3.1.5 黄酒麦曲功能形成的关键因子研究
黄酒麦曲生产方式多样，微生物组成、风味品质变化较大，各个工厂麦曲质量差异明显，麦曲中真菌群落结构与麦曲的等级划分呈现较强的相关性，说明真菌群落结构是影响麦曲质量形成的关键因子。环境的改变会影响菌落结构的形成，从而影响麦曲的功能以及酒体的品质，因此分析黄酒麦曲功能形成的关键因子也就是分析环境因素对微生物群落结构变化的影响。对麦曲发酵过程中真菌和细菌的微生物的组成演变进行测定，并结合相关的环境因素包括温度、水分和酶活等指标，以评价微生物群落变化和环境因素之间的关联。通过阐述环境因素对麦曲发酵中微生物菌群变化的影响，加深了对麦曲发酵过程中微生物变化规律的认识，为优化和调控黄酒发酵过程提供理论依据。且探究黄酒麦曲发酵过程中主要的环境驱动因子有助于合理设计仿真麦曲制曲设备，实现麦曲现代化制备的高度智能化。
3.1.5.1 麦曲发酵过程中理化指标的变化分析
从浙江省绍兴市收集了黄酒麦曲样品，所有样品均为砖状，将其分为两部分：曲表与曲中（图3-16）。结合现有的研究和生产经验，曲表部分定义为从麦曲的表面起向中心延伸4cm，其余部分定义为曲中。
图3-16 曲表与曲中的划分
（1）黄酒麦曲发酵过程中温度的变化
黄酒麦曲制曲在原料压块成型后进行人工堆放，在曲房堆放四到五层后盖上草席及帆布以帮助升温保温。黄酒麦曲的发酵过程温度呈现先上升后下降的变化规律（图3-17），麦曲品温需要4天才可达到55℃，在这个温度持续2天左右后经人工控制逐步撤掉保温设施，使麦曲逐渐降温至室温，达到长期室温储存的要求。根据麦曲发酵过程中温度的变化规律将发酵过程分为两个阶段，其中阶段一（0～6天）麦曲温度逐步上升并维持55℃左右，阶段二（6～60天）温度降低至40℃以下。
图3-17 麦曲发酵过程中温度和含水量随发酵时间的变化
推测这种自发的温度变化主要是由于微生物在麦曲开始堆积后大量生长繁殖，活跃度较高产生了大量的生物热使得麦曲品温逐渐升高，55℃为大部分嗜热微生物生长所需的最适温度，因此温度不再升高，同时这样的高温使得部分对温度敏感的微生物失去活力或产生出大量的孢子，这一阶段不仅实现了微生物结构的演替同时有利于去除部分高温不耐受的有害微生物，为麦曲的品质提供了良好的基础；人工控制最高温度持续1～2天帮助麦曲完成微生物群落的演替和定型，目前这一阶段依然需要依赖经验判断具体的开始降温时间；撤去人工保温措施后由于环境温度远低于麦曲品温，麦曲中储存的热量逐步散失到环境中，这一过程中部分微生物的孢子在温度合适时重新萌发继续生长并利用麦曲中的营养物质大量释放酿酒所需的相关酶系，提供了麦曲所需的基本酶活力。当麦曲品温逐渐降低至室温时麦曲微生物整体活跃度偏低，保证了其微生物组成可以维持在相对变化较小的范围内，有利于麦曲长期在室温环境下的保存而不变质。
因此麦曲发酵过程中温度的控制有利于提高对微生物结构的控制及改造，明确不同温度阶段下微生物的组成情况可以进一步解析黄酒麦曲发酵机制，有望实现人工控制快速发酵以推动麦曲发酵进程。
（2）黄酒麦曲发酵过程中含水量的变化
水是微生物生长繁殖所必需的环境因素之一，合适的含水量（或湿度）有助于微生物良好的繁殖及产酶，为麦曲提供合适的发酵酶系；含水量过高易导致微生物生长泛滥而使麦曲酸败或变质，过低的含水量又不足以维持微生物的正常生长。同时成品麦曲的含水量也是工厂用于衡量麦曲品质优劣的重要指标之一。因此探究麦曲含水量有助于了解发酵进程中微生物对水的需求情况，为仿真制曲的制曲环境模拟提供进一步的模拟依据和指导理论。
黄酒麦曲通常在原料的处理阶段为粉碎后的物料进入自动化压曲系统，该系统目前可以完成加水拌料到压块成型的一体化进程，通常麦曲的加水量在20%～25%的范围内。一般麦曲的发酵过程中含水量呈现出整体下降的趋势，发酵开始后随着麦曲品温逐渐升高（0～6天），其水分被缓慢蒸发，当麦曲进入降温阶段（6天以后）时，水分的散失速率降低，但由于麦曲依然维持着较高的温度，故含水量依然呈现出下降的趋势至麦曲品温接近室温，这时成品麦曲的含水量一般在11%～13%之间。根据已有的经验，成品麦曲的含水量在11%～13%之间时有助于麦曲的长期保存，不易滋生额外的微生物，同时也保证了部分微生物对于水源的基本需求，有助于麦曲在长期储存时其微生物结构没有过大的波动。
