肾脏是动物的主要排泄器官之一，尿液中各种物质排泄的量在生理情况下，是较为恒定的，如果排泄量过多或过少往往表示肾功能异常。同时结合血液生化的改变，可以得到初步的评价。值得注意的是，在反映尿中某物质的含量时，以24小时尿中的含量最理想，由于尿量的多少受饮水量的多少影响较大，因此只测定一次随机尿样中物质的含量不太能反映真实的情况，在收集24小时尿量有困难时，一般用尿肌酐来校正尿量。

常规的尿检查项目包括尿液颜色与浊度、尿量、尿比重、酸碱度、尿蛋白、尿糖、潜血、尿酮体、尿胆原、尿胆红素等。正常尿液是清亮的，呈微酸性，放置一段时间后可呈混浊。温度降低可使尿中的矿物盐结晶析出，一般酸性尿易形成尿酸盐沉淀，碱性尿易形成磷酸盐沉淀。急性和慢性肾衰竭时常常出现少尿或无尿。尿比重降低往往反映肾脏的浓缩功能出现障碍，是肾小管损害的典型表现。

此外，对尿沉渣进行显微镜检查可以观察尿液中的红细胞、白细胞、结晶、管型及脱落细胞。管型是蛋白质、细胞或碎片在肾小管沉积而形成并脱落至尿中的圆柱状体，依其形状和内容物的不同而有以下几种:透明管型、颗粒管型、红细胞管型、白细胞管型、上皮细胞管型、脂肪管型、细菌管型、真菌管型等。尿中出现多量管型表示肾实质有病理性变化。

血浆自肾小球滤过时，低分子量的蛋白质可随滤液进入肾小管，其中99%以上被重吸收。尿液中仅含剩余的微量蛋白及肾小管分泌的极微量黏蛋白。当肾脏出现损伤时，尿中蛋白质含量往往出现升高，根据尿蛋白分子量的大小可以初步判断肾脏病变的性质。肾小管病变会导致正常滤过的蛋白质重吸收障碍，其特点是以小分子量蛋白如β ₂-微球蛋白、溶菌酶等为主，而肾小球损伤时，肾小球滤过膜通透性增加，大量血浆蛋白通过损伤的滤膜进入尿中，尿中蛋白质以大分子的蛋白为主，主要是清蛋白，另外如转铁蛋白、抗胰蛋白酶等以及其他更大分子的蛋白。

评价不同种属尿蛋白需要利用定量分析的方法。这些方法包括比浊法、比色法、染料结合检测。这些蛋白包含组成性表达的蛋白，如纤连蛋白、胶原蛋白Ⅳ、谷胱甘肽S-转移酶α 等;表达上调的蛋白，如丛生蛋白、肾损伤因子-1等。尿中蛋白是由于肾功能损伤而释放的，其中许多是肾特异的，而且其中的一部分会因肾功能改变上调并释放到尿中，因此可作为肾损伤的生物标志物。

正常情况下尿中含酶极少，但在肾脏某些疾病的病理条件下，血液、肾脏以及泌尿道中的酶可能进入甚至大量出现于尿中。酶在肾脏组织中分布的细胞定位和亚细胞定位，例如丙氨酸氨基肽酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶主要在近端小管的刷状缘上;谷氨酸脱氢酶则是一种重要的线粒体酶;乳酸脱氢酶主要在胞浆内;溶菌酶、β-葡萄糖苷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶等为溶酶体酶。根据不同的尿酶分析结果可以初步判断损伤的部位和损害的程度，如尿中出现碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶，表明细胞有轻微损伤;如出现谷氨酸脱氢酶、溶菌酶等，则说明有细胞的坏死。肾乳头损伤常使N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶排出增多。因此，尿酶活性的测定是检测肾损伤存在与否及损伤部位的方法。运用其作检测指标有很多优势:①与尿蛋白相比，尿酶在评价肾功能时，灵敏度更高;②尿酶活性能够准确地反映肾损伤的程度，具有剂量效应;③大部分检测方法基于色谱原理，可采用自动生化仪分析，检测方法快速简便;④酶的活性是通过分解底物的量来进行测定的，同一检测方法可用于不同种属的检测;⑤反复检测酶活性可监测肾损伤的恢复和发展;⑥对尿酶的检验可以判断肾损伤的部位。常用尿酶及其组织定位和亚细胞定位见表7-3。

但同时必须指出，由于酶的种类很多，动物间的种属差异很大，在肾组织中的分布定位并不是绝对的，而且某种酶的出现常常有其时限性，即在病变的不同阶段可能有不同的酶出现。因此很难根据一种尿酶就作出肾损伤部位和性质的判断，必须结合其他指标综合分析，才能进一步判断。

此外，进行尿酶检测时，尿液的采集和处理需要特别注意:①尿样必须避免污染，如粪便、食物、细菌;②尿中的红细胞、白细胞、上皮细胞等，需离心除去这些细胞，检验尿沉渣有助于弃去有污染的样本;③尿中的低分子量蛋白质及尿素:尿素能抑制某些酶的活性;尿中的低分子量蛋白质及尿素可以通过透析、稀释、层析、超滤等方法去除;④稀释和pH对酶活性也有影响:大部分的酶活性对酸性pH和浓度是敏感的;⑤尿酶在尿中的稳定性一般低于血清或血浆，所以尿酶的检测需要迅速;如果需要保存样本，添加一些稳定剂是必要的;⑥由于某些酶的分泌有显著的周期性，建议24小时尿或者某个时间段的尿在相同时间收集;⑦随机尿样本可通过尿肌酐校正酶的活性，已证实该结果与24小时尿酶的活性有较好的相关性，但在考虑此方法时，应注意影响尿肌酐的因素，如年龄、饮食等。

