3.1.3　黄酒麦曲制作过程中的主要微生物构成

麦曲微生物群落较为复杂，含有霉菌、细菌及酵母，这些微生物很大程度上决定了黄酒的风味、口感。麦曲为微生物的生长繁殖提供了各种营养物质和环境条件，微生物群落代谢产生各种酶类和风味前体物质，使得麦曲具有糖化力、蛋白质分解力、发酵力和酯化力等。麦曲中的微生物在投料时被带入到黄酒发酵体系中，通过协同相互作用将发酵醪中的淀粉、糖、脂肪、蛋白质等分解为酯类、酸类、醇类、醛酮类和芳香族类等各种小分子物质，从而对黄酒的风味和品质产生了重要的影响。因此，深入地了解麦曲中的微生物群落结构对于明确黄酒复杂的发酵机理具有非常重要的意义，而解析黄酒的发酵机制可更有效地调控麦曲微生物的发酵进程，从而科学地指导生产品控以及提升黄酒品质。

3.1.3.1　麦曲制作过程中的主要细菌菌群种类

（1）依赖培养的方法

绍兴黄酒麦曲中的常见细菌有芽孢杆菌属和葡萄球菌属及少量泛菌属、肠球菌属等的细菌。有研究从黄酒麦曲中分离得到3种芽孢杆菌属，包括地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。此外，从北宗黄酒麦曲中分离纯化得到地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）、克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）、根际芽孢杆菌（Bacillus rhizosphaerae）、索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）等7株芽孢杆菌。

（2）不依赖于培养的方法

非培养的宏基因组学技术的产生很好地弥补了传统培养的不足，它直接通过检测样品中的基因组DNA对微生物进行分析，避开了对微生物进行纯化培养的步骤。不依赖于培养的技术主要包括16S rDNA文库构建法、基因芯片、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、焦磷酸测序（pyrosequencing）和三代测序分析（single-molecule sequencing）等技术。采用PCR-DGGE方法分析了熟麦曲、传统工艺机制曲和传统工艺手工曲中细菌组成，发现3种麦曲中均有糖多孢菌属、肠杆菌属等多个种属的细菌，传统工艺手工曲中还鉴定出了高温放线菌属的微生物；传统工艺机制曲和传统工艺手工曲中还鉴定出枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，但是熟麦曲中未鉴定出枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，并且熟麦曲中鉴定到的细菌种类都包含于机制生麦曲中的细菌群落，这表明不同工艺的黄酒麦曲中细菌群落结构存在着一定的差异。

①块曲微生物群落结构

生麦曲的微生物群落结构随生产年份、地域，甚至是酒厂的不同而有差异，但整体群落结构仍以原核微生物为主。宏基因组测序研究发现麦曲微生物群落中放线菌含量最高（40%～70%），其次是厚壁菌门（6%～32%）、变形菌门（<5%）和子囊菌门（<5%）。由此可见麦曲中主要的丝状微生物应为放线菌，而非通常认为的霉菌。通过高通量测序技术发现绍兴地区块曲2018年的微生物群落如图3-8，其主要的微生物为糖多孢菌属放线菌（72.28%），尤以披发糖多孢菌（Saccharopolyspora hirsuta）、Saccharopolyspora rectivirgula、山东糖多孢菌（Saccharopolyspora shandonggensis）为主，而真菌含量极少。用宏基因组测序技术解析其他年份绍兴地区块曲中微生物组成的变化，发现发酵5天麦曲大部分微生物隶属于放线菌门，其中糖多孢菌属的放线菌为最主要的优势菌（30.5%），芽孢杆菌属和葡萄球菌属相对丰度分别为2.8%、2.2%；发酵30天后，麦曲中原核微生物组成发生巨大变化，厚壁菌门和变形菌门的细菌成为优势菌，糖多孢菌属丰度下降至8%，而芽孢杆菌属和葡萄球菌属的丰度分别增加至14.5%和11.6%，可见不同年份、不同发酵时间均会影响麦曲群结构。采用二代测序技术对绍兴地区黄酒生麦曲中细菌群落进行分析，发现相对丰度较高的有芽孢杆菌属、糖多孢菌属及肠杆菌属，其中芽孢杆菌属的相对丰度达到了58.65%，这可能与绍兴地区黄酒麦曲的制作工艺有着较大的关系；利用二代测序技术对上海地区黄酒生麦曲中细菌群落结构进行分析，发现相对丰度大于1%的有芽孢杆菌属（Bacillus，18.59%）和葡萄球菌属（Staphylococcus，1.49%）两种，说明不同地域的黄酒麦曲微生物群落结构有一定的差异，这也是不同厂区酿造的黄酒具有自身品质特色的原因之一。

