第二章 微生物学实验

模块一 验证性实验

实验一 培养基的制备与灭菌：实验环境和人体表面的微生物检查；观察微生物标本

一、实验目的

（1）比较不同场所下细菌的数量和类型。

（2）体会无菌操作的重要性。

（3）学习并掌握显微镜的使用方法；初步认识细菌的形态特征。

（4）学习培养基的制作方法。

二、实验原理

1.培养基的制备与灭菌

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的由不同营养物质组合配制而成的营养基质。因微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素和水分等营养成分。另外，培养基还应具有适宜的pH、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性会降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备分离纯培养物用。培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

2.实验环境和人体表面的微生物检查

取自不同来源的样品接种于平板培养基上，在37℃下培养1～2d，每一菌体即能通过繁殖形成一个肉眼可见的细胞群体的集落——菌落。每一种细菌所形成的菌落都有其特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

3.显微镜的基本结构及油镜的工作原理

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加香柏油，这主要有如下两方面的原因。

（1）增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100倍，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，而物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时需在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n=1.52）。

（2）增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力（resolution or resolving power）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=λ/2NA，式中λ为光波波长；NA为物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n×sinα，式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120°，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般为1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

多种微生物标本。

2.仪器

显微镜、电炉、高压灭菌锅、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、台秤、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、线绳、牛皮纸、乳胶管等。

3.试剂

蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、5%氢氧化钠溶液、5%盐酸溶液。

四、实验步骤

（一）培养基的制备与灭菌

1.培养基的制备

（1）牛肉膏蛋白胨培养基 配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1000mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

（2）马铃薯培养基 配方为：马铃薯200g，蔗糖（葡萄糖）20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然。

马铃薯去皮，切成小块，煮沸20～30min，用纱布过滤后滤液加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000mL。121℃灭菌20min。

（3）制备方法

①称量药品：根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂暂时不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

②溶解：用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉或电磁炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。

③调节pH：根据培养基对pH的要求，用5%氢氧化钠或5%盐酸溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。

④溶化琼脂：固体或半固体培养基需加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一边搅拌一边加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

⑤分装：分装时注意不要使培养基沾染管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

⑥包扎标记：培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。

⑦灭菌：上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃、20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成分。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体琼脂。

⑧倒平板：将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃，立刻倒平板。

2.灭菌方法

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理灭菌法和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

（1）湿热灭菌

①煮沸消毒法：注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸15～30min，对于芽孢则需煮沸1～2h。

②高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm²时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

高压蒸汽灭菌法的操作方法和注意事项：

a.加水：打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

b.装料、加盖：灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。

c.排气：打开排气口（也叫放气阀）。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。

d.升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时，即可关闭放气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

e.灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。

（2）干热灭菌 通过使用干热空气杀灭微生物的方法称作干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。

干热灭菌常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品、液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。

①灭菌前的准备：玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿在灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；在三角瓶棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端将其包起，逐步向上卷，将头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。

②干燥箱灭菌：将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30min即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。

用此法灭菌时，绝不能用油纸、蜡纸包扎物品。

③火焰灭菌：直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环、接种针或其他金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也通过火焰而达到灭菌的目的。

（二）实验环境和人体表面的微生物检查

1.标记

首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。用记号笔写上班级、姓名、日期及样品来源。字尽量小些，写在皿底的一边。

2.实验室细菌检查

（1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。15～30min后盖上两个皿盖。

（2）实验台和门的旋钮

①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。

②取棉签：左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞（或试管帽），并将空试管放在试管架上。

③弄湿棉签：左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。

④取样：将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约1cm²的范围。

⑤接种：在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。并将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架上。

⑥划线：另取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。

左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处。

闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿接种环再在火焰上烧灼、冷却。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，从上向下来回划线至1/2处。

烧灼接种环，转动平板，划最后1/4，划完后立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。

3.人体细菌的检查

（1）手指（洗手前与洗手后）

①分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。

②移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。

③用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。

（2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。

（3）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离嘴6～8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。

（4）鼻腔

①按照实验台检查法的步骤②和③，取出棉签，并将其弄湿。

②用湿棉签在鼻腔内滚动数次。

③按实验台检查法的步骤⑤和⑥，接种与划线，然后盖上皿盖。

最后，将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放入37℃培养箱，培养1～2d。

（三）显微镜观察微生物标本

1.观察前的准备

（1）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm。镜检时姿势要端正。

取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。

（2）光源调节 通过调节电压使镜座内的光源灯获得适当的照明亮度。

（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

（4）聚光器数值孔径值的调节 调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。

在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。

2.显微观察

在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。

（1）低倍镜观察 将金黄色葡萄球菌或其他染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜接近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。