肾脏的功能之一就是在不同的饮食状况下维持体内电解质和矿物质的稳态，因此对血液和尿液中的电解质水平分析为了解肾脏功能提供了方法。然而，由于肾强大的功能，只有当肾功能出现明显的降低时，血中电解质的降低才能被检测到，相反，尿中电解质却可以作为反映肾功能状态的敏感指标。在临床前动物试验中，动物摄食可被很好控制，所以血电解质水平可被认为是恒定的。排除那些由于呕吐、脱水、流涎症等所导致的电解质大量流失，尿电解质水平也可作为反映药物作用于GFR(决定滤过负荷)或者肾小管分泌和吸收(决定最终尿液电解质水平)的功能变化。最有效的利用尿电解质的方法就利用分级排泄法进行校正，分级排泄代表从血液中分泌的滤过负荷的比例。如果肾小管功能和血液中电解质值正常，分级排泄值升高反映GFR下降。

由于肾脏是外来化合物的主要排出途径，绝大多数肾脏毒物都可以在尿中检出该化合物的原形或其代谢产物。尿中毒物含量反映了肾脏接触该毒物的水平，不仅可以提供引起肾脏损害的病因方面的信息，而且在一定程度上也有助于判断肾损害的程度。采用的测定方法包括气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析法、光电比色法等。

血清肌酐是检测肾功能的经典指标，由于肌酐自由经肾小球滤过后，不被肾小管重吸收而全部排出，所以肾小球滤过功能下降时血中肌酐即上升。动物体内的肌酐主要来自于骨骼肌中肌酸的代谢终产物，同一个体的代谢量十分恒定，释放入血的速率及血浓度也相当稳定。但血清肌酐受到诸多非肾因素的影响，如肌肉质量、年龄、性别、肌肉代谢及蛋白质摄取等，而且肾脏有强大的代偿功能，部分肾小球受损后，剩余的肾单位仍然可以有效清除肌酐，使得血肌酐指标对肾功能的变化并不敏感，肾小球滤过率下降至正常值的50%以下，血肌酐水平才有明显的上升，亦即只有肾功能代偿不全时，血肌酐才升高，因此血肌酐并不是反映肾小球滤过功能的敏感指标。

尿素氮( BUN)是蛋白质代谢的主要终末产物之一，是非蛋白氮的主要组成成分，正常情况下约占非蛋白氮的50%，肾功能受损害时血中非蛋白氮的增加以尿素氮为主，此时，尿素氮可占非蛋白氮的80%以上。BUN可经肾小球自由滤过，在肾小管内一部分被重吸收。BUN的水平主要取决于肾小球滤过率，但在GFR下降到正常值的50%时，BUN才开始升高。可见BUN并不是反映GFR的敏感指标。

肾小球基底膜( GBM)主要由胶原及非胶原(糖蛋白及蛋白多糖)两种成分构成，已发现的有Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、纤连蛋白以及肌动蛋白等。某些肾脏病变中可能形成抗GBM的循环抗体。众多的化合物和药物，尤其是抗生素类药物，在通过肾小球滤膜时，能与基底膜的某些成分结合而形成基底膜抗原，如青霉素、环孢素、庆大霉素以及解热镇痛药等造成的肾损害中，都曾发现基底膜有抗原抗体复合物沉积或有抗GBM循环抗体存在。检测抗GBM抗体的方法主要有:间接免疫荧光法、放射免疫试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验。

抗肾小管基底膜( TBM)抗体常可导致小管间质性肾炎，其检测方法与抗肾小球基底膜抗体的检测方法类似，通常以正常肾组织冰冻切片为载体，用间接免疫荧光法测定，也有用放射免疫法测定的。

Tamm-Horsfall蛋白由肾小管髓袢升支厚壁段及远端小管上皮细胞分泌并构成此段细胞膜的固有成分，正常时与循环不发生接触。只有当肾小管局部遭到损伤或由于肾小管及尿路梗阻，或存在尿液的反流时，Tamm-Horsfall蛋白才有机会扩散至循环并与淋巴免疫系统接触，并触发机体的自身免疫反应，使血液循环中产生Tamm-Horsfall蛋白抗体。因此，测定血清抗Tamm-Horsfall蛋白抗体有助于肾脏病变的定位。临床上常用放射免疫或酶联免疫吸附试验测定血清抗Tamm-Horsfall蛋白抗体。

