cTnI/cTnT更快，是用于心肌损伤的最佳早期标志物。
6.心脏型脂肪酸结合蛋白( heart type-fatty acid-binding protein，H-FABP)
心脏型脂肪酸结合蛋白( heart type-fatty acid-binding protein，H-FABP)是由132个氨基酸残基组成的酸性蛋白质，相对分子质量为14. 5kDa，是长链脂肪酸的载体，参与细胞内脂肪酸转运，在心肌脂肪酸代谢中起作用。广泛存在于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑、骨骼肌等多种细胞中，目前，已鉴定出9种不同类型的FABP，其蛋白质序列有较大的同源性。H-FABP是心脏细胞细胞质中含量最丰富的蛋白质之一，心肌受损时H-FABP可以很快地释放出来，受损心肌的多少是血中H-FABP浓度升高程度的直接原因，可作为早期诊断心肌梗死程度的有效标志物。H-FABP还可用来检测心力衰竭或心绞痛中的微小心肌损伤，评估梗死面积，判断急性心肌梗死( AMI)患者再灌注后是否成功等。在早期诊断AMI的敏感性和特异性与Mb(肌红蛋白)相近。
7. C反应蛋白( C-reactive protein，CRP)
C反应蛋白( CRP)由炎性淋巴因子(白介素-6)刺激肝脏和上皮细胞合成(相对分子质量为115～140kDa)，属于正五聚蛋白家族，由五个相同的多肽亚单位组成，正常情况下在血清/血浆中含量极低，正常人中低于10mg/L;而当炎症或组织损伤48小时，含量即可达到350～400mg/L，消除半衰期为4～9小时，它是炎症的一种非特异性但敏感的生物学指标，是心肌损伤标志物之一。近年来的大量研究发现其与心血管疾病包括冠心病、脑卒中及外周动脉疾病等有关，对冠心病的发病率、病死率、预后具有重要的独立预测价值。另外，CRP本身可以促进单核细胞释放组织因子，该因子是外源性凝血途径的重要启动因子，其释放的增加势必加强局部血栓的形成，CRP也是动脉粥样化血栓形成疾病的介导和标志物。
8.血小板选择蛋白( platelet-selectin，P-selectin)
血小板选择蛋白是膜糖蛋白，血小板激活后，其迅速在血小板表面表达并促使血小板聚集，同时被剪切成可溶形式入血。不论是以膜糖蛋白的形式还是可溶的形式，P-selectin均可作为血栓形成并诱导急性心肌梗死( AMI)发生的标志物。
9.妊娠相关血浆蛋白A( pregnancy associated plasma protein-A，PAPP-A)
PAPP-A是由胎盘合体滋养层和蜕膜细胞产生的分子量为8000kDa的一种大分子糖蛋白，属α 2巨球蛋白，由2个PAPP-A分子与2个嗜伊红主要碱性蛋白前体( proform of eosinphil major basic protein，proMBP)组成的异构聚合体。作为一种在妊娠期间母体血浆中逐渐增多的大分子糖蛋白的化合物，目前主要用于孕妇唐氏综合征产前筛查，是一种灵敏度高、特异性强的血清标志物。
研究发现，PAPP-A还是一种潜在的促动脉粥样硬化的锌结合的基质金属蛋白酶，依赖胰岛素样生长因子( insulin like growth factor，IGF-I)特异地裂解胰岛素样生长因子结合蛋白4( IGF binding protein-4，IGFBP-4)，从而释放出具有生物活性的IGF-I，参与急性冠状动脉综合征( ACS)的发生发展;其在血浆中水平的升高，对于不稳定型心绞痛或急性心肌梗死有诊断价值，已列为冠心病患者炎症血清生物标志物。
10.心房钠尿肽( atrial naturietic peptides，ANP)和脑钠尿肽( brain naturietic peptides，BNP)
ANP、BNP隶属于钠尿肽系统( NPS)，钠尿肽系统由ANP、BNP、C型钠尿肽( C-type natriuretic peptide，CNP)和树眼镜蛇属钠尿肽( dendroaspis natriuretic peptide，DNP)四种肽类组成。钠尿肽是心血管系统分泌的肽类，这一系统通过利尿利钠调节体液平衡，降低后负荷，舒张血管，并通过旁分泌/自分泌的方式抑制心肌细胞肥大，减缓心室重构，发挥着重要的代偿作用。而在人体中，则以心房钠尿肽、脑钠尿肽含量最高。
ANP主要是在心房合成、储藏并分泌入血液，在心房中分布量最大，而在心室中含量则较少，心房中ANP的含量约是心室中的100倍。刺激ANP合成、分泌的因素主要为心房的牵张，另外有摄盐、站位、运动、扩容、心率加快及神经体液因素等，而ANP的释放是压力对心房肌的直接作用。ANP在体内的半衰期很短，仅为2. 5分钟，主要在肝脏、肾脏、肺脏、骨骼肌和血管等脏器组织清除。
