在检测毒物诱发肝损伤时，采用科学的试验设计和敏感的检测方法，不但能够评价毒物导致肝损伤的程度，而且还能评价肝损伤的性质。评价肝损伤的模型通常分为体内评价模型和体外评价模型。体内评价模型主要是通过将肝毒物给予受试动物，然后进行各种生物检测，如进行血液学、血清生化检查、肝脏排泄与分泌功能测定、肝脏化学组成分析以及组织病理学检查等。体外评价模型主要是指采用某种试验技术从动物机体中分离出肝、肝细胞或肝细胞的亚细胞结构，让其在体外与肝毒物接触一定时间，然后进行各种检测，如肝细胞原代培养与肝细胞毒性试验等。

体内评价模型主要是通过整体动物的染毒模拟和预测毒物在人类的暴露。利用整体动物进行肝毒性评价有几个独特的优点:整体动物具有正常完整的生理功能，从毒物摄取和传递给靶器官到这些毒物在肝内和机体的其他部位的代谢和分布功能都是完整无缺的。假如某种毒性反应是依赖于较远器官对毒物代谢的代谢产物时，这一点就显得特别重要，例如小肠菌群可导致某些化学物的活化。此外，整体动物试验是全程评价慢性毒性反应的唯一体系，例如，肝硬化和肿瘤的诱导至少需要几个月，不可能通过肝灌流和肝细胞培养来实现。因此，鉴于整体动物试验能够较为全面反映化学毒物对人体的毒性作用，并能长期动态观察生物机体对毒物的反应，目前在肝毒物的危险度评价中仍然被广泛应用。

在肝毒理学动物试验中，最常用的受试动物为大鼠和小鼠，其次为仓鼠、豚鼠、兔和犬等。但选择动物时，要考虑所选动物对受试肝毒物的敏感性，如豚鼠对氯二丁烯肝毒性的敏感性高于大鼠。敏感动物种类可通过查阅文献或预试验确定。动物染毒应尽量选择与人接触化学毒物相同的途径，其中经口染毒最为常见。由于吸入染毒相对麻烦，有时也可用腹腔注射与经口染毒代替。

根据引起肝损伤的毒物类型的不同，通常将毒理学试验中常用的肝损伤动物模型分为化学性肝损伤模型、药物性肝损伤模型、免疫性肝损伤模型和酒精性肝损伤模型。此外，根据肝损伤的周期和病变特点，又可分为急性肝损伤和慢性肝损伤。表6-2总结了常见的文献报道利用不同毒物成功造模的肝损伤模型的相关信息。

肝损伤的体内评价试验的检测方法通常有四种方法:

如实验室常用的天冬氨酸氨基转移酶( AST)、丙氨酸氨基转移酶( ALT)、谷氨酸脱氢酶( GDH)、山梨醇脱氢酶( SDH)、乳酸脱氢酶( LDH)、碱性磷酸酶( ALP)、5’-核苷酸酶( 5’-NT)等，具体这些酶的特点和评价可参考下一节肝毒性生物标志物。

进入体循环的化学物质可经肝以原形或者在肝细胞内转化后排泄。其中最常用的方法有血清磺溴酞钠( BSP)排泄试验和吲哚菁绿( ICG)试验。肝衰竭时BSP和ICG从血中消失时间延长，通过测定血浆BSP的清除率可以评价肝功能损伤程度。

肝脏化学成分的分析可以对肝损伤进一步定量，并有助于阐明肝损害机制，包括肝脂质含量、脂质过氧化产物、蛋白质合成、DNA合成与复制和活性代谢产物的测定。

在整体动物肝毒性评价中，肝的组织病理学检查是评价化学物造成肝损伤的重要手段之一，通常包括动物的大体病理学检查、肝脏脏器系数变化、组织病理学检查，必要时可结合电镜检查，观察毒物引起的各种亚细胞结构的精细变化。

目前，原代培养的肝细胞体系仍然是用于新药评价首选的体外模型。在特定的培养条件下，原代肝细胞保留着Ⅰ期和Ⅱ期代谢酶的活性，能够被外源物所诱导。然而，也有许多研究发现原代肝细胞不能保留或重建细胞极性，肝脏特异性基因的表达对一些药物的诱导不灵敏，因此不能准确反映药物在肝脏组织中的代谢。