清除率( renal clearance，RC)是衡量肾脏排泄功能的一个重要指标，是指肾在单位时间内(每分钟)将多少体积血浆中的某物质清除出去。以公式表示如下: C= UV/P， C为清除率( ml/min) ; V为每分钟尿量( ml/min) ; U为尿中测定物质的浓度( mmol/L) ; P为血中测定物质的浓度( mmol/L)。如果血液中的某种物质在血液流经肾脏时可以被完全清除，不被肾小管重吸收，使这一物质通过肾后几乎全部排出，而且血中剩余部分又可全部由肾小管分泌，那么它的清除率既代表肾血浆流量( RPF)，又可反映肾小管的分泌功能，如对氨基马尿酸、青霉素等。某物质经肾小球滤过后，完全被肾小管重吸收，其清除率等于零，例如葡萄糖。在血浆浓度接近肾糖阈时，利用清除率公式，可计算出滤液中被重吸收的葡萄糖量即肾小管葡萄糖最大重吸收量( TMG)，用以反映近端肾小管的重吸收功能。

肾小球的滤过功能是最基本的功能，因此肾小球滤过率( GFR)是判断肾小球功能最主要的指标。所谓肾小球滤过率是指在一定时间内(通常是以每分钟为单位)经过肾小球滤过的血浆量。如果血浆中的某物质能经肾小球自由滤过，则在肾小球滤液中的浓度与血浆中的浓度相同，经过肾小管既不被重吸收，又不经肾小管分泌，那么它的清除率就是GFR。GFR可以通过测定内生肌酐或菊粉的清除率计算出来。内生肌酐是仅由骨骼肌以恒定速度释放的内源性化合物，释放量有限度并完全滤过。菊粉是外源性化合物，菊粉分子量小，不与血浆蛋白结合，无任何毒理和药理效应，能够经肾小球滤过膜完全滤过而不被重吸收和分泌。在动物试验中最常用菊粉的清除率来测定GFR。

检测近端肾小管功能的方法有多种，包括酚红排泄试验、肾葡萄糖最大重吸收量、肾小管对氨基马尿酸最大排泄量测定、尿溶菌酶及β ₂-微球蛋白测定等。①酚红排泄试验( PSP) :过去曾被认为可代表近端肾小管功能的检查，但实际上除了肾小管排泌外，肾内血流量情况及其他肾外因素影响可以影响它的准确性，对肾小管功能检查敏感性不高。②肾葡萄糖最大重吸收量( TmG)测定:当血糖在正常范围时，肾小管能将从肾小球滤过的葡萄糖全部重吸收，排出的尿液中并无葡萄糖。随着血中葡萄糖浓度不断增高，肾小管对葡萄糖的重吸收值也随之增加，当血中葡萄糖浓度超过一定限度时，肾小管重吸收能力达到饱和，则不能将过多的葡萄糖重吸收，于是出现尿糖，此时滤液中被重吸收的葡萄糖量称为肾小管葡萄糖最大重吸收量( TmG)。计算单位时间内自肾小球滤出的葡萄糖量，减去同一单位时间内尿中出现的葡萄糖量，即可计算出TmG。TmG值的高低可反映有效肾单位的数量和功能，是测定近端肾小管重吸收功能的指标之一。但此法较为繁琐。③肾小管对氨基马尿酸最大排泄量测定( TmPAH) :对氨基马尿酸( PAH)注入人体后不经分解代谢，80%以原形从近端肾小管排泌，仅20%以原形从肾小球滤过，在肾小管中不被重吸收。其排泌量随血浆PAH水平升高而增加，当血浆浓度增加到一定高度时，肾小管对其绝对排泄量已达最大限度，即使再增高PAH的血浆浓度，尿中其排出量也不能再增加。此时的排出量即为对氨基马尿酸最大排泄量，如用此量减去肾小球滤过量，即得肾小管对氨基马尿酸最大排泄量( TmPAH)。用于评估正常肾小管的数量和质量，了解近端肾小管主动排泄功能。此方法也较繁杂。④尿溶菌酶及β ₂-微球蛋白测定:尿溶菌酶和β ₂-微球蛋白属小分子物质，均经肾小球自由滤过，绝大部分在近端小管被重吸收，故正常尿中含量微少，如血中含量正常，而尿中含量增加，往往提示肾小管重吸收功能受损。

检测远端肾小管功能的方法有多种:浓缩稀释试验、尿渗透压测定、自由水清除率、尿比重测定等。临床上较实用和较准确的是浓缩试验。尿的稀释试验因在短时间内要大量饮水，有可能引起某些不良反应，且受肾外因素影响较多，因此敏感性不高，临床上很少采用。尿比重和尿渗透压测定均能了解远端肾小管浓缩和稀释功能，两者都能反映尿中溶质的含量，但尿比重易受蛋白质、葡萄糖等溶质微粒大小和性质的影响，可使尿比重增高;而尿渗透压则是反映尿中各种溶质微粒的总数，而与溶质分子量、微粒体积大小无关，因此测定尿渗透压比测定尿比重更为优越，能更准确地反映肾浓缩和稀释功能。目前尿渗透压测定多采用尿液冰点下降法，也可用蒸气压渗透压计算法测定。自由水清除率能更为理想判断肾浓缩和稀释能力，但方法较麻烦，临床上少用。

检测肾小管尿酸化功能是为了了解肾小管泌氢、产氨和重吸收碳酸氢根(离子)等功能是否正常，对肾小管酸中毒的诊断具有重要意义。常用的试验主要有氯化铵负荷试验和碳酸氢根重吸收负荷试验。