（2）高倍镜观察 低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。

在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，在转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦（par-fo-cal）。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器可能的误操作而损坏镜头或载玻片。

（3）油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。

有时按上述操作还找不到目的物，可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。

3.显微镜用毕后的处理

（1）上升镜筒，取下载玻片。

（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。

（4）各部分还原，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

五、结果与讨论

（1）绘制出各微生物标本的形态。

（2）记录实验环境和人体表面的微生物情况。

六、注意事项

（1）分装时不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。

（2）平板划线接种时，接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。整个划线操作均要求无菌操作，而且动作要快。

（3）显微镜观察时，特别注意不要在下降物镜镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。

参考文献

[1]沈萍．微生物学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，1999.

[2]刘慧．现代食品微生物学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2006.

[3]沈萍，范秀荣，李广武．微生物学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，1999.

实验二 细菌形态学观察（一）：革兰染色

一、实验目的

（1）掌握革兰染色法的原理和操作方法。

（2）了解革兰染色法在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验原理

革兰染色法将细菌分为革兰阳性和革兰阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和化学组成的不同而决定。当用结晶紫初染时，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘液作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰阳性菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰阴性菌因其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当进行脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

革兰染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物。

2.仪器

显微镜、酒精灯、滴管、烧杯、试管架、滤纸、载玻片、盖玻片、镊子、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸等。

3.试剂

无菌水或无菌生理盐水、革兰染色液（结晶紫液、碘液、95%乙醇、番红染色液）。

四、实验步骤

（1）制片 取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

（2）初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为易）染色1～2min，倾去染色液，水洗至流出水为无色。

（3）媒染 加碘液媒染约1min，水洗。

（4）脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

革兰染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节。脱色不足，革兰阴性菌被误染为革兰阳性菌；脱色过度，革兰阳性菌被误染为革兰阴性菌。脱色时间一般控制在20～30s。

（5）复染 用番红染色液复染约2min，水洗，干燥。

（6）镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰阳性菌（G⁺），被染成红色的为革兰阴性菌（G^-）。

五、结果与讨论

（1）根据观察结果，绘制两种细菌的形态图。

（2）列表简述两株细菌的染色结果（说明各菌的形态、颜色和革兰染色反应）。

六、注意事项

（1）涂片上的菌液不能太浓，且涂抹均匀，否则影响脱色的均匀度及观察结果。

（2）乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节，必须严格掌握脱色时间。

参考文献

[1]沈萍．微生物学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，1999.

[2]廖延雄．革兰氏染色与革兰氏变性[J].中国兽医科技，2003（5）：73-74.

[3]黄元桐，崔杰．革兰氏染色三步法与质量控制[J].微生物学报，1996，36（1）：76-78.

[4]陈菊滟，陈文娟，赵桂芳．教学用细菌染色方法的改良[J]，微生物学通报，1999，26（2）：128-129.

实验三 细菌形态学观察（二）：荚膜染色、芽孢染色；细菌形态观察：菌落制片

一、实验目的

（1）掌握芽孢染色法的原理和操作方法。

（2）学习荚膜染色法，掌握其基本原理。

（3）掌握菌落制片的基本操作方法。

二、实验原理

1.芽孢染色法的原理

利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。芽孢壁比营养细胞的细胞壁致密、透性低，着色、脱色均较困难，因此，一般先用碱性染料如孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体易于区分。

2.荚膜染色法的原理

荚膜是包围在某些细菌胞外的一层黏液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。因荚膜与染料的亲和力弱、不易着色，所以通常用负染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。因荚膜含水量高，故染色时一般不加热固定，以免荚膜变形。

3.菌落制片的原理

放线菌和霉菌都是丝状微生物，为了准确观察其菌丝细胞的形态，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持菌丝在自然生长状态下的形态特征。本实验放线菌的观察采用插片法，霉菌的观察采用载玻片培养法。

①插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长时期的形态。

②载玻片培养法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在盖玻片和载玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

枯草芽孢杆菌培养2d的营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌培养2d的无氮培养基琼脂斜面培养物；链霉菌、黑曲霉、青霉和根霉。

