胶原的两性及其等电点

胶原（又称生胶蛋白质）是生皮中的主要蛋白质，约占生皮纤维蛋白质总量的98%。生皮的纤维构造和理化性质主要取决于胶原。胶原的两性及等电点是它一项重要的电化学性质，了解这一性质，对于控制制革过程、选择加工材料、探讨反应机理以及掌握制品表面电荷的变化规律是颇有助益的。

一、胶原的两性

胶原的两性，主要是指它两性官能团所显示的弱酸和弱碱性。

（一）胶原的两性官能团

胶原是两性化合物，其两性官能团主要是分布在主链的两个末端和极性侧链上的自由羧基和氨基（包括胍基、咪唑基等）。

研究得知，胶原一级结构的分子（注：一级结构为肽链中各氨基酸根的序列；二级结构为单根肽链的构象；三级结构为三重螺旋体的构象）是由相邻的组分氨基酸以酰胺键（也存在2-5-哌嗪二酮结构）连接而成的高分子链状缩聚物。相对分子质量大于10000，其中的酰胺键（—CO—NH—）称为肽键。可以（1）式表示：

若将（1）式用简单图式示意，则得（2）式：

注：﹏﹏ 为胶原（一、二级结构）主链，含羧基一端为C-端，含氨基一端为N-端。

R为胶原主链上的侧链，是组分氨基酸的残基；其中有极性侧链，含有氨基（在赖氨酸和羟赖氨酸中）、羧基（在天门冬氨酸和谷氨酸中）、胍基（在精氨酸中）、咪唑基（在组氨酸中）以及醇羟基（在羟脯、羟赖氨酸中）和酚羟基（在酪氨酸中）等；非极性侧链主要含烃基。

n为组分氨基酸的数目。n＞1000。在相对分子质量为100000的链段内，大致包含1000个以上氨基酸。

胶原的羧基具有羧酸的特性。它包含羰基和羟基双重结构，其羟基—OH氧原子上的未共用电子对与羰基的π电子共轭，发生离域作用，并形成P-π共轭体系，结果导致羟基氧原子上电子云密度降低，O—H键削弱，故易放出质子（H+），离解成负离子（—COO-），因此具有弱酸性，又称酸性基。羧基的离解平衡如（3）式或（4）式所示。

在（4）式平衡中，加碱（OH-），平衡向右移动，有利于羧基放出质子而离子化；加酸（H+），平衡向左移动，利于羧基离子接受质子而回复非离子态。

注：羧基离子的角电荷并不是集中在某一氧原子上的，而是分散于共轭体系之中。通常为了方便，以形式表示。

胶原的氨基（—NH₂）具有胺的特性。氨基中的氮原子上有未共用电子对，能接受—个质子形成铵离子，因此具有弱碱性，又称碱性基。如（5）式所示。

由于氨基的亲核性，胶原在水溶液中，其氨基有下列（6）式平衡。

在（6）式平衡中，加酸（H+），平衡向右移动，有利于氨基接受质子而铵离子化；加减（OH-），平衡向左移动，有利于氨基离子放出质子而回复非离子态。

（二）胶原的两性反应

胶原与酸和碱的反应是典型的两性反应。

把胶原置于碱性介质中，介质的OH-浓度减小，pH降低；若把胶原置于酸性介质中，则介质的H+浓度减小，pH升高。

生皮浸灰（或碱膨胀）过程中，灰碱液pH降低；浸灰（碱）前后，灰碱液pH变化为：初始pH＞12，终点pH＜10。

裸皮浸酸过程中，浸酸液pH升高；浸酸前后，浸酸液皮pH变化为：初始pH＜2，终点pH＞3。

上述现象表明，胶原具有两性，它既能与碱反应，又能与酸反应。

关于胶原与酸、碱反应的作用点，曾存在两种明显的分歧。

F·石他特在《制革化学及制革工艺学》中，曾用下列（7）（8）两式表示蛋白质与酸、碱反应：

（7）（8）两式仅仅示出反应的结果，却未能揭示反应的机理（如氨基、羧基和介质三者之间质子的传递），尤其是：①忽视了蛋白质本身的内盐特征，即自由氨基和羧基是以离解的形式存在的；②把蛋白质与酸反应的作用点理解为氨基，与碱反应的作用点理解为羧基，这就与大量的实验事实发生矛盾。因而上述（7）（8）示意式是值得商榷的。哈立斯（Harris）用甘氨酸代替胶原在不同浓度甲醛（含HCHO0～32%）存在下进行酸碱滴定的实验，间接地证实胶原与酸、碱反应的作用点。其滴定反应如（9）式所示，滴定曲线见图1。