氯化铵负荷试验又称酸负荷试验。基本原理是:服用一定量的酸性药物氯化铵，使机体产生急性代谢性酸中毒，如远端肾小管功能正常，可通过分泌氢或产生氨使尿液酸化或碱化。如远端肾小管受损时，其分泌氢、产生氨和重吸收碳酸氢根的功能发生障碍，酸性物质不能排出，尿液得不到酸化。通过检测尿pH的变化，即可判断有无远端肾小管酸化功能障碍。碳酸氢盐重吸收负荷试验又称碱负荷试验。其原理是:用一定量的碱性药物碳酸氢盐，使机体体液碱化，以增加肾小管重吸收碳酸氢根离子的负担。如近端肾小管发生损害，其重吸收碳酸氢根离子功能减退。通过观察尿液碳酸氢根离子的排泄分数，有助于近端肾小管酸中毒的诊断，并可鉴别远端肾小管性酸中毒。

毒理学试验结束时，应对动物进行大体解剖，称量两侧肾脏重量，计算肾脏系数(肾脏重量/体重、肾脏重量/脑重)，肾脏系数的改变常提示肾脏存在病理性变化。大体检查还能观察到肾脏的颜色、质地以及出血、粘连的等大体病变。

肾脏组织的光学显微镜检查能在细胞水平上观察肾脏的病理改变，揭示肾损伤的部位、范围及形态学特征。组织病理学检查常常能够敏感地反映出肾脏病变的发展，有时出现在血液与尿液某些监测指标发生改变之前。

电子显微镜检查可检测肾脏组织细胞超微结构的改变，诸如刷状缘、线粒体、基底膜以及其他细胞器等。电镜检查能发现中毒性损害早期的亚细胞形态改变，是十分灵敏的检测方法。虽不一定作为常规的指标，但对于机制的研究却是十分有力的研究手段。

酶组织化学方法可在光镜或电镜下进行，如结合酶标记法、放射性核素标记法以及免疫组化方法等，可揭示毒物的分布以及肾脏病变的组织、细胞定位，观察亚细胞结构的变化，探讨毒物对肾脏细胞的免疫效应以及对代谢和酶系统的影响，是肾脏毒理学研究的有力手段。

离体肾脏灌流是研究外源性化合物肾毒性较好的体外试验方法，它既保留了肾脏结构和功能上的完整性，又不受高级调节系统(如神经、激素、血容量)和其他器官组织的影响，更重要的是可以精确控制受试物的浓度，所以在肾毒性的研究中得到广泛应用。肾灌流通常用大鼠和兔，将离体的肾脏连至恒温灌流仪上，以Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液或Krebs-Ringer作为灌流液，加清蛋白、多种氨基酸、肌酐、葡萄糖或红细胞，再用体积分数为95% O ₂∶5% CO ₂的混合气体平衡，尽可能地与生理状态相近。有研究认为自体血浆也可作为较理想的灌流液。采用的灌流模式可分三种:非循环型、再循环型、再循环透析型，透析常与充氧过程结合进行。通过测定肾小球滤过率，肾血浆流量，肾血管阻力，尿量，尿酶，灌流液中受试物、离子等的浓度变化以及肾组织超微结构的改变等进行代谢和毒作用机制的探讨。由于与整体血流动力学的差异，离体肾脏的灌流率、钠盐及水的重吸收率都低于体内值，但它仍是肾脏毒物筛选的好方法。

当然此方法也有其局限性，与体内研究相比离体肾脏的功能只能维持很短的时间(通常不超过4小时)，且需要特殊的灌流设备，操作技术难度大，只适用于短期毒性试验，研究毒物直接对肾脏的毒性或经肾脏代谢后的间接毒性作用，以及不同毒物在肾脏的联合作用与肾脏毒性作用机制。

游离肾单位或肾单位段灌流技术是研究上皮转运的理想系统，它能够传递许多有价值的肾功能特征的信息，已在家兔、小鼠、大鼠、蛇、蛙，甚至人的游离肾单位成功开展，用于肾小管段或细胞水平的生理机制和毒理研究。通常肾单位的分离是在显微镜下进行的，根据各段小管形态学的特征区分，而随着显微解剖学的发展，肾单位各段细胞的酶系统定位、代谢途径及受体分布等都已经明确阐述，分离后的来源定位更加精确。将分离的肾单位或小管放置于特定的灌流槽中，镜下将一端小管与灌流管相连，另一端与收集管相连，在室温下以适宜的流速进行灌流。通常小管易于灌流，且可较长时间保持灌流(可达6h)，通过对灌流前后及管腔内外各种离子、氨基酸、受试物的浓度变化和组织形态学变化分析，进行转运途径及毒性机制的探索。此方法的优点是不受受试物浓度限制，可以人为决定受试物浓度，而且各段小管的分泌功能也可测定，使得转运过程更清晰。但是此方法操作很复杂，较少作为常规试验。