②接种麦曲微生物群落结构

采用三代测序技术对接种生麦曲细菌群落结构进行解析发现，在接种生麦曲中共有27个细菌属（如图3-9），其中含量大于0.1%的有肠杆菌属（Enterobacter，28.86%）、魏斯氏菌属（Weissella，28.03%）、芽孢杆菌属（Bacillus，10.26%）、葡萄球菌属（Staphylococcus，7.56%）、泛菌属（Pantoea，4.81%）、欧文氏菌属（Erwinia，2.15%）、片球菌属（Pediococcus，0.63%）、乳杆菌属（Lactobacillus，0.50%）、不动杆菌属（Acinetobacter，0.39%）、明串珠菌属（Leuconostoc，0.30%）、乳球菌属（Lactococcus，0.28%）、沙门氏菌属（Salmonella，0.26%）及克雷伯氏菌属（Klebsiella，0.20%），可见生产工艺的改变使接种生麦曲的微生物群落结构也发生了一定程度的变化。接种生麦曲在种水平上共检测到59种细菌，相对丰度大于0.1%的微生物如图3-10所示。其中含量大于1%的有融合魏斯氏菌（Weissella confusa，15.37%）、阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae，9.45%）、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides，6.28%）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，2.12%）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，2.28%）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，3.04%）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，1.94%）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria，1.50%）、成团泛菌（Pantoea agglomerans，1.44%）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，1.30%）、神户肠杆菌（Enterobacter kobei，1.20%）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，1.07%）等。

③接种熟麦曲微生物群落结构

熟麦曲生产过程中原料的蒸煮、焙炒等过程，既是将麦子做熟，也是杀灭麦粒附着微生物的过程，使熟麦曲中接入的微生物占据绝对优势。接种熟麦曲微生物群落结构以接入的纯种黄曲霉苏-16为主。由于生产过程中进行高温灭菌和随机接种，细菌群落结构表现出较大的复杂性和波动性。

如采用PCR-DGGE与二代高通量测序技术相结合的方法对熟麦曲中细菌多样性进行解析，发现芽孢杆菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、片球菌（Pediococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）和乳酸杆菌（Lactobacillus）普遍存在于接种熟麦曲样品中。具体分析发现熟麦曲中的细菌门主要为厚壁菌门（Firmicutes，87.95%）、变形菌门（Proteobacteria，9.00%）和放线菌门（Actinobacteria，1.16%）。细菌属主要为芽孢杆菌属（Bacillus，70.70%）、魏斯氏属（Weissella，8.55%）、葡萄球菌属（Staphylococcus，2.67%）、克雷伯菌属（Klebsiella，2.29%）、泛菌属（Pantoea，1.32%）和乳杆菌属（Lactobacillus，1.07%），由此可见，芽孢杆菌属（Bacillus）为熟麦曲中的优势细菌。

结合上述研究内容并对绍兴地区黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落结构进行分析，发现接种熟麦曲中原核生物的绝对含量要远低于生麦曲，细菌种类比生麦曲少且熟麦曲鉴定出的细菌种类都包含于生麦曲中，这可能与两种麦曲的制作工艺有关。生麦曲的制曲时间需1～2个月，暴露在环境中的时间较长，导致其中含有的微生物种类较多；而熟麦曲的制曲时间较短（一般为40多个小时），制曲过程中的蒸煮环节会杀灭原料上附着的部分微生物，且接入纯种黄曲霉后可能会对其他微生物的生长产生一定的抑制作用。

3.1.3.2　麦曲制作过程中主要真菌菌群种类

（1）依赖培养的方法

麦曲中的微生物主要包括各类丝状真菌、细菌和酵母菌，这些微生物在黄酒的发酵过程中发挥着重要作用。由于原料、制曲工艺的不同，不同种类的麦曲在微生物群落结构上会存在一定的差异，导致麦曲中形成的酶系组成不同，最终影响黄酒的品质。目前，国内已对黄酒麦曲中的微生物群落进行了一定的研究，主要集中在真菌群落方面。

