酮体和乳酸的测定是糖尿病急性昏迷诊断的重要监测指标之一，糖尿病患者最常见的急性合并症是乳酸或酮体中毒及高血糖、低血糖和高渗透量非酮症昏迷，若不及时诊断和治疗将有可能危及生命，所以实验室的诊断是非常重要的，这些实验包括：血糖、酮体、乳酸及血气分析等测定（图9-1）。

酮体是生物化学物质，既具有部分的酮结构，又直接由酮类衍生。血清中的酮体包括：丙酮酸盐、乙酰乙酸，丙酮及β-羟丁酸。酮体主要是在肝脏中脂肪氧化生成的，首先生成乙酰乙酸，经还原后生成β-羟丁酸，乙酰乙酸脱羧后生成丙酮。在酮体中主要是β-羟丁酸，约占78%，其次是乙酰乙酸，约占20%。而丙酮含量最少，仅为约2%，正常人血液中的丙酮通过呼吸时几乎全部呼出，极少部分从尿中排出，用一般的方法不能测定，当血中酮体少量增加时，尿内排出的主要是乙酰乙酸，量多时尿中的β-羟丁酸才明显地增加，因乙酰乙酸和丙酮有挥发性，所以在检查时要求尿要新鲜（在排尿2小时内）。

酮体只能在肝细胞线粒体中合成。酮体的生成过程大致如下：甘油三酯在激素敏感性甘油三酯脂肪酶的催化下水解为游离脂肪酸，脂酰CoA合成酶在三磷酸腺苷（ATP）、辅酶A（CoASH）、Mg ²⁺存在下，催化脂肪酸活化，生成脂酰CoA；脂酰CoA在肉毒碱脂酰转移酶Ⅰ和Ⅱ的作用下通过肉毒碱进入线粒体内，并在脂肪酸β氧化多酶复合体的催化下氧化成乙酰CoA；3-酮基硫解酶催化两分子乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA，羟甲基戊二酸单酰CoA（HMG2CoA）合成酶催化乙酰乙酰CoA与乙酰CoA缩合生成羟甲基戊二酸辅酶A（HMG-CoA），然后在HMG-CoA裂解酶作用下生成乙酰乙酸，部分乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下还原成β-羟丁酸，极少量的乙酰乙酸自动脱羧生成丙酮，酮体就是通过这样的途径在肝脏合成的。

合成后的酮体不能在肝内氧化，而需随血液流到肝外组织（如脑、肾、骨骼肌等）的线粒体中进行氧化从而为心肌、骨骼肌、肾脏及脑组织提供部分能量。酮体的分解过程大致是：乙酰乙酸在琥珀酰CoA转硫酶的催化下转变为乙酰乙酰CoA，乙酰乙酰CoA硫解酶催化乙酰乙酰CoA生成乙酰CoA，后者进入三羧酸循环而氧化供能。β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下，脱氢生成乙酰乙酸，然后循上述途径代谢。而丙酮不能按上述方式活化，除随尿液排出外，当血中酮体浓度剧烈升高时，亦可从肺直接呼出。

酮体生成率取决于外周脂肪细胞中的激素敏感脂酶、肝脏中的乙酰CoA羧化酶和HMG-CoA合酶的活性。循环中胰岛素水平负性调节激素敏感脂酶和乙酰CoA羧化酶（抑制酮体生成），而肾上腺素和胰升糖素水平则正性调节（兴奋酮体生成）。低胰生糖素/胰岛素比抑制酮体生成，而高胰生糖素/胰岛素比通过促进脂肪细胞中的脂解作用和兴奋肝脏中游离脂肪酸β氧化促进酮体生成。HMG-CoA合成酶活性受胰岛素抑制，饥饿和高脂饮食时该酶活性增高，酮体生成增多。糖尿病患者由于某些诱因致血中胰岛素严重不足及胰升糖素、肾上腺素、糖皮质激素、生长激素等拮抗调节激素不适当升高，引起糖、蛋白质、脂肪、水、电解质及酸碱平衡失调，乙酰CoA产生增多，造成酮体生成增多。乙酰乙酸、β-羟丁酸是强有机酸，可完全解离，使血中氢离子浓度急剧升高，当酮体大量生成，体内储备碱消耗，超过肺、肾对酸碱平衡的代偿能力时导致代谢性酸中毒。当患者体内酮体生成增多时，酮体可随尿液排出，出现酮尿。

血液或尿液中总酮体测定，在目前还没有一个单一方法能够测定。测定酮体的传统方法都有欠缺，只能测定丙酮，但血液和尿液中的丙酮只占总酮体量的很小一部分。虽然硝普盐法可测定乙酰乙酸和丙酮，但糖尿病酸中毒的病例中，主要升高的是β-羟丁酸，而乙酰乙酸的试验结果可能是阴性或弱阳性，如单独检查乙酰乙酸和丙酮，从而导致对总酮体量估计不足，并且常在糖尿病酮酸中毒症状已经缓解，乙酰乙酸含量反而比急性期升高，这容易产生对的病情错误判断。所以测血清中的β-羟丁酸更为重要。