原代肝细胞的培养条件十分严格。为了使肝细胞能保持肝脏特异性功能以及能与体内表达水平相当的基因表达，有许多文献报道了优化的培养条件，包括使用细胞外基质或复杂培养基［例如，胶原和(或) Matrigel ^，三明治形状］，用化学方法确定的培养条件(例如，在含丰富氨基酸的无血清培养基中加入低浓度的胰岛素和地塞米松)，联合培养肝细胞和其他类型细胞(例如，窦状隙细胞、肾上皮细胞和库普弗细胞)。

将原代大鼠肝细胞使用适当的培养基在Matrigel ^®上培养，能使肝细胞保留和维持长期活性，并能表达稳定分化的肝脏功能，例如具有Ⅰ期和Ⅱ期代谢酶以及对药物和化学物的反应能力。Matrigel ^®是一种可溶性的基膜，主要从一种含有丰富细胞外基质蛋白Engelbreth-Holm-Swarm ( EHS)小鼠肉瘤提取获得。这种复杂的基质主要由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、类肝素硫酸蛋白聚糖和巢蛋白在室温下能聚合产生类似于哺乳动物细胞基膜的生物活性基质。在此基础上，Dunn和其他学者提出了一种改良的三明治形状的细胞培养模型，将新鲜分离的肝细胞再悬浮，平铺于一种Matrigel ^®-Matrigel ^®体系中，并使用含有胰岛素和氢化可的松( 10 ^－7M)的无血清培养基进行培养。使用这种模型的一个优点就是在铺板开始和完成后均能够很好地监控Matrigel ^®的浓度。在细胞培养过程中，关于能够影响肝细胞形态和功能的细胞外基质浓度目前已经确定。研究发现在0. 35mg/ml浓度下大鼠肝细胞形成3D结构与腺泡结构相似;细胞变成立方形，带有清晰的管状网络和极化表型，并具有肝细胞的正常功能。在这些培养条件下，多种肝基因表达与体内表达结果相一致。大多数的大鼠细胞色素P450酶(如CYP1A、CYP2B、CYP3A和CYP4A)的mRNA水平在铺板后2～4小时诱导增加。而使用传统的原代肝细胞培养方法，在细胞培养24～48小时时则仍未观察到诱导反应。因此，使用这种优化的条件培养新鲜分离的大鼠肝细胞是十分有价值的，能够准确地用于评价化学物诱导的大鼠细胞色素P450酶和Ⅱ期代谢酶的表达变化。然而，最有意义的还是使用人的肝细胞来研究和预测药物的肝脏代谢机制和毒性反应。

尽管原代肝细胞在一定程度上能够反映出药物的代谢和毒性，然而人体组织获取困难，质量变异较大以及个体差异等因素限制了它的常规使用。干细胞技术的出现为科学研究提供了一个全新的机会，不仅能够用于研究新的方法来阻止和治疗多种疾病，还能够用于研究发现新的分子靶点、开发新药、开展安全性试验等。由于干细胞是能够自我更新的细胞群，能够在未分化状态时持续培养，产生更多的人体特异性细胞，例如心脏、肝脏、骨髓、血管、胰岛和神经细胞，因此干细胞技术为体外模型系统的建立提供了一个非常有用的新手段，可以用于药物和化学物的测试、预测其在人体中潜在毒性反应。近年来，随着从胚胎或成人组织分离和培养多能干细胞技术的快速发展，干细胞技术为多种组织特异性细胞的分化提供了更广泛的来源。尽管人胚胎干细胞保留着分化成机体各种主要细胞的潜能，但是目前关于它们的研究应用仍然存在着各种争论，大大限制了它们的应用。然而，来源于非人胚胎组织的成体干细胞在培养过程中仍保留着分化潜能，因此为药物的研发和评价提供了一个非常有用的细胞培养体系。

随着干细胞研究技术的明显进步，可以产生可靠的全功能性人肝细胞，为研究新药对人肝脏的影响提供了重要细胞来源。这不仅打破了肝细胞来源的局限性，而且还保留了药物代谢酶的表达和活性，突破了新药研发瓶颈，促进了新药研发进程。尽管最佳肝细胞来源的生物学质量问题仍然需要进一步讨论，但目前至少应具备四种特性用于满足大多数干细胞来源的肝细胞需求，分别为:①能够常规获得;②易于冷冻保存和复苏培养;③提供细胞及其在成体肝细胞中观察到的代谢信息;④提供捐赠者的不同遗传背景。

