实验二 还原糖和总糖的测定——3，5—二硝基水杨酸比色法

一、实验目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3，5—二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3—氨基—5—硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅呈正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验仪器与试剂

1.材料

小麦面粉1000g。

2.仪器

具塞玻璃刻度试管 20mL，滤纸，烧杯 100mL，三角瓶 100mL，容量瓶100mL，刻度吸管1mL、2mL、10mL，恒温水浴锅，煤气炉，漏斗，天平，分光光度计。

3.试剂

6mol/L HCl，6mol/L NaOH，酚酞指示剂。

（1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3，5—二硝基水杨酸（DNS）试剂 称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。

（3）碘—碘化钾溶液 称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

四、实验内容

1.制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按下表分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3，5—二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540nm，用0号管调零点，等后面7～10号管准备好后，测出1～6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2.样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取 准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在 100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（2）总糖的水解和提取 准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解30min，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

（3）显色和比色 取4支20mL具塞刻度试管，编号，按下表所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出7～10号管的光密度值。

五、实验结果与计算

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖质量（mg），按下式计算出样品中还原糖和总糖的含量（以葡萄糖计）。

六、注意事项

（1）标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。

（2）面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

七、思考题

（1）在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？

（2）标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？

（3）绘制标准曲线的目的是什么？