（3）黄酒麦曲发酵过程中主要酶活力的变化
糖化酶活力和α-淀粉酶活力（也称液化酶活力）是工厂中用于评价成品块曲质量等级的重要指标之一，麦曲中的酶活力主要来源于微生物，因此观测麦曲发酵过程中酶活力的变化可以从侧面观察微生物的生长及产酶情况。检测传统工艺手工麦曲发酵过程中的酶活力变化，从原料压块成型到发酵为成品麦曲，麦曲糖化酶活力的变化表现为逐渐下降的趋势，而液化酶活力的变化表现出明显的波动趋势，可认为在黄酒麦曲发酵过程中，其液化酶活力基本保持不变（图3-18）。
图3-18 麦曲发酵过程酶活力随发酵时间的变化
3.1.5.2 麦曲的曲中与曲表群落结构分析
曲中与曲表真菌群落结构具有差异，曲中真菌构成主要由弗比恩毕赤酵母组成，而曲表真菌构成主要由酿酒酵母组成，且相比较于曲中，曲表含有较为丰富的真菌群落结构。在细菌构成方面，曲表主要由路德维希肠杆菌组成，而曲中则是由融合乳杆菌组成，并且曲表的细菌种类也多于曲中，曲表与曲中具有一定的差异性。
曲表为大多数微生物提供了足够的氧气、生存空间和适宜的温度，这也导致了曲表的微生物物种要多于曲中。可以想象麦曲为具有温度和氧含量梯度变化的生活环境模型，该模型的内部是加热和缺氧的，很少有微生物可以存活，因此它具有最少数量的微生物物种，随着温度和氧气含量的变化越来越舒适，越来越多的微生物活下来，并且表面的多样性也越来越高，这也解释了曲表与曲中微生物群落为何具有一定的差异性。
3.1.5.3 麦曲发酵过程中微生物群落演替和物种分类树分析
采用第二代高通量测序技术跟踪检测麦曲发酵过程中真菌及细菌微生物群落结构的变化，深度解析黄酒麦曲发酵过程的变化因子，推测麦曲发酵过程中的核心物种，进而了解麦曲发酵的关键驱动因子。
跟踪测序结果显示未发酵的原料中以不动杆菌属（Acinetobacter）和曲霉属（Aspergillus）为主，而随着发酵的开始细菌群落发生了明显的变化（如图3-19）。在最初升温的2～6天中葡萄球菌属（Staphylococcus）明显增多，同时肠杆菌属（Enterobacter）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）增多，并且随着发酵时间推移逐渐增多。在发酵后期（8～60天），经历过高温的葡萄球菌属（Staphylococcus）大幅减少，而原料中本身带有的不动杆菌属（Acinetobacter）再次出现，同时还有部分好氧发光细菌（Oxyphotobacteria）。真菌群落在最初发酵的2～6天之中变化明显，伊萨酵母属（Issatchenkia）在第2天显著增多却在第4天显著减少，推测可能是由于麦曲发酵初期温度快速上升导致酵母显著减少，在此期间对温度不敏感的曲霉属（Aspergillus）以及根瘤菌属（Rhizomucor）相对丰度逐渐升高，同时还有部分未知真菌（Unclassified unclassified）。在发酵后期（8～60天），曲霉属（Aspergillus）以及根瘤菌属（Rhizomucor）一直占比较高。经过储存后的成品麦曲（60天）中曲霉属（Aspergillus）真菌成为主要微生物。
图3-19 麦曲发酵过程中细菌微生物组成的物种分类树
进一步分析不同发酵时间下真菌和细菌物种分类的组成差异，在发酵初始阶段（2天）时，真菌构成主要由伊萨酵母属（Issatchenkia）占据。在发酵第一阶段（0～6天），根毛霉属（Rhizomucor）的相对丰度较高，而在发酵的第二阶段（6～60天），曲霉属（Aspergillus）和链格孢属（Alternaria）的相对丰度较高。
由细菌组成的物种分类树可知，在发酵未开始时（0天），细菌组成中主要为不动杆菌属（Acinetobacter），在发酵第2天，细菌主要由片球菌属（Pediococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus）构成。发酵后期时，细菌中黄杆菌属（Flavobacterium）的相对丰度较高。