上述滴定反应式和曲线间接地表明：

（1）加入甲醛，胶原的氨基被封闭，封闭程度取决于甲醛浓度的变化，羧基未参与反应，仍为离解态。

（2）酸滴定时，胶原羧基的离解被抑制，即使改变甲醛的浓度，而酸滴定的曲线并无明显影响，可见作用点在羧基上。

（3）碱滴定时，由于胶原氨基已不同程度地被甲醛所封闭，因此碱滴定曲线发生了相应的变化，可见作用在氨基上。

所以，胶原与酸、碱的两性反应，可定性示意如（10）式所示。

在上述（10）式中，（Ⅰ）表示在无外加电解质存在时，胶原结构中两性官能团呈离解态，正、负离子的电荷在内部达成平衡，整个体系呈电中性，即等电状态；（Ⅱ）表示在碱性介质中，胶原氨基的离解被抑制，羧基仍呈离解态，整个体系呈负电性，其电量为结构中羧基离子所带负电荷的加和；（Ⅲ）表示在酸性介质中，胶原羧基的离解被抑制，氨基仍呈离解态，整个体系呈正电性，其电量为结构中氨基离子所带正电荷的加和。

研究表明，使胶原显示两性功能的官能团主要是极性侧链上的自由氨基和羧基，还有呈碱性反应的胍基、咪唑基等，胶原主链上的端基和肽基作用甚微。至于分布在侧链上的大量羟基（包括醇式和酚式），则与酸、碱几乎不起反应。

胶原与酸或碱反应的产物，为相应的弱碱盐或弱酸盐。其反应如（11）式所示。

在胶原与酸和碱发生两性反应的过程中，还伴随发生某些副反应。其中，最突出的是胶原酰胺结构的水解和异构。

其一，胶原的酰胺基（键）的水解，使链段内的两性官能团增多，导致其电化学性质（如酸、碱容量、等电点）发生相应的变化。反应如（12）（13）式所示。

由于酰胺基的水解，放出氨，结果自由羧基增多，碱容量增加，等电点向pH较低的一边位移。

由于主链酰胺键（肽键）水解断裂，自由羧基和氨基的数量增多，酸、碱容量增加，等电点并无明显变化。

其二，胶原酰胺键（肽键）能缓慢地发生互变异构，由酮式结构转变为醇式结果，其反应活性增大。示意如（14）（15）式所示。

（三）胶原的酸、碱容量

胶原的酸、碱容量是胶原两性反应的定量概念，它能够表征胶原的酸性和碱性功能（即与胶原起反应的酸或碱的最大量），因而通过测定胶原的酸、碱容量，就能知道胶原结构中自由氨基和羧基的数目。

胶原的酸容量是指与胶原结合的酸的最大量（或理解为胶原所能容纳酸的最大量）。在酸性介质中，由于胶原氨基、羧基与介质三者之间的质子传递最终取决于氨基，且每个氨基又能定量地接受一个质子形成铵离子，所以酸容量的数值主要取决于胶原自由氨基数量（这并不意味酸直接参与氨基反应）。酸容量越大，表征氨基数量越多；反之，则越少。若用试剂封闭或消去氨基，则胶原的酸容量会减小。

测定酸容量过程质子传递方式示意如（16）式所示。

胶原的酸容量，通常以每克无水胶原所能吸收HCl的毫克当量数来表示。

胶原的碱容量是指与胶原结合的碱的最大量（即胶原所能容纳碱的最大量）。与酸容量相反，胶原中能与碱反应生成弱电解质水的质子（H++OH-=H₂O），是通过铵离子传递的，而铵离子数又取决于自由羧基的数量及其离解度，因此碱容量的数值主要取决于胶原自由羧基数量（同样也不意味碱直接参与羧基反应）。碱容量越大，表征羧基数量越多；反之亦然。经过羧甲基化反应的胶原，由于部分羧基被封闭，其碱容量会减小。