近年来利用传统分离培养方法从麦曲中分离得到多种真菌。从接种生麦曲中共分离出23株真菌，其中包括12株霉菌和11株酵母。曲霉属和青霉属真菌是接种生麦曲传统培养得到的主要真菌，其中曲霉属是广泛应用于酿酒的真菌类群，具有较高的糖化力，同时对高糖和高盐有较强的耐受性，对分解淀粉质等多糖有着重要的作用。在接种生麦曲中共得到11株酵母，与GenBank中最相似序列进行比对，结果显示共有3株库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、4株Cyberlindnera fabianii，以及弗比恩毕赤酵母（Pichia fabianii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、褶皱假丝酵母（Candida rugosa）及克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）各1株。传统分离培养和三代测序结果都说明接种生麦曲中含有大量的非酿酒酵母。在对曲药的研究中指出，虽然非酿酒酵母产酒精能力不及酿酒酵母，但是在黄酒发酵过程中对风味的形成也有着重要的作用。从北方黄酒麦曲中筛选得到5株霉菌和1株酵母，分别鉴定为多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、产紫青霉（Penicillium purpurogenum）、杂色曲霉（Aspergillus versicolor）、交链孢霉（Alternaria mali）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。以广东客家黄酒酒曲为对象，对黄酒发酵用红曲、麦曲和酒药中的微生物进行分离。从红曲中分离出2株真菌，其中红曲霉1株和酵母1株；从麦曲中分离出7株真菌，其中毛霉1株、曲霉4株、根霉1株和酵母1株；从酒药中分离出6株真菌，其中根霉1株、曲霉4株和酵母1株。有研究从黄酒麦曲中分离到黄曲霉（Aspergillus flavus）、犁头霉（Absidia）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）和锁掷孢酵母（Sporidiobolus）。采用3种培养基分离麦曲中的微生物，从麦曲中筛选出16株丝状真菌。将这16株丝状真菌的ITS序列的测序结果提交到GenBank数据库，利用Blastn工具进行序列比对后，16株丝状真菌分别为伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉、构巢裸孢壳、黑曲霉、青霉（Penicillium thiersii）、草酸青霉、赛氏曲霉、鲁西坦念珠霉、克鲁赛念珠霉、链格孢菌、苹果链格孢菌、尖孢枝孢菌和芽孢枝孢菌。运用传统培养的方法并结合ITS序列分析技术对南通白蒲黄酒麦曲中的真菌群落结构进行分析探讨，经过分离鉴定发现南通白蒲黄酒麦曲中的主要丝状真菌为芽枝状枝孢霉、白曲霉、米曲霉、粒状青霉和产黄青霉，其含量分别为24%、25%、6%、18%和22%，与绍兴麦曲中的真菌种群（主要是伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉和少量青霉）有较大差异。

（2）不依赖于培养的方法

随着科技的进步，研究的方法与手段也越来越先进，对于麦曲中微生物的研究更加全面透彻。通过传统培养与现代分子免培养（即RISA指纹图谱技术和PCR-DGGE技术）相结合全面解析了绍兴黄酒麦曲（包括传统工艺机制曲、传统工艺手工曲、熟麦曲）中微生物群落结构，研究结果表明，微生物种类以传统工艺手工曲最为丰富，机制曲其次，熟麦曲最少。在麦曲整个微生物体系中，真菌的种类和数量是占绝对优势的，包含曲霉属、根霉属、链格孢属、横梗霉属、散囊菌属、毛霉属、酵母菌属和犁头霉属等多个属种的真菌。利用传统分离培养和免培养（RISA图谱）方法对上海地区和安徽地区的生麦曲进行了分析比较，结果显示在上海麦曲中主要含有9种真菌，分别是横梗霉、伞枝犁头霉、萨氏曲霉、米曲霉、微小根毛霉、阿姆斯特丹散囊菌、方伊萨酵母、构巢裸孢壳及芽枝状枝孢；安徽地区麦曲中真菌种类相对更丰富，除含有以上真菌外，还含有黑曲霉和葡萄牙棒孢酵母。采用基于宏基因组的Illumina高通量测序技术对不同发酵时间的麦曲中微生物群落结构进行了研究，得到超过2万多条的高质量序列，测序结果显示，麦曲在不同阶段的主要微生物群落组成是不断变化着的，发酵第5天的麦曲中的优势微生物是放线菌（Actinobacteria），而发酵第30天的麦曲中优势菌为变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。

采用MiSeq高通量测序平台分析了上海某酒厂生麦曲的真菌微生物群落结构。麦曲中优势真菌门为子囊菌门，含量占总丰度的84.36%；共鉴定出16种不同的真菌属类，其中相对丰度大于1.00%的有5种，分别为曲霉属（Aspergillus，72.90%）、链格孢属（Alternaria，6.02%）、嗜热真菌属（Thermomyces，2.38%）、镰刀菌属（Fusarium，1.70%）、附球菌属（Epicoccum，1.44%）。