测定血清和尿液中的酮体有多中方法。较为简便易行而又适合急诊的筛选试验的方法是硝普盐法半定量试验。但它的主要缺点是：不能检测β-羟丁酸，而且测定丙酮的灵敏性比测定乙酰乙酸小5～10倍，下面分别对酮体，乙酰乙酸和β-羟丁酸的测定方法分别论述。

硝普盐法是一种传统的检测酮体水平的半定量方法，在临床上得到了广泛的应用。它运用亚硝基铁氰化钠与乙酰乙酸在碱性条件下反应生成紫色化合物的原理来检测酮体。这种方法成本较低，而且操作简便，在它的基础上发展出了酮体试纸条、酮体粉等多种检测方式。以尿酮体试纸条为例，先将试纸条浸入含有亚硝基铁氰化钠的碱性缓冲液中，取出干燥后待用。测试时，将尿酮体试纸条浸入新鲜尿液中，约1s后取出，2分钟后观察试纸颜色变化，并与标准色版对照，即可得出检测结果。与此法类似，利用丙酮与水杨醛在碱性条件下反应生成深红色化合物的原理也可对酮体进行半定量的检测。

操作：取新鲜尿液约5ml于试管中，加入亚硝基铁氰化钠约250mg，用冰醋酸0. 5ml，反复振荡使其溶解。沿管壁缓慢加入氢氧化铵（浓）2ml，使之与尿液形成界面，静置后观察结果（表9-1）。

酮体试剂粉：亚硝基铁氰化钠0. 5g放入乳钵内研细，再加入无水碳酸钠10g，硫酸铵10g，继续研匀成细粉状，装入棕色瓶中，塞紧，防潮保存。

操作：于凹玻片孔中加入一小匙酮体试剂粉，滴加新鲜尿或血清于粉剂上，完全浸湿。

结果判断：当酮体含量在100mg/L以上时试剂粉出现紫色。根据紫色出现快慢和颜色深浅可报告：弱阳性，阳性，强阳性。5分钟内不出现紫色或仅出现淡黄色或棕色为阴性。

（1）亚硝基铁氰化钠只对乙酰乙酸敏感，与丙酮的反应较差，与β-羟丁酸几乎不发生反应。而与β-羟丁酸相比，乙酰乙酸的浓度较低，这样就使得到的结果误差较大，有研究表明，酮症酸中毒越严重，酮体中β-羟丁酸所占的比例越大，乙酰乙酸所占的比例越小，这时使用硝普盐法就会造成假阴性结果。

（2）在糖尿病性酮症酸中毒患者康复的过程中，酮体的总量逐渐减少，但随着β-羟丁酸转变成乙酰乙酸反应的进行，乙酰乙酸的浓度会有所增大，这时如果仅仅测定乙酰乙酸的浓度往往会造成误诊。

（3）在使用含有巯基的药物（如卡托普利）时，硝普盐试剂可产生假阳性反应，导致患者接受不正确的胰岛素治疗。

（4）丙酮、乙酰乙酸在血和尿中都不稳定，丙酮易挥发，乙酰乙酸可分解为丙酮，样品被细菌污染后会造成假阴性结果。

（5）硝普盐试剂在潮湿和高pH的环境下易分解生成褐色化合物，对测定结果产生较大影响。

（6）尿酮体的检出受肾功能影响，得到的结果不够准确。

（7）长期饥饿，营养不良，剧烈运动后也可阳性反应。

除了对血和尿进行分析之外，对呼出气体中的酮体含量进行检测也得到了广泛的研究。因为肺部血液中的丙酮挥发，扩散进入肺泡，最后被呼出，所以，当丙酮的扩散达到平衡状态时，呼出气体中的酮体含量与血液中的酮体含量成一定的比例关系，即对呼出气体中的酮体进行检测能够比较准确地反映血液中的酮体水平。气相色谱技术已被成功应用于检测呼出气体中的丙酮含量。

目前被大量研究和使用的是热解吸-气相色谱法，这是一种检测微量挥发性组分的有效方法。操作步骤如下：先将被测试人的呼出气样采集到吸附管内并将吸附管两端密封待测，去掉吸附管两端的封口并把它装入热解吸仪，解吸一段时间后，在一定的色谱条件下，以保留时间定性，谱图的峰面积定量，并与得到的标准曲线相对照，即可得出呼出气样中的丙酮含量，推算出血液中的酮体含量。气相色谱法虽然可以对呼出气体中的丙酮进行定量的检测，但由于丙酮的含量很低，测量误差较大，而且所用的仪器较昂贵，操作步较复杂，因此，气相色谱法很难在临床及亚临床酮体检测中广泛应用。

能够对酮体中含量最高的β-羟丁酸进行检测一直是相关领域的研究人员努力的方向。随着β-羟丁酸脱氢酶纯化技术的发展，利用其检测β-羟丁酸已成为可能。比色法由于具有操作简便、结果直观等特点，也被率先应用于β-羟丁酸的检测。早期人们利用比色法检测β-羟丁酸是基于以下显色反应：