胶原的碱容量，通常以每克无水胶原所能吸收KOH的毫克当量数来表示。

表1中的数据表明：

（1）天然胶原的碱容量小于酸容量，同时碱容量的理论计算值大大超过其实验值，这是由于胶原结构中的部分羧基因酰胺化或键活化而处于反应态，所以未显示酸性功能。

（2）胶原经碱处理，既促进羧基的离解，使之显示酸性功能，又导致酰胺基水解，释出氨，使自由羧基增多，因此碱容量增加，而酸容量相应有所减小，结果使酸、碱容量的数值趋于接近。

利用胶原的电位滴定曲线，即改变介质的酸、碱程度而引起pH变化的曲线，可以更简明而具体地了解介质的氢离子（或氢氧根离子）浓度的变化，从而得知胶原羧基和氨基的数目及其离解度。

二、胶原的偶极离子

氨基酸是蛋白质的基石。氨基酸的物理性质（如熔点高、不溶于非极性溶剂等）表明，其分子内的氨基和羧基能离解并形成内盐，呈现偶极离子结构。由于胶原组分氨基酸的大部分氨基和羧基，在脱水缩合成多肽时已被酰胺化，剩余者除极性侧链上的以外，主要是两个末端上的氨基和羧基。在等电状态，极性侧链上的羧基负离子与氨基正离子又相互补偿，呈电中性。因此，与氨基酸一样，具有碱性功能的N-端氨基和具有酸性功能的C-端羧基，也能使胶原分子形成内盐，显示偶极离子结构。如（17）式所示。

显微电泳实验表明，胶原在溶液中是以偶极离子的形式存在的。

实验现象：

（1）在无外加电解质存在下，在电泳场中，观察不到胶原质点（胶粒）向电极移动的行为，偶极离子处于安定状态；

（2）用经过碱预处理的胶原，在缓冲溶液中电泳时，能观察到其带电质点循向阳极移动；并且溶液的pH距离等电点越远，质点移动速度越快；

（3）用甲基化反应封闭胶原羧基，然后同“2”进行电泳，则所观察到的是带电质点循向阴极移动。

讨论：

（1）由于胶原偶极离子未受到外加电解质的干扰，处于等电状态，本身呈电中性，因此在电场中质点不发生电泳现象；但据此可以推测，胶原偶极离子会发生定向排列，N-端正离子指向阴极，C-端负离子指向阳极。

（2）由于胶原经碱处理，氨基离子化受到抑制，胶原的偶极遭到破坏，成为带负电的质点，所以在电场中受到阳极的吸引。如（18）式所示。

据此可以推测，若胶原经酸预处理，则会有相反的电泳现象。

（3）由于胶原经羧甲基化反应后，羧基被封闭，失去偶极，成为带正电的质点，所以在电场中受到阴极的吸引。如（19）式所示。

同理可推测，胶原经氨甲基化反应，其电泳现象也将相反。

生皮在纯水中所发生的充水现象，也能证实胶原偶极离子的存在。根据静电理论，生皮在纯水中的充水作用，除了氢键作用外，水合水的存在，表明胶原偶极离子（包括侧链上极性基离子）与极性水分子之间存在静电作用力。由于极性水分子在胶原偶极离子的异性静电场内形成定向排列，并聚集成水化膜，致使胶原充水。如图2所示。

胶原的偶极离子也具有两性功能，与分布在极性侧链上的大量离解的氨基和羧基相比，其两性功能显得微小。

三、胶原的等电点

（一）何谓等电点？

所谓等电点，就是带电质点呈电中性时溶液的pH。

胶原是两性化合物，等电点时，胶原离解基的正、负电荷总量应该相等，净电荷为零。

（二）胶原等电点的位移

胶原的等电点具有位移性。未经任何处理的生皮，其胶原的等电点取决于结构中离解基所带异电荷的自身平衡。当生皮经酸、碱、蛋白酶或改性剂处理后，其胶原结构中的离解基将会出现不可逆地增多或减少，致使离子异电荷的对比关系发生变化，为使正、负电荷对比重新趋向平衡，再现电中性，势必相应变动介质的[H+]或[OH-]，其结果介质的pH出现上升或下降，等电点的位置发生位移。