利用焦磷酸测序技术对麦曲中真菌群落结构在不同分类学水平上进行了分析，解析了基于门水平的麦曲中真菌的分类情况。大部分真菌隶属于子囊菌门（Ascomycota），相对丰度83.77%，为麦曲中最主要的优势真菌；其次为接合菌门（Zygomycota）的真菌。同时，麦曲中也存在相当一部分未鉴定的真菌（3.07%），表明麦曲中还有丰富的未知菌有待进一步研究。在目水平上，麦曲中的优势真菌是散囊菌目（Eurotiales）、毛霉目（Mucorales）、肉座菌目（Hypocreales）和格孢菌目（Pleosporales）。散囊菌目和毛霉目真菌能产生各种有机酸、氨基酸、酶类等，这两个类群真菌在麦曲中的丰度分别为83.467%和13.725%，说明这两类群在麦曲真菌群落组成上占主要地位。酵母菌目真菌在黄酒发酵中发挥重要作用，但在麦曲中丰度很小（0.004%）。

在属水平上，麦曲中主要包含5个属的真菌，分别是嗜热霉属（Thermomyces）、毛霉属（Rhizomucor）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和附球菌属（Epicoccum）。其中优势菌是嗜热霉属（58.65%）、毛霉属（6.69%）和曲霉属（1.68%），嗜热霉属真菌为最主要的优势菌。嗜热霉属在麦曲中丰度最大，表明该属真菌能够适应麦曲的高温环境，形成了自己特殊的生存、生长特性，并且麦曲也为它们提供了生长繁殖所必需的营养条件。

麦曲的群落结构与生产工艺也密切相关。采用最新的三代测序技术对上海地区接种生麦曲真菌群落结构进行解析，研究表明接种生麦曲门水平和目水平的真菌群落结构如图3-11所示，门水平上真菌绝大部分属于子囊菌门（Ascomycota），相对丰度为95.72%；接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的真菌占有小部分比例，相对丰度分别为2.06%和1.13%；同时还有一部分未鉴定的真菌，相对丰度为1.09%，说明测序得到的序列与数据库进行比对时有一部分序列属于不可培养或者其他环境中也没有出现过的微生物。接种生麦曲中的真菌隶属于4个目，分别是散囊菌目（Eurotiales）、酵母菌目（Saccharomycetales）、毛霉目（Mucorales）及肉座菌目（Hypocreales），其中散囊菌目（52.49%）和酵母菌目（45.81%）具有较高的丰度。相对于生麦曲中真菌在目水平的微生物分布，接种生麦曲与之有着较大的区别。在对绍兴生麦曲中真菌微生物群落结构进行分析中，目水平上主要是散囊菌目的真菌，酵母菌目的真菌含量很低；而接种生麦曲中酵母菌目的真菌丰度相对要高得多，在目水平上占有了很大的比例，说明在真菌组成上接种生麦曲和生麦曲有着一定的差异性，这可能是由于两种麦曲制作工艺的不同导致的。生麦曲制作过程中对轧碎的小麦进行了压块，之后经过堆放呈“品”字形于曲房中，在曲堆上搭上草帘子后让其自然升温，当达到50℃左右时开始揭去草帘子缓慢降温，后期还要经过长达近3个月的堆放过程，在长期的放置过程中，生麦曲自身水分不断散失，散囊菌目的真菌可能会形成孢子，而耐受性不强的微生物很可能失去活性；接种生麦曲在加水润麦过程中加水量相对较高，保证了一个湿润的微生物生长环境，虽然后期进行了通风培养，水分含量不断降低，但整个制曲周期较短，同时制曲温度较为适宜，这些因素共同作用可能导致酵母菌目真菌的大量繁殖。

接种生麦曲在属水平包括11个属的真菌，分别是曲霉属（Aspergillus，34.33%）、毕赤酵母属（Pichia，33.33%）、青霉属（Penicillium，11.85%）、假丝酵母属（Candida，6.13%）、横梗霉属（Lichtheimia，2.98%）、酵母菌属（Saccharomyces，2.98%）、拟威尔酵母属（Williopsis，1.94%）等（图3-12）。接种生麦曲中种水平包括18种真菌微生物，其中相对丰度大于1%的真菌包括黄曲霉（Aspergillus flavus，22.72%）、弗比恩毕赤酵母（Pichia fabianii，21.62%）、斜卧青霉（Penicillium decumbens，8.88%）、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii，7.18%）、黑曲霉（Aspergillus niger，6.53%）、皱褶假丝酵母（Candida rugosa，6.09%）、亮白曲霉（Aspergillus candidus，3.00%）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus，2.35%）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，2.16%）、产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum，2.13%）、横梗霉（Lichtheimia ramosa，2.06%）及拟威尔酵母（Williopsis sp，1.99%）等（图3-13）。