肾脏组织切片技术是一个体外试验中运用最早且仍广泛使用的技术之一，20世纪70年代末80年代初国外用该项技术研究了大量药物和毒物的肾脏毒性。

肾脏切片分肾皮质和髓质两类，尤以前者应用更多。切片厚度一般在2～5mm，在恒温孵育液中震荡孵育，肾片一般存活4～6小时，既避免了肾外其他器官和系统的干扰，又保留了肾实质细胞与细胞之间的联系及一定的细胞间质，保留了细胞及细胞器的活性，可用于肾代谢、转运和特定区域对毒物反应的研究。肾片技术操作容易，采用一只动物即可获得大量的试验数据。但是，肾切片技术也存在一些不足:肾切片中包含不同的细胞型，很难评价某一特定细胞型暴露于化合物的功能改变;在制片过程中许多细胞受到机械损伤;切片有一定厚度，许多相互作用的细胞堆积在一起，无法保证每一个目的细胞都暴露于相同的氧和营养液浓度。以上缺点限制了肾片技术只作为一种化合物肾毒性的初筛试验方法。

新鲜分离的肾小球、肾小管及其细胞等都已被用于化合物的急性效应的评价。将剪碎的组织放置于氧饱和缓冲液中(不作处理或先用酶消化)，使其通过一系列规格不同的筛网或用细胞分离液( Ficoll，Percoll)进行密度梯度离心分离出目的节段或细胞，放置于孵育液中，如果在分离小管之前将氧化铁灌注肾脏，使它和肾小球结合，再用磁分离法去除结合的肾小球，可以提高制备量和纯度。制备出的小球或小管可以用于不特异但敏感的毒性试验，而不同部位的细胞则可以用于特异性试验。对于肾小球而言，它的敏感终点有:蛋白多糖、胶原、纤连蛋白的代谢和合成。肾脏毒物的代谢与转运可用分离的近端或远端小管段及细胞进行研究。许多试验都已在游离的鼠、兔、猪、犬及人的肾单位段、细胞上得到了一定的成果。此方法的优点是上皮结构的完整性得以保持，而且外源性化合物损伤引起的肾单位节段特异性的生化改变容易检测，有利于肾毒性机制的更好解释。头孢菌素、血管紧张素转换酶抑制剂、顺铂等的毒性作用机制都通过孵育的游离肾单位节段得以阐明。不同部位的游离肾细胞也越来越多地用于药物代谢、膜转运、毒性机制等的研究。但是由于游离的肾单位、细胞在孵育液中只能存活几个小时，无法进行更长期的试验。

随着细胞生物学的发展，肾细胞培养技术在肾毒性的体外试验研究中发挥了重要的作用，尤其是肾脏特异细胞的培养方法逐步成熟，更加推动了肾脏毒理学的发展。细胞培养按培养的细胞来源分为:原代培养和继代培养。

原代培养是直接从体内取出的细胞的第1次培养，它包括目的细胞的分离和培养两部分。原代培养保留了体内独特的细胞功能、细胞极性和细胞间的联系，与继代培养相比更能代表整体动物的情况，可长期冻存。原代培养已成功地用于顺铂、庆大霉素、头孢菌素等的体外肾毒性研究。但是，肾细胞的培养仍然还有许多难以解决的问题:经过培养的细胞常常表现出退分化的现象，不能完全表达出与体内一致的功能，而且原代培养过程耗时、复杂、操作困难。

继代培养是将原代细胞传代，建立一个稳定的细胞系，目前已建立的肾细胞系主要有:猪肾小管上皮细胞LLC-PK、北美鼬肾小管上皮细胞系OK、犬肾集合管上皮细胞系MUCK、人类肾小管上皮细胞系HKC等。这些细胞系表达肾小管的特异性，并具有部分分化功能，存活时间长，容易培养，可长期冻存。由于细胞系可以持续传代，长期暴露于受试因素下，所以多用于长期毒性的研究。但是经过反复传代的细胞易表现出退分化的现象，并且分化能力与培养细胞的体外培养时间呈反向关系。现已明确LLC-PK细胞系缺乏果糖1，6-二磷酸酶的表达，导致近端肾小管细胞无法进行糖原异生，其cAMP产生对甲状旁腺激素也不敏感，并且缺乏对丙磺舒敏感的有机阴离子转运系统。而OK细胞则缺乏两个近端小管细胞的标志酶表达——γ-谷氨酰转移酶与碱性磷酸酶。

检测外源性化合物对细胞的毒性常用的检测指标包括:①反映细胞生长和增殖情况的指标:如光镜、电镜下观察细胞单层的完整性、细胞及细胞器形态，细胞存活率，IC ₅₀，接种效率等;②反映细胞膜损伤的指标:如培养基中酶漏出量、标记化合物漏出量、跨上皮细胞的电阻和细胞穿透、膜流动性等指标;③反映细胞代谢能力的指标:如ATP浓度、NADP/NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量、代谢酶活力、细胞膜脂质过氧化作用等;④反映细胞转运功能的指标:如Na ⁺-依赖性葡萄糖的重吸收、对氨基马尿酸摄取试验等;⑤反映大分子物质合成与降解改变的指标:如染色体畸变试验、基因突变试验、微管蛋白聚合抑制试验等。可根据试验目的和条件的不同，选择不同的检测项目。