胶原电位滴定曲线变化表明等电点的位移性。

例如，分别用改性剂使胶原去氨基和甲基化，所得的电位滴定曲线不同，从中发现胶原等电点发生了位移。如图3所示。

正常胶原的等电点pH约为7（图3曲线Ⅰ）。

去氨基胶原，由于碱性基不可逆地减少，使体系呈负电性，带电中心为COO-，要趋向等电状态，再现电中性，介质必须提供相应的质子，于是出现等电点向酸性一边位移，等电点下降为pH＜5.0（图3曲线Ⅱ）。

甲基化的胶原，则因酸性基不可逆地减少，使体系呈正电性，带电中心为，与去氨基情况相反，介质必须提供相应的OH-，于是出现等电点向碱性一边位移，等电点上升为pH＞9.0（图3曲线Ⅲ）。

胶原经酸、碱处理，其等电点发生位移的结论，已为生皮浸灰（碱）和裸皮浸酸等工序的生产实践所证明。

例如：生皮经过浸灰（减），其等电点移向酸性区域，pH由7左右下降至4.7～5.3；裸皮经过浸酸，其胶原等电点移向碱性区域，pH由7左右上升至7.8～9.3。

K.H.古氏塔夫逊（Gustavson）在研究铬鞣时发现，用阳离子铬络合物鞣皮时，胶原的等电点由pH5位移到pH6.0～7.0；而用阴离子铬络合物鞣皮时，则由pH5位移到pH3.8～4.8。

综合大量研究和实践的结果，胶原等电点的位移有如下规律：封闭胶原的碱性基（即减少正电荷）或增加胶原的酸性基（即增加负电荷），等电点向酸性方向位移。由此得知，用碱（OH-）或阴离子型的鞣剂、染料、加脂剂、助剂处理生皮，则其等电点移向酸性区域。

封闭胶原的酸性基（即减少负电荷）或增加胶原的碱性基（即增加正电荷），等电点向碱性方向位移。由此得知，用酸（H+）或阳离子型的鞣剂、染料、加脂剂、助剂处理生皮，则其等电点移向碱性区域。

关于胶原等电点的位移，归纳见图4，并列成表2。

胶原的等电点，取决于其离解基的反应活性及离解度。因此，导致胶原等电点发生位移的基本原因是离解基的化学反应和介质的变化。

当胶原的离解基参与某一反应而被取代、封闭或消去时，将导致等电点发生不可逆的位移。例如，一浴法铬鞣时，胶原的酸性基与阳铬络离子配位形成交联，使酸性基被封闭，数量减少，于是等电点位移而升高。如（20）式所示。

又如，用磺酰氯预鞣时，胶原碱性基上的氢被取代，生成砜亚胺结构，使碱性基数量减少，于是等电点位移而降低。如（21）式所示。

当介质的pH变化时，由于离解基的离解受到暂时性的抑制，胶原等电点所发生的位移一般是可逆的。

（三）胶原在等电点时的特性

1.稳定性

大量研究表明，在等电点时，胶原在物理-化学性质方面处于最稳定状态，表现为溶解度、黏度、渗透压、膨胀性、导电能力以及与鞣质、染料、加脂剂、助剂的反应活性和结合量最小。

图5、图6所示的胶原膨胀曲线和吸收鞣质曲线，表明在等电点时，均为曲线的峰谷，说明胶原的膨胀度、与鞣质的结合量达最小值。由此可知，胶原在等电点时呈现极大的稳定性。

利用胶原在等电点时的稳定性，可以采用电位滴定、电泳、电渗或膨胀法测定其等电点，见表3。对于不溶性的胶原，采用酸性或碱性染料以染色法测定其等电点更为方便，因为在相当于等电点的pH时，其染料的吸收固定量具有最小值。

2.电性

胶原在等电点时，其两性官能团处于离解态，离子电荷达成平衡，体系呈电中性。但重要的是当等电点发生位移，则电性随之发生变化，而且电荷性质和强弱程度取决于等电点的位移值（即由原等电点位移的相对距离）。彼此间有如下关系：