BNP是由心室分泌的天然激素，主要在心室表达，同时也存在于脑组织中。BNP以激素原的形式分泌，然后等比例分解成BNP分子和NT-proBNP，由于NT-proBNP代谢速度较BNP慢，因此血中NT-proBNP浓度高于BNP。NT-proBNP的半衰期为60～120分钟，而BNP仅为20分钟。BNP的释放与心力衰竭程度密切相关，心力衰竭程度加重，BNP的释放增加。BNP的主要生物学作用是参与钠调节，促进尿钠排泄和利尿，扩张血管，维持血压的动态平衡，同时拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统使心排出量增加。现已发表的研究资料显示，BNP是目前唯一一个最好的用于评价心力衰竭的实验室检测指标，欧洲心脏协会( European Society of Cardiology，ESC) 2001年的心力衰竭诊断指南中心已将其作为实验室检测项目中的唯一指标。
11.微量白蛋白尿( microalbunminuria，MAU)
微量白蛋白尿是指尿中白蛋白含量超出健康人参考范围，但不能用常规的方法检测出这种微量的变化。为了使这一检测指标标准化，国际上采用白蛋白分泌率表示尿中白蛋白的排出量。健康人MAU在＜20～30mg/24h(或＜20～30μg/min)的范围内; MAU在20～300μg/24h时称其为MAU; MAU＞300mg/24h时称其为大量白蛋白尿。MAU排出量增加是疾病早期的改变，对疾病的早期诊断、早期治疗有重要的参考价值和临床意义。大量的临床研究表明MAU是预测糖尿病、高血压、心血管疾病血管损伤的敏感指标。
12.脂蛋白相关磷脂酶A2( lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)
Lp-PLA 2 是PLA 2超家族中的一员，属于Ⅶ型PLA 2，也称血浆血小板激活因子乙酰水解酶，该酶含有441个氨基酸，相对分子质量为50kDa。人血浆中70%的Lp-PLA 2与LDL结合，30%与高密度脂蛋白结合。Lp-PLA 2能水解LDL分子中氧化修饰的磷脂，产生溶血磷脂酰胆碱和氧化的游离脂肪酸，后两者都具有很强的促炎症作用，导致血管内皮损伤，引起动脉粥样硬化。Lp-PLA 2不仅是炎症和冠心病的风险标记物，而且促进炎症和动脉粥样硬化，是动脉粥样硬化形成的一个关键性酶。除传统的脂类分析外，血浆Lp-PLA 2的水平被视为一个有效的新的冠状动脉疾病( CAD)诊断指标。
二、影响心血管毒性生物标志物的因素
发挥功能的心血管系统实际上处于一个动态平衡之中。在对心血管系统进行研究的过程中，有几个非特异性因素能够显著影响与心血管相关的生物标志物在实验动物中的评价结果，尤其是许多心脏生物标志物在循环系统中有限的半衰期、采样时间、血液样本采集方法、年龄、保存条件以及禁食等。因此，需要根据所研究指标的不同而应该采取不同的方法来进行。
(一)采样时间
对于采样时间，尤其是对于啮齿类动物，其本身血液量较少，因此应避免频繁采血，同时根据所获信息的类型、预期对心血管的损伤及待测定动物种属的行为等来设定采样时间。如果没有这些信息可能很难获得最佳的采样时间。
(二)血液样本采集方法
血液样本采集方法也是一个很重要的变量。在一项研究进行过程中应尽量保持方法的一致性，并且尽可能将不良影响降到最低。此外，给药及采血时对于动物的捉持方法和程度、所使用麻醉剂的类型等均可影响一些生物标志物的测定结果。
对于清醒状态下的动物，当对其进行抓取、给药或进行其他相关操作时，可能会导致动物血浆中儿茶酚胺的浓度急剧增加，从而导致动物的动脉血压和心率发生变化。对于麻醉状态下的动物，麻醉可能对它们的心血管系统产生广泛的影响，且这些影响还会因所选择的麻醉剂及所研究的动物品系的不同而改变。例如，在自发性高血压大鼠( SHR)和Wistar-Kyoto大鼠( WKR)之间，给予不同的麻醉剂可出现明显的差异。还有，使用戊巴比妥钠对动物进行麻醉期间，动物的出血所导致的动脉血压变化也与同一只动物在清醒状态下的血压明显不同。同样，在麻醉状态下，一些心血管系统参数如心排出量、心室效能、微血管速率及脑灌注等也会受到影响。
(三)年龄
在大鼠试验中年龄因素也是一个关键性的因素，因为老年大鼠可能会显示出更高的心血管病理病变的发生率，而且对于受试物对心血管的影响具有更高的敏感性。
(四)保存条件
生物标志物保存稳定性条件影响其生物学活性。短期或长期在－20℃或－70℃下保存内源性生物标志物时，可能对其带来很明显的影响，例如可能导致其发生聚集反应、降解反应或丧失功能活性。
(五)其他
文献报道，禁食操作也是影响肌肉损伤的非特异性生物标志物之一。同时，在采样前无论是否进行了禁食操作，每次采样间隔都应与之前的采用间隔保持一致性。
近年来，心血管毒理学发展迅速，新技术、新方法层出不穷。尤其是在心血管生物标志物的开发、研究方面进展喜人，作为一个朝阳产业具有一个光明的未来。随着一系列新的生物标志物的开发、鉴定，必将对于一些心血管疾病提供更早、更准确的预测或诊断。通过遗传学、蛋白组学、代谢组学技术以及其他大众认可的技术的应用，心血管生物标志物必将走出“婴儿期”，从而进入更加成熟的阶段。此外，心血管毒理学并不是单一的学科，还会随着其他相关学科如安全性药理学等的发展而发展。而且对于安全性药理学中所使用的一些技术方法如植入式或非植入式遥测电生理信号采集系统等，都可以应用到心血管系统的安全性评价中去。相信随着未来国际及国内相关指导原则的不断推出和完善，新技术、新方法的不断广泛应用，药物心血管毒理学研究的内涵会越来越丰富。
(王三龙)