为了达到一定的试验目的，就某项问题在细胞的某一细胞器上进行研究，就需进行亚细胞组分的分离纯化，如经超速离心法制备的细胞膜、线粒体、细胞核、核膜、溶酶体以及内质网(微粒体)等细胞器，和用生物化学方法测定其某项功能或借助电子显微镜观察其结构的完整性，从而推测化合物的毒性机制。亚细胞组分研究方法的最大特点是，如拟研究某一外源性化合物代谢过程的某一阶段，即可在负责这一阶段代谢过程的细胞器进行。如微粒体用于研究化合物经混合功能氧化酶系催化的生物转化过程及关键产物的研究，线粒体用于检测化合物对氧化磷酸化酶类作用所引起的呼吸链氧化反应和ATPase活性改变的研究。此类研究用其他方法较难进行，而且在研究中，如果代谢产物的数量较少，测定方法灵敏度又受到一定限制，则采用细胞器进行研究较好。但是，将细胞器用于体外试验进行外源性化合物的毒性评定也存在一定缺点，首先，细胞器已具有细胞原有的整套代谢功能，其次，在代谢过程中形成的代谢产物不能像在完整细胞和整体动物一样继续被代谢解毒，所以应结合不同水平的研究如整体试验、细胞试验等，进行综合评价。

早期，急性肾功能减退称为急性肾衰竭( ARF)。近年来，人们开始使用急性肾损伤( AKI)的概念取代急性肾衰竭，使得急性肾功能减退的患者得以早期诊断。AKI是对ARF概念的扩展，不仅包括需肾脏替代治疗的重度ARF，还包括多种原因引起的早期、轻微、可逆的ARF，强调肾功能从轻微病变向终末期肾衰竭演变的全过程。肾脏由于其强大的代偿及调节功能，早期损伤时，临床指征与常规检测指标多不典型。而且传统的检查方法在操作性或敏感性方面都存在一定的缺陷。在反映肾小球滤过率功能的指标中，菊粉通常是检测肾小球滤过率“金标准”，但其价格昂贵、试验繁琐，已很少被应用。目前常用的血清尿素、肌酐则常常受到年龄、性别等多种因素的影响，且在肾小球滤过率下降至正常值的50%以下才表现出明显的升高，并不是反映肾小球滤过功能的敏感指标。同时，尽管肾小管功能是整个肾脏功能的重要组成部分，但由于肾小管功能异常的临床表现多不典型，在较长一段时间内其重要性并不为人们所认识。肾小管功能检查的多项试验如酚红排泄试验、肾小管对氨基马尿酸最大排泄量测定也由于操作繁琐等因素限制了其应用性。

随着生物技术的发展，生物标志物在临床诊断领域和毒性研究领域不断引起重视，寻找、发现并确证能够早期诊断肾脏损伤的特异性好、灵敏度高的生物标志成为肾脏毒理学研究重要的发展方向。新药对肾脏等重要脏器损伤的早期检测受到包括制药企业、临床医生、患者及监管部门的重视。尽早发现新药对这些脏器的损伤，不仅有利于保障新药受试者的安全，同时也有利于制药公司和监管部门尽早评估受试药的风险，以便决定是否继续研究，以减少不必要的浪费。美国食品和药品管理局( FDA)和欧洲药品管理局( EMA)均将开发兼具生物安全性和高效性的生物标志物列为未来医药发展规划的重点，随着相关检测手段和评价方法的不断改进，许多与肾脏损伤有关的生物标志物被发现，表7-4中所列为目前发现的一些主要的急性肾损伤生物标志物。

这些生物标志物的认定需要大量的非临床和临床研究，相关费用及工作量是单个制药企业难以承受的，而且某个企业取得的研究成果也因缺乏第三方评估而不被FDA认可。因此，2006年3月26日，在FDA指导下成立了“药物安全性预测联盟”( Predictive Safety Testing Consortium，PSTC)，成员包括Amgen、Pfizer、Roche、Sanofi-Aventis等16个不同的制药公司，由非营利性的“关键技术协会”( Critical Path Institute，C-Path)管理。C-Path作为第三方致力于收集整理数据，协调科学研究工作。PSTC设立的肾脏毒性工作组已进行了23种尿生物标志物分析，其中7种生物标志物于2007年6月15日呈交给FDA和EMA，并于2010年获得认可，可以用于新药的肾脏损伤的早期评估。这7种生物标志物包括:丛生蛋白( clusterin)、尿总蛋白、β ₂-微球蛋白(β ₂-microglobulin，β ₂-MG)、胱抑素C( cycstatin C)、肾损伤分子-1( kidney injury molecule-1，KIM-1)、三叶因子3( trefoil factor 3，TFF3)、清蛋白。

尽管过去十年中发现了数十种尿液或血清生物标志物，使得早期检测急性肾损伤成为可能，但目前大多数用于早期检测ARF的生物标志物的特异性及敏感性仍显不足，在判断肾损伤时需结合多种生物标志物的测定结果进行，在临床前及临床的检测方法上也还有许多需要突破的地方，仍有待于进一步的前瞻性研究。本书将对一些重要的急性肾损伤生物标志物予以介绍。