2.仪器

显微镜、木夹子、载玻片、盖玻片、接种环、灭菌平皿、无菌吸管、烧杯、滤纸、U形玻棒、镊子、酒精灯等。

3.试剂

5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、绘图墨水（用滤纸过滤后备用）。

四、实验步骤

1.芽孢染色法——孔雀绿染色法

（1）制片 按常规涂片、干燥、固定。

（2）染色 加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在火焰上微火加热至出现蒸汽并开始计时，4～5min。

（3）水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。

（4）复染 用番红染液复染2min。

（5）水洗 用缓流水洗后，吸干。

（6）镜检 干燥后油镜观察。芽孢呈绿色，菌体为红色。

2.荚膜染色法——负染色法

（1）制备菌体和墨水的混合液 加1滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。

（2）加盖玻片 将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。

（3）镜检 干燥后用油镜观察，背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现明亮透明圈即为荚膜。

3.菌落制片

（1）插片法

①倒平板：取融化并冷却至约50℃的高氏1号琼脂培养基约20mL倒平板，凝固待用。

②接种：用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。

③插片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约45°角插入琼脂内（插在接种线上），插片数量可根据需要而定。

④培养：将插片平板倒置，28℃培养，培养时间根据观察的目的而定，通常3～7d。

（2）载玻片培养法

①培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤片，再放一个U形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，见图2-1，盖上皿盖，包扎后于121℃灭菌30min，烘干备用。

②琼脂块的制作：取已灭菌的马铃薯（或察氏琼脂）培养物6～7mL注入另一灭菌的平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1cm²的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块），制作过程应采用无菌操作。

③接种：用尖细的接种针挑取少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。

④培养：先在平皿的滤纸上加3～5mL灭菌的20%甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，28℃培养3～7d。

五、结果与讨论

观察细菌的芽孢、荚膜的形态特征，并绘制出芽孢、荚膜的形态图。

六、注意事项

（1）荚膜湿墨水染色时，加盖玻片勿留气泡，以免影响观察。

（2）芽孢染色加热时要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

（3）插片法倒平板要厚一些，接种时划线要密。

（4）插片时要有一定角度并与划线垂直。

（5）载玻片培养法的接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。

参考文献

[1]中国科学院微生物研究所编写组．常见与常用真菌[M].北京：科学出版社，1973.

[2]魏景超．真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[3]阎逊初．放线菌的分类与鉴定[M].北京：科学出版社，1992.

实验四 菌种保藏

一、实验目的

（1）学习并掌握菌种保藏的基本原理。

（2）掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。

二、实验原理

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生命活性。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。常用的菌种保藏方法包括斜面保藏法、液体石蜡法、冷冻真空干燥法。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

大肠杆菌、青霉菌、放线菌。

2.仪器

无菌滴管、无菌试管、安瓿管、冻干管、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱（-80℃）等。

3.试剂

液体石蜡、固体石蜡、甘油、干冰等。

四、实验步骤

1.斜面保藏法

2.液体石蜡法

（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm³，121℃灭菌30min，然后放在60℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。

（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。

3.冷冻真空干燥法

（1）准备安瓿管 用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6～7.5mm，长105mm，球部直径9～11mm，壁厚0.6～1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm²，121℃灭菌30min，备用。

（2）准备菌种 用冷冻干燥法保藏的菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。一般，细菌要求24～48h的培养物；酵母需培养3d；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7～10d。

（3）制备菌悬液与分装 以细菌斜面为例，用脱脂牛乳约2mL加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2mL。

（4）冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体二氧化碳）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4～5min，即可使悬液结冰；如有-80℃冰箱，做好能预冻过夜。

（5）真空干燥 为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。

抽气一般若在30min内能达到93.3Pa真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa，保持压力6～8h即可。

（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10min即可达到26.7Pa。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽孢菌都适用，即使一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种的长期保存，一般可保存数年至20余年。

五、结果与讨论

简述各种保藏方法的技术要点及适用范围。

六、注意事项

（1）清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。

（2）熔封安瓿瓶时防止封闭不严；熔封后需要仔细检查每个安瓿瓶的气密性。

参考文献

[1]吕红线，郭利美．工业微生物菌种的保藏方法[J].山东轻工业学院学报，2007，21（1）：52-55.

[2]许丽娟，刘红，魏小武．微生物菌种的保藏方法[J].现代农业科技，2008（16）：99-101.

[3]顾金刚，李世贵，姜瑞波．真菌保藏技术研究进展[J].菌物学报，2007，26（2）：316-320.