β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下与辅酶NAD作用生成乙酰乙酸和NADH，生成的NADH将无色的染料四唑（tetrazolium）还原为紫色的物质甲瓒（formazan），由于颜色变化的程度与样品中β-羟丁酸的浓度有关，可对β-羟丁酸进行半定量的检测。后来又有人对该反应进行了改进，加入了电子中继体（如甲硫吩嗪），即NADH先将电子传递给中继体，然后由还原态的中继体将tetrazolium还原为formazan，这样能够观察到更明显的颜色变化，提高检测的灵敏度。然而由于染料tetrazolium对测试样品中的抗坏血酸和谷胱甘肽非常敏感，所以会给检测结果带来很大的误差。有人提出用对硫醇类化合物敏感的染料代替tetrazolium，并用硫辛酰胺作为电子中继体，不但能观察到明显的颜色变化，还能有效地减小样品中其他物质带来的误差。以上面的显色反应为基础，研究人员制作出了β-羟丁酸试纸条，待检样品滴到试纸条上一段时间后，或者与比色卡相对照得出结果，或者由反射计自动显示结果。

虽然比色法方便、快速，但它只能进行定性和半定量的检测。因此，用于定量测定β-羟丁酸的分光光度法得到了非常广泛的研究和应用。该法灵敏度高，速度快，样品用量少，不需要提纯或预处理便可直接测定，适用于各种型号的生化自动分析仪。

反应原理：β-羟丁酸被β-羟丁酸脱氢酶催化脱氢，氧化生成乙酰乙酸，同时使NAD还原成NADH；NADH在340波长有最大吸收峰，NADH生成速率与血清β-羟丁酸的浓度成正比。

试剂：

（1）缓冲液

Tris缓冲液　0. 1mol/L

EDTA　2mmol/L

草酸　20mmol/L

（2）酶及辅酶

β-羟基丁酸脱氢酶　0. 6U/10ml

NAD　2. 5mmol/L

（3）β-羟丁酸标准储存液（20mmol/L），溶解307mg β-羟丁酸（钠盐）于50ml蒸馏水中，在4℃冰箱中保存，标准液（2mmol/L）：以上述缓冲液10倍稀释。

在试验时，用试剂1缓冲液10ml溶解试剂2时，在室温可稳定1天。

操作步骤见表9-2。

混匀，37℃保温半分钟后，在340nm波长以空白管调零，读取各管第一次吸光度。然后每隔1分钟读取1次，连续测定3分钟，求出各管平均每分钟的吸光度度数（△A）。

计算

参考区间：健康成年人血清β-羟丁酸为0. 03～0. 30mmol/L

注意事项：

（1）β-羟丁酸测定已有市售试剂盒供应，应选用有批准文号的优质试剂，此法适用于各种型号的生化自动分析仪，应严格按照说明书及试剂盒说明进行操作。

（2）建议每个实验室建立自己的参考范围，以反映年龄、性别、饮食以及地理环境的差别。

（3）本法线性范围在0. 1～3. 2mmol/L，若标本浓度超过3. 2mmol/L浓度，应用生理盐水稀释血清，结果乘以稀释倍数。

（4）试剂中含有草酸，可以抑制乳酸脱氢酶对血清中乳酸的氧化反应。

（5）试剂中含有防腐剂NaN ₃，不可用口吸，不要接触皮肤和黏膜。处理试验的废液，应遵照处理NaN ₃的规定进行。

（6）每天都要做室内质控，最好作两个水平的质控，所得数值应落在指定范围内。

（7）Hb达10g/L、乙酰乙酸达2. 5mmol/L，胆红素达160μmol/L对本法不产生干扰，TG＞12mmol/L可使D-3-羟丁酸轻度增高。

电化学生物传感器包括生物敏感膜和物理换能器两个主要组成部件，它把固定化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：酶体系的高选择性和催化能力保证它能够直接在复杂的样品中进行检测；电化学电极的高灵敏度保证它能够对含量较低的物质进行准确的测定。它的检测原理是：使被测物质通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别，发生生化反应，再由物理换能器将得到的信息转换成易于定量检测的、与被测物浓度相关的电信号。

从20世纪80年代开始，有关β-羟丁酸电化学生物β传感器的研制陆续被报道出来。我国公司也研制开发出以电化学传感器为基础的便携式酮体测试仪。T-1型便携式血酮体测试仪是以电化学传感基础制成，用于快速检测静脉/末梢全血的β-羟丁酸。其检测原理为：血液中的β-羟丁酸与固定在表面的β羟丁酸脱氢酶反应，β-羟丁酸被氧化生乙酰乙酸（ACAC），同时NAD被还原为NADH；NADH与硫辛酰胺脱氢酶反应，同时还原铁氰化钾，产生NAD和亚铁氰化钾。信号检测仪向试条施加一恒定的工作电压，使亚铁氰化钾氧化氰化钾，产生氧化电流，氧化电流的大小与βHB浓度成正比。信号检测仪记录氧化电流的大小，并换算出βHB的浓度。反应式为：

βHB+NAD+2H ⁺β羟丁酸脱氢酶AcAc+NADH

NADH +K ₃Fe（CN） ₆硫辛酰胺脱氢酶K ₄Fe（CN） ₆ +NAD+e ^-