胱抑素C( cystatin C，Cys C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，是一种碱性非糖化的相对小分子( 13kDa)分泌性蛋白质，由机体所有的有核细胞以恒定的速率产生，其合成不受肌肉量和急性反应等因素影响，即使在炎症状态下其产生也不会改变。血中Cys C自由通过肾小球滤过后，由近端小管细胞重新吸收并迅速分解代谢，不进入血液循环。由于其相对分子量大于肌酐，带正电荷，因而更易反映肾小球滤过膜通透性的早期变化。当GFR下降时，血清Cys C比肌酐先一步升高。血清Cys C的另一个特点是几乎不受年龄、性别、肿瘤、免疫性和内分泌疾病影响。由于Cys C在近端小管细胞分解代谢，尿中Cys C浓度很低，不必用计算肌酐清除率的公式计算Cys C清除率，因此尿Cys C浓度还可作为肾小管指标，其敏感性及特异性不亚于视黄醇结合蛋白( RBP)。与血肌酐在检测人体药物肾毒性时相比，在不同年龄组和肾脏疾病的不同状态，Cys C显示出与血肌酐评价GFR时相同的灵敏度，而在预测低水平的肾脏功能损伤中，Cys C优于肌酐。早期Cys C的检测方法主要为酶联免疫( ELISA)、放射免疫( RIA)、荧光免疫( FIA)，颗粒增强透射免疫比浊法及散射免疫比浊法的相继出现，使Cys C的测定时间缩短至数分钟，且可以采用自动生化仪进行分析，检测方法更加快速、简便。但目前的检测试剂多用于临床，与其他种属的交叉反应性有待进一步研究。

肾脏损伤分子-1( kidney injury molecule-1，KIM-1)是由334个氨基酸残基组成的Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白基因超家族。在正常的肾组织中几乎不表达，但是在缺血及肾损伤后的人近端小管上皮细胞中却呈高表达状态。KIM-1参与肾脏疾病的损伤及修复过程，在近端小管上皮细胞黏附、生长及分化中起重要作用。肾损伤发生后组织KIM-1胞外功能区被金属蛋白酶介导裂解并释放入尿，并且尿KIM-1水平和组织KIM-1水平呈正相关。无论临床还是非临床研究均表明，在诊断药源性肾小管坏死、退化和(或)膨胀，及组织细微变化或肾功能严重紊乱引起的嗜酸性粒细胞增多方面，KIM-1的检测是高度灵敏、特异和精确的。KIM-1在多种中毒性肾病模型中表达升高，在肾组织还没有出现形态学异常或肾小管轻微异常而一些传统的检测指标还无明显异常时，尿KIM-1浓度已明显升高。顺铂、环孢素等肾毒性药物引起的肾损伤可以上调KIM-1的表达。尿KIM-1异常也早于微量尿蛋白、尿酶NAG、ALP、γ-GT的升高。而且KIM-1在尿中性质稳定，不受尿液理化特性的影响，因此KIM-1是检测早期肾损伤的理想标志物。在大鼠和人尿样分析KIM-1检测一般采用EILSA方法，但目前商品化的检测试剂仅限于人和大鼠。近来，还报道了采用微球技术定量检测大鼠尿样KIM-1的方法，与传统ELISA相比，动态范围更广且所需尿样和试剂更少。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶( N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)是存在于近端小管的溶酶体酶，分子量为140kDa。由于其分子量很大，血浆中的NAG正常情况下不经肾小球滤过，尿中的NAG主要来自肾实质。NAG在肾近端小管上皮细胞中含量最高，在尿中稳定，已有大量的研究表明NAG是反映早期肾小管损伤的灵敏指标。在肾毒物暴露、肾移植术后移植肾功能延迟恢复、慢性肾小球疾病、糖尿病肾病以及心肺转流术等肾脏损伤的情况中均报道有NAG水平的升高。在临床患者中，尿NAG的浓度越高，其最终发生透析或死亡的概率越高。NAG具有两大优点:①高灵敏度:肾近端小管上皮细胞损伤可使NAG脱落至尿中，通过直接检测其总量能够反映肾小管的损伤。②能够定量:采用分光光度计通过比色法能够定量测定尿NAG的含量，检测方法简便。但是，尿NAG的活性能够被内源性尿素以及一些肾毒物或重金属抑制。此外，在一些未发生急性肾损伤的情况下，如类风湿关节炎、糖耐量受损以及甲亢，尿中NAG水平也表现出升高。

β ₂-微球蛋白(β ₂-microglobulin，β ₂-MG)是相对分子质量11. 8kDa的单链多肽低分子蛋白质，人体几乎所有有核细胞均能合成。β ₂-MG主要由淋巴细胞产生，经肾小球滤过，99%以胞饮形式被肾小管上皮细胞摄取，并被近端小管细胞溶酶体降解为氨基酸。重吸收的β ₂-MG不再返回血液循环，故正常尿中β ₂-MG甚微。尿中的β ₂-MG升高，可敏感地反映肾小管功能受损。正常人β ₂-MG的合成与释放非常恒定，且与性别、年龄及时间无关。在肾毒物暴露、心脏手术、肾移植等多种因素导致的肾损伤中，尿β ₂-MG升高早于血清肌酐4～5天，可作为早期的肾小管损伤的标志物。但是，β ₂-MG在尿中不稳定，在室温下pH低于6. 0时β ₂-MG即快速降解，β ₂-MG的不稳定性限制了其作为肾损伤生物标志物的应用。