尽管已有许多文献报道了干细胞来源的肝细胞样细胞，但是可以说目前仍然没有一篇公开报道的细胞能够同时满足上述的所有条件。这只是一种理想化的干细胞属性，对于骨髓、外周血或羊膜来源的细胞应该比较容易获得并且具有大量的遗传背景数据，而胚胎干细胞则来源有限。要使用不同干细胞来源的肝细胞进行药物代谢和毒理学试验就必须考虑上述问题。目前，根据文献报道最常用的干细胞分化的肝细胞主要来源于人或小鼠的骨髓、外周血或胎盘脐带血或胚胎干细胞。

分子生物学的快速发展为复杂的肝毒性研究提供了新的研究手段。尽管原代肝细胞仍然是使用体外模型研究药物潜在肝脏毒性的“金标准”，但已经出现几种新的细胞模型可以用于类似的肝毒性预测。细胞系可用于多种毒性机制研究，这些细胞和细胞来源体系研究也变得更加规范和易于接受。许多来源于肝肿瘤的细胞系(如HepG2和WIF-B9细胞)已经应用于肝毒性的研究领域，还有一些使用遗传工程细胞系研究肝毒性的特殊机制(如细胞色素P450工程细胞、BSEP表达细胞或载体)。这些体系的使用和预测价值主要依赖于每一种体系与完整的体内肝脏的相关性。尽管每一种体系不能表达负责肝功能的所有蛋白组分，但在药物研发的早期阶段，使用这些体系用于肝毒性的预测具有很大的价值。

WIF-B9细胞是WIF12-1细胞系的亚克隆，主要来源于大鼠Fao肝癌细胞并融合WI38人成纤维细胞。由于来源于多个种属，这些细胞共同表达了大鼠和人肝脏特异性蛋白。这些细胞能够合成清蛋白，近年来研究表明还能表达一套大鼠和人的P450亚型代谢酶，其中一些酶还可以被诱导。除了具有代谢能力外，WIF-B9还有细胞极性，因此能够建立功能性小管空间并在其中转运胆汁酸样分子。虽然这些细胞并不能表达负责细胞胆汁酸摄取的主要人类蛋白，如钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白( sodium-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)，但可以表达功能性大鼠NTCP和(或)人有机阴离子转运多肽( organic anion transporting polypeptides，OATPs)，同样也具有胆汁酸摄取功能。至于NTCP，WIF-B9细胞并不表达人源胆汁酸盐输出泵蛋白异构体( bile salt export pump，BSEP)，该转运蛋白主要负责小管内胆汁酸的跨膜排泄。因此，由于大鼠NTCP和BSEP的功能性表达，用该模型预测转运子介导的肝毒性(如药物诱导的胆汁淤积)将仅限于依据啮齿类动物基因进行的预测。尽管，该系统相对只有在大鼠中才能更好地反映转运子介导的毒性，但是根据常规细胞毒性检测结果，WIF-B9细胞在预测肝毒性方面仍然有较好的应用前景。使用WIF-B9细胞进行酒精性肝损伤特殊评估结果表明，细胞色素P450 2E1具有功能活性，并且乙醇脱氢酶( ADH)和乙醛脱氢酶( ALDH)活性完整，这和分离的肝细胞观察结果相一致。此外，近年来水通道蛋白的表达和定位研究表明该细胞系还可以用于能阻碍肝脏胆汁形成的毒性反应的预测。