通过麦曲发酵过程真菌组成的热图分析，在发酵0天时，散囊菌纲（Eurotiomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）和节担菌纲（Wallemiomycetes）的相对丰度较高。而发酵第一阶段（0～6天）的真菌菌群组成和发酵起始时具有显著差异，其中酵母纲（Saccharomybetes）和盘菌纲（Pezizomycetes）的相对丰度较高。在发酵后期（19～60天），麦曲的真菌组成也具有显著特征，即座囊菌纲（Dothideomycetes）、子囊菌纲（Sordariomycetes）、微球黑粉菌纲（Microbotryomycetes）、银耳纲（Tremellomycetes）和囊担菌纲（Cystobasidiomycetes）的相对丰度较高。
麦曲发酵中细菌的组成变化热图（图3-20）表明，发酵起始时（0天），鞘脂醇属（Sphingobium）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、短小杆菌属（Curtobacterium）、芽孢杆菌属（Bacilius）、嗜酸菌属（acidovorax）、Cloacibacterium、Franconibacter、柄杆菌属（Caulobacter）、水栖菌属（Enhydrobacter）和Brevumdimonas的相对丰度较高，在麦曲中占据主要细菌生态位。而发酵第一阶段（温度上升，0～6天），主要细菌菌群变为魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、库克菌属（Kocuria）、乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）。在麦曲发酵后期，细菌组成进一步变化，其中气单胞菌属（Aeromonas）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）和金黄杆菌属（Chryseobacterium）的相对丰度较高，在发酵后期发挥主要功能作用。
图3-20 麦曲发酵过程中细菌（OTU水平）构成的演替变化热图
结果表明，在麦曲发酵起始、发酵第一阶段（0～6天）和发酵第二阶段（6～60天）的真菌和细菌组成特征均具有显著差异，并且具有不同的优势菌种组成。
3.1.5.4 温度、湿度是麦曲微生物群落形成的环境驱动因子
在麦曲发酵过程中的多个环境因素包括温度、含水量等与微生物群落结构的形成有关，通过对发酵过程中温度、水分、淀粉酶活和糖化酶活测定，发现环境因素的变化具有阶段性，结合图3-19和图3-20的微生物演替规律可将麦曲发酵大致分为第一阶段（0～6天）和第二阶段（6～60天）。使用曼特尔测试方法（Mantel test）对微生物群落与相应环境因素之间的相关性进行检验。结合上述微生物群落的演替规律以及生产实践经验，分别对麦曲发酵两个阶段的微生物群落演替以及相应环境因素进行相关性分析。微生物群落结构数据集（真菌和细菌）为布雷-柯蒂斯（Bray-Curtis）相异性系数矩阵，环境因素数据集为欧氏距离矩阵，结果如表3-4所示。
表3-4 麦曲发酵过程中微生物群落演替与环境因素的相关性
注：r，斯皮尔曼（Spearman）相关系数，p<0.05表示显著相关。阶段一：0～6天；阶段二：6～60天。
在麦曲发酵第一阶段（0～6天），细菌群落演替与温度（r=0.58，p=0.04）和含水量（r=0.63，p=0.04）呈显著线性相关关系，但是细菌群落变化与淀粉酶活和糖化酶活没有显著相关性（p>0.05）。在麦曲发酵第二阶段（6～60天），细菌群落演替与温度（r=0.83，p=0.001）和含水量（r=0.44，p=0.01）呈显著线性相关关系。而在两个阶段真菌的菌群演替与温度、含水量、淀粉酶活和糖化酶活均没有显著相关性（p≥0.05）。因此，温度和含水量对细菌的微生物群落演替具有重要作用。
进一步分析两个发酵阶段中不同温度下微生物的群落结构情况，测定第一阶段第4天（56℃）和第二阶段第8天（40℃）细菌菌群群落结构的β-多样性分布，结果表明不同温度下真菌和细菌的群落聚类具有明显差异，温度对微生物群落结构具有显著影响。