视黄醇结合蛋白( retinol-binding protein，RBP)是血液中视黄醇的转运蛋白，它是由肝细胞分泌的一种低分子量( 21kDa)蛋白，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液等体液中。血液中RBP主要以视黄醇、前清蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前清蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞重吸收、降解。Bernard等对多种原因导致的急性肾损伤患者进行监测，发现尿RBP变化早于NAG的升高，可作为高度灵敏的反映肾小管功能障碍的标志物。RBP和β ₂-MG水平在尿pH＞6. 0时高度关联，随着尿pH的降低，RBP/β ₂-MG比值逐渐升高，这表明在酸性尿中与β ₂-MG的不稳定性相比，RBP具有良好的稳定性。在顺铂、铅、汞、镉、环孢素诱导的急性肾损伤患者中，RBP被认为是早期诊断的标志物。目前，尿视黄醇结合蛋白的测定已广泛用于临床作为经典的肾小管损伤标志物。RBP、β ₂-MG以及α ₁-MG的水平可采用免疫散射比浊法测定。但是，在伴随肾小球性蛋白尿或肾小球超滤的情况下，肾小管重吸收处于饱和状态，采用低分子量蛋白，包括RBP、β ₂-MG、α ₁-MG、Cys C以及微量清蛋白作为生物标志物的意义有限。此外，RBP对急性肾损伤的特异性稍差。

丛生蛋白( clusterin)是相对分子质量为76～80kDa的糖基化蛋白，具有很强的修饰作用，如糖基化、分裂、形成二聚体等。在肾损伤中，丛生蛋白具有维持脂质转运、细胞的相互作用、补体的防御作用和启动凋亡等功能。当肾毒素、肾切除术后、多囊性肾病和肾细胞瘤引起的急性肾损伤时(包括肾小球、肾小管和肾乳头损伤)，丛生蛋白能在肾损伤后的去分化肾细胞中表达增加，在多种大鼠、犬、灵长类动物的急性肾损伤模型中，如缺血再灌注损伤、肾毒物诱导的肾损伤、单侧输尿管梗阻以及局部肾切除，丛生蛋白在肾及尿中的表达均上调。丛生蛋白可采用放射免疫的方法进行检测。在庆大霉素诱导的大鼠肾损伤模型中，丛生蛋白的量与血清肌酐及尿NAG的升高相关。而在顺铂诱导的肾损伤模型中，直到给药第5天，丛生蛋白的mRNA和蛋白水平均未见升高。到目前为止，尚无临床研究表明丛生蛋白可用作人急性肾损伤的诊断和预后指标。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白( neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是在中性粒细胞中发现的，分子量为25kDa，以共价键与中性粒细胞中的明胶酶相连。通常NGAL在人类的一些组织(肾、肺、胃和结肠)中以很低的水平表达。在受损的上皮细胞中显著表达。最初的研究发现，在缺血再灌注损伤后的小鼠肾脏和顺铂诱导的中毒性肾损害中，小鼠尿液中NGAL 3小时表达量增加3～4倍，远早于其他标志物，这引起了后来很多NGAL诊断急性肾损伤的相关研究。在一项对接受心肺流转术的儿童进行研究发现，术后2小时NGAL水平是急性肾损伤最强的独立预测因子，以50μg/L作为诊断界值，NGAL诊断急性肾损伤的敏感性和特异性分别为100%和98%。而造影术和肾移植后发生急性肾损伤的患者也在术后早期就能发现NGAL的升高。此外，尿液NGAL还能够区分急性肾损伤与肾前性氮质血症，慢性肾脏疾病与正常肾功能。

三叶因子3( trefoil factor 3，TFF3)是人体黏液生成细胞及多种组织的上皮细胞分泌的小分子多肽激素。每个TFF3分子由59个氨基酸残基组成含有1个P结构域。TFF3主要功能是对黏膜表面的维护和修复。TFF3通过抑制凋亡，保护残存细胞，促进上皮细胞的移行来保护肠上皮。TFF3的另一作用是诱导气管上皮纤毛细胞的分化。大鼠肾脏也是TFF3 mRNA表达的主要场所，尽管其在肾中的分布不是很清楚。大鼠衰老与TFF3在肾中表达的减少有关。无肾损伤时尿TFF3水平无变化，肾小管损伤时，尿TFF3显著降低，并先于组织毒性病变和血清肌酐的升高。

白细胞介素-18( interleukin-18，IL-18)是一种促炎症细胞因子，在多种炎性疾病如关节炎、多发性硬化症、肠炎、慢性肝炎、全身性红斑狼疮以及银屑病中均可见升高。IL-18的前体( 24kDa)在IL-1β转化酶的作用下转变为成熟的IL-18( 18kDa)。在缺血再灌注导致的肾损伤、自身免疫性肾炎以及顺铂诱导的肾毒性模型中，肾IL-18 mRNA水平明显上调。与正常受试者、肾前性氮质血症、慢性肾功能不全以及肾病综合征相比，急性肾损伤患者和肾移植患者尿中IL-18的水平明显升高。肾移植物活检进行免疫组化可见IL-18在远端小管上皮细胞组成性表达。在急性排斥患者的近端小管可见强免疫反应，在浸润的白细胞和内皮细胞也可见强的免疫反应，表明在有免疫病理的情况下IL-18上调。有研究发现，在患有急性呼吸窘迫综合征( ARDS)发生AKI的患者中，IL-18在血肌酐升高之前显著升高，且可以独立作为一项预测死亡的生物标志物。目前IL-18的测定均采用ELISA方法。