人肝细胞瘤HepG2细胞系是在肝毒性评价中最常用的一种细胞系。自1980年发现以来，这些细胞就被用于各种肝毒性的机制研究，例如从酒精性肝损伤到用于肝毒性预测的药物高通量筛选等。在肝毒性研究中，HepG2细胞的一个突出特点是能够表达和诱导相关药物代谢酶。已证明该细胞可以表达关键Ⅰ期代谢酶CYP1A、CYP2B、CYP3A和CYP2E和一些Ⅱ期代谢酶(如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶和谷胱甘肽S-转移酶)，并且其中有几种酶还可以被典型酶诱导剂诱导。然而，并不是所有的药物代谢酶均能在HepG2细胞上表达。为了使建立的肝毒性评价模型更加真实，一些学者将更多的代谢酶转染到该细胞上。HepG2细胞转染CYP3A4后，给予已知毒性代谢产物的化合物，细胞毒性检测结果发现了P450特异性代谢产物。此外，给予对乙酰氨基酚后，HepG2 CYP2E1细胞能产生活性代谢产物，形成蛋白加合物和线粒体损伤，这表明在HepG2细胞中导入已知机制特异性的酶将能够预测和评价新的分子实体。除了药物代谢酶外，HepG2细胞核转录因子的表达也为肝毒性机制研究发挥了重要作用。已有试验证明了HepG2细胞上的脂肪分化相关蛋白的上调，这为肝脂肪病变的机制研究提供了重要帮助。此外，还有试验表明2，3，7，8-四氯二苯并二 英( TCDD)通过芳香烃受体能够上调HepG2细胞上CYP1A1。但是，在对这些数据解释时应该十分小心，因为在HepG2细胞中CYP1A1的诱导比原代细胞上更加敏感，不一定能够说明体内反应。与P450代谢酶相似，将核受体转染至HepG2细胞也已经被用于涉及多种分子的肝毒性机制研究。

HepG2细胞在预测磷脂质病、线粒体毒性和氧化应激方面具有较好的应用前景。尽管使用HepG2细胞预测特殊肝毒性方面需要对系统进行进一步优化，但是使用HepG2细胞可以预测机制无关的总体肝毒性已成为目前普遍接受的观点。使用HepG2细胞进行高通量筛选结果也表明使用该细胞系检测人肝毒性具有80%的灵敏度和90%的特异性。

除使用完整的离体器官以外，目前肝功能体外模型研究的一个主要局限就是大多数体外模型本质上都是静态的。由于这些模型的静态本质，很难去重建细胞的正常体内生长的微环境，并模仿肝脏的体内生理学特征。目前，已有模型通过研究肝窦状隙液体流动对肝细胞产生的剪切力刺激，观察肝细胞的基因表达和功能。此外，细胞间广泛接触、细胞极性的建立，对肝脏非实质细胞的影响都是重建体内的肝功能十分重要的因素。静态系统已经得到广泛的使用，并且在一定程度上能够成功地预测临床上的肝毒性。与上述广泛使用原代肝细胞和肝细胞系预测肝毒性不同的是，用于复杂的肝功能评价的3D模型中肝毒性检测指标相对较少。尽管这些新出现的3D模型还没有在肝毒性评价领域得到广泛应用，但这些新技术已经得到越来越多的关注。

其中一项最有希望的反映肝功能的3D模型就是在能够让原代肝细胞附着的支架内构建一系列小的通路，并灌注适当的细胞培养基进行培养。该技术由麻省理工学院( MIT)建立，这种独特的微型生物反应器设计支持3D组织结构的形态学研究，优化了氧的运输，生理学上剪切力刺激能够传递到使用该设备培养的细胞中。因此，这些体外培养的细胞从形态学上类似于完整的肝脏，肝脏特异性蛋白和mRNA表达接近生理水平，几种Ⅰ期关键酶的代谢功能也与新鲜分离的肝细胞或完整肝脏组织相似。由于该反应器的功能单位是单通道的，可以通过控制支架内的独立通道的多少设计所需要的组织大小。近年来，该模型还被用于药物研发中的高通量筛选。该技术在毒理学领域中广泛应用前仍然存在许多挑战。由于目前主要的试验数据大多来源于大鼠肝细胞，因此使用人肝细胞对于临床肝毒性的预测更有意义。将该装置中的细胞功能特点(如胆汁酸转运、线粒体功能等)与特殊试验设计相结合用于不同机制的肝毒性评价，将有利于进一步评价该体系。尽管如此，目前的结果和数据均表明该体系比传统的肝功能评价体系具有很大的优势。

最初设计主要用于肝移植患者的体外桥接装置，但是研究发现肝细胞一旦移植到这种多区室的纤维反应器上能够自发形成3D结构。这些结构在形态学上和体内观察结果一致，并且细胞能在培养液中最高维持7周，没有出现主要的组织学改变。这项技术背后的基本原理是通过使用人造微血管的灌流促进了3D结构的形成。当培养两周时，新鲜分离的细胞能够保持肝脏特异性功能，如尿素合成、清蛋白产生、P450酶的功能和葡萄糖代谢。最近研究数据表明非实质细胞也能够形成功能性结构，可以作为肝细胞的补充，这些细胞在该装置中培养时也具有一定的增殖能力。