在利用焦磷酸测序对上海某酒厂生产的生麦曲微生物群落结构分析的研究中显示，在属水平上相对丰度大于1.00%的有5种，分别为曲霉属（Aspergillus，72.90%）、链格孢属（Alternaria，6.02%）、嗜热真菌属（Thermomyces，2.38%）、镰刀菌属（Fusarium，1.70%）及附球菌属（Epicoccum，1.44%）。可见生麦曲中最主要的曲霉属真菌，在接种生麦曲中也是优势菌种，但相对丰度较低。生麦曲在属水平检测到的嗜热真菌属在接种生麦曲中并没有检测到，这可能是由于生麦曲制作过程中经过压块并在曲房中自然升温，麦曲整体品温过高，有一部分嗜热微生物能够适应这样独特的生存环境，接种生麦曲整个制曲过程温度不超过45℃，因而此类微生物含量处于较低水平。相对于生麦曲，接种生麦曲在属水平上含量大于1%的属的数量较多，微生物分布较为均匀。

综上可知，麦曲中的主要真菌是伞枝犁头霉、烟曲霉、米曲霉、黑曲霉、微小根毛霉、小孢根霉、异常毕赤酵母、季氏毕赤氏酵母、酿酒酵母、米根霉、构巢裸孢壳、鲁西坦念珠菌。麦曲堆放过程中的主要真菌有伞枝犁头霉、米曲霉、伯顿毕赤酵母、微小根毛霉、扣囊复膜孢酵母和葡萄牙棒孢酵母。这些丰富的微生物是黄酒酿造和麦曲制曲重要的菌种资源，但仍有大部分尚未被开发、研究与应用。

3.1.3.3　麦曲制作过程中的微生物菌群演替规律

采用传统分离培养法与免培养法研究了机制块曲培养过程中的真菌变化。培养法采用稀释分离法，用察氏培养基分离块曲中的真菌，然后将得到的纯种真菌进行分子鉴定。研究结果表明在机制块曲培养过程中，存在的主要真菌有犁头霉属、曲霉属和根毛霉属。随着培养过程的进行，麦曲的真菌群落结构发生了变化。其中犁头菌属、曲霉属和根毛霉属在整个培养过程中一直存在，犁头菌属和曲霉属在中后期数量多于前期，而根毛霉属在前期和中期数量多于后期。裸孢壳属在中后期出现，并且数量较多。锁掷孢酵母属在前期和后期出现，然而在中期并没有分离到。共头霉属和青霉素在前期出现，但是随着培养时间的延长，麦曲中很少能分离得到此类真菌。散囊菌属在麦曲成型堆放的中期出现，但数量不多。

免培养法是通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物区系组成和群落结构，在揭示特定生态系统中微生物多样性的真实水平及构成方面具有极大的优势，但该方法不能区分样品中微生物的存活状态。运用基于PCR扩增和核糖体基因间区分析（ribosomal intergenic spacer analysis，RISA）技术的免培养法研究机制块曲培养过程真菌的变化，RISA图谱分析结果与培养方法基本一致。在机制块曲培养过程中的主要真菌为曲霉属、根毛霉属、犁头霉菌与酵母。前期出现的真菌为曲霉属、犁头霉属、根毛霉属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、念珠菌属；中期为曲霉属、犁头霉属、根毛霉属、念珠菌属；后期的真菌又演变为曲霉属、犁头霉属、根毛霉属、毕赤酵母属。曲霉属、根毛霉属和犁头霉菌属在整个麦曲培养过程中一直存在。

采用宏基因组测序技术分析了绍兴麦曲中细菌组成变化，发现第5天麦曲中，大部分细菌隶属于放线菌门，其中糖多孢菌属的细菌为最主要的优势菌（30.5%），芽孢杆菌属和葡萄球菌属细菌丰度分别为2.8%、2.2%；发酵30天后，麦曲中细菌组成发生巨大变化，厚壁菌门和变形菌门的细菌成为优势菌，糖多孢菌属丰度下降至8%，而芽孢杆菌属和葡萄球菌属的丰度分别增加至14.5%、11.6%，微生物群落组成的巨大变化表明不同细菌在麦曲发酵过程中的作用不同。