胃肠肝胰肿瘤淋巴系统解剖与临床
上QQ阅读APP看书,第一时间看更新

第六节 氢氧化钾胶原酶消化法

上述的淋巴管铸型扫描电镜观察方法可研究小肠、胃和阑尾等器官淋巴管的三维立体结构和相互交通吻合情况,以及其与血管的位置关系,使淋巴管研究有了新的进展,但是,铸型标本的周围组织已腐蚀,不能直接观察到淋巴管的腔外结构及淋巴管内皮细胞与其他细胞成分的空间关系。
由20世纪80年代开始人们探讨如何选择性地去除组织内的结缔组织,而保留细胞成分,用扫描电镜观察淋巴管。Miller(1982)和Ushiki等(1988)使用氢氧化钾和胶原酶消化处理大鼠空肠标本,然后进行扫描电镜观察,成功地观察了大鼠小肠淋巴管的全貌,展示了各层淋巴管的三维结构,明确了淋巴管与其他细胞成分的空间关系(图3-14,15)。在淋巴管的研究中,如能将淋巴管铸型与氢氧化钾胶原酶消化法相结合,定会取得器官内淋巴管与其周围组织的空间关系及立体构筑的资料。
其具体方法是取经过灌流固定的大鼠空肠,固定后用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗数次,置于5mol/L KOH液内7~10分钟(60℃)腐蚀,缓冲液冲洗后再浸入1mg/ml的Ⅱ型胶原酶磷酸缓冲液(pH 6.8)中3~5小时(37℃)消化,用缓冲液或蒸馏水洗后,导电染色,置于单宁酸水溶液中2~3小时,蒸馏水洗至少1小时,于1% OsO 4中数小时染色(室温),系列酒精脱水,乙酸异戊酯置换,液态CO 2临界点干燥,干燥的标本用导电胶黏附于铝座上,在双目解剖镜下用针和尖镊子分割,然后用离子喷涂仪喷铂,在加压电压15kV下,于扫描电子显微镜下观察和摄片。
图3-14 大鼠小肠黏膜层乳糜管(氢氧化钾胶原
酶消化法,扫描电镜× 1800,引自Ushiki,1990)A.小动脉;L.淋巴管
图3-15 大鼠小肠黏膜乳糜管(氢氧化钾胶原
酶消化法,扫描电镜× 360,引自Ushiki,1990)Ls乳糜管底部;Cr黏膜下层淋巴管;↑示乳糜管
氢氧化钾胶原酶消化法是用药品把结缔组织内的胶原纤维和弹性纤维溶解去除,将埋在组织内的细胞等成分暴露出来,再进行扫描电镜观察,可取得较好的研究成果。但应注意不同标本的腐蚀和消化的时间和温度,对于成功地显示淋巴管非常重要,若把握不好则可能破坏细胞。