（1）当胶原等电点由原点向碱性方向位移时，胶原带负电荷；若向酸性方向位移时，则带正电荷。

（2）胶原等电点的位移值越大，体系所显示的电性越强，反之则越弱。

洛勃（Loeb）的动物胶与AgNO₃试剂 作用的实验是上述关系的一个例证。经过预处理的动物胶，当其pH高于4.7（原等电点）的样品与AgNO₃试剂作用，能生成动物胶银（H₂N—R—COOAg），遇日光后氧化成棕黑色，从而证明样品是带负电荷的；而pH低于4.7的样品则无此现象，证明后者是带正电荷的，不能与Ag+反应，产物为动物胶硝酸盐（HOOC—R—NH₃NO₃）。

（四）胶原等电点的应用

蛋白质等电点这一电化学性质，已被广泛地用于蛋白质的研究领域。例如，蛋白质、多肽及氨基酸的分离与合成、分析与鉴定等。工业生产上则利用等电点的特性对蛋白质类物进行分离和提纯，从而制取蛋白质及其制品。例如，制革工业采用碱溶解毛（角蛋白）后，以酸沉淀法制取“毛蛋白”（又称毛酪素）；发酵工业采用铵盐沉淀微生物的代谢物——酶，制取酸制剂。

胶原的等电点，在制革生产上的应用，主要表现在以下两方面：

其一，利用胶原等电点的特性，控制加工过程中（尤其是鞣制、染色、加油等过程）皮革与材料间的渗透与结合。

以铬鞣革用阴离子染料染色为例。通常的染色工艺是先中和铬鞣革，并在染色初加氨水缓染，又在染色后期加酸促染，究其原理，乃以等电点的位移控制过程的渗透与结合也。兹扼要说明之。

裸皮经一浴法铬鞣，其等电点的pH大约由5位移至7，而铬鞣革出浴后的实际pH约为4，两者差距甚大，这意味着铬鞣革表面正电荷很强，染色初期与阴离子染料接触，未经渗透就很快结合，不利匀染或造成表面着色，所以根据图4所列使等电点位移的规律，加碱中和（直接用弱碱中和铬鞣革或补加氨水提高染浴pH），使铬鞣革的pH升高到6，以接近其等电点。这样就有助渗透，减缓结合，实现匀染。染色后期，为了促进上色，提高铬鞣革与染料的结合量，则以加酸降低染浴（连同铬鞣革）pH，使之与等电点的差距增大。由于铬鞣革的正电性增强，与阴离子染料亲和力又重新提高，所以加速上色。

同理，也能主动地控制其他过程的渗透与结合。

其二，利用胶原等电点的位移，可以判别制品的表面电荷，从而恰当地选择、应用各种制革材料。

如前所述，当胶原的等电点向酸性方向位移时（即pH降低时），其碱性基离子化程度增大，正电荷增加，与阴离子型制革材料的反应活性增强；当胶原的等电点向碱性方向位移时（即pH升高时），其酸性基的离解程度增大，负电荷增加，与阳离子型制革材料的反应活性增强。如图7所示。

综上所述，可以得知以下几点：

（1）制革湿加工过程中所发生的一系列化学反应，很大程度上取决于胶原两性官能团的功能。例如，浸灰（碱）与脱灰（碱）、浸酸与去酸、鞣制与中和（漂洗）等过程中发生的离子反应（电价键），本质上均系胶原的两性反应。即使是某些非离子反应（如原子间的配位键、共价键，分子间的氢键、范德华力等），也与两性官能团的反应活性有关。

（2）等电点是一个pH概念。胶原的等电点及其位移是湿加工过程选择化工材料，实行技术控制的主要依据，生产上调节、控制浴液和制品的pH，除工序的特定目的外，主要是为了使等电点根据需要发生位移，以利渗透与结合。

（3）皮革在生产过程中表面电荷的性质和程度，取决于等电点的位移值。当等电点向碱性方向位移时，制品带负电荷，反之则带正电荷；位移值越大，电性越强，反之则越弱。

明乎此，就能增强技术控制方面的主动性，摆脱选用材料方面的混乱性。

附言：本文承上海皮革公司张西林总工程师的指导，特此鸣谢。

（原载《皮革科技》1980年第4期、第5期）