3.1.5.5 氧气浓度是麦曲微生物群落形成的环境驱动因子
在麦曲发酵过程中，氧气浓度对微生物群落、黄酒的风味以及成品的品质具有影响，但是在麦曲发酵的氧气浓度以及其浓度对黄酒的影响程度有待研究。研究采取了麦曲曲中和曲表的样品，曲表氧气浓度为空气中氧气浓度（约21%），因此比较了不同氧气浓度下麦曲的微生物群落结构和组成，氧气浓度分别约为20%（曲表样品）和10%（曲中样品）。
在麦曲发酵不同阶段，氧气浓度对真菌群落多样性影响较大，图3-21表明了麦曲发酵2天、6天、25天和60天时曲表和曲中样品中真菌群落的多样性变化。发酵2天（图3-21A）时，曲表和曲中的共有微生物有270种；而发酵后期60天（图3-21D）时，曲表和曲中的共有微生物有312种。说明随着发酵时间增加，真菌的群落多样性增加。
图3-21 麦曲发酵过程不同氧气浓度下真菌多样性韦恩图分析
图3-22显示了麦曲发酵2天、6天、25天和60天时曲表和曲中样品中细菌群落的多样性变化。在麦曲发酵不同阶段，氧气浓度对细菌群落多样性具有影响。发酵2天（图3-22A）时，曲表和曲中的共有微生物有69种；发酵25天（图3-22C）时，共有微生物增多至105种；而发酵后期60天（图3-22D）时，曲表和曲中的共有微生物稍降低至98种。说明细菌群落的增殖和功能性发挥主要在发酵中期（25天左右）。
图3-22 麦曲发酵过程不同氧气浓度下细菌多样性韦恩图分析
不同氧气浓度对细菌的相对丰度具有显著影响，图3-23和图3-24分别列出了麦曲发酵2天和19天时具有显著丰度差异的细菌菌种。在发酵2天时，不同氧气浓度（10%曲中和20%曲表）对细菌特定菌种的相对丰度具有显著影响。其中，低氧气更能促进葡萄球菌（Staphylococcus）、片球菌属（Pediococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus）菌种的生长，而高氧气浓度下库克菌属（Kocuria）和魏斯氏菌属（Weissella）的相对丰度较高。在发酵19天时，10%氧气浓度和20%氧气浓度对细菌菌种的相对丰度具有显著影响（图3-24），20%氧气浓度下魏斯氏菌属（Weissella）和气单胞菌属（Aeromonas）的相对丰度较高，生长较好；而10%氧气浓度下黄杆菌属（Flavobacterium）相对丰度较高。结果表明，不同氧气浓度对不同细菌菌种的生长具有显著影响，对细菌和真菌群落结构都有明显作用。
图3-23 麦曲发酵2天不同氧气浓度下特定细菌丰度比较
盒状图分别代表了四位分距（IQR）、中位数（水平横线）和变化范围。显著性通过双尾（two-tailed）t检验比较，
p<0.01，p<0.001，p<0.0001
图3-24 麦曲发酵19天不同氧气浓度下特定细菌丰度比较
盒状图分别代表了四位分距（IQR）、中位数（水平横线）和变化范围。显著性通过双尾（two-tailed）t检验比较，p<0.05，p<0.01，p<0.001
3.1.5.6 麦曲微生物的功能注释
（1）eggNOG数据库功能注释
基于eggNOG数据库，对2个麦曲样品的功能注释统计结果如图3-25所示。信息储存与加工（information storage and processing）、细胞信号（cellular processes and signaling）、代谢过程（metabolism）和未知功能（poorly characterized）是eggNOG数据库的4大分类。从相对丰度上，注释结果中代谢过程分类的相对丰度最大，未知功能分类的相对丰度次之。2个麦曲样品中，各分类中注释到的unigenes数目和相对丰度没有明显差异。
图3-25 麦曲样品的eggNOG功能分类
A—RNA加工和修饰；B—染色质结构和动力学；J—翻译生成核糖体结构；K—转录；L—复制、重组和修复； D—细胞周期控制、细胞分裂、染色体分离；M—细胞壁/膜/被膜的生成；N—细胞运动；O—蛋白质翻译后的修饰与加工；T—信号转导机制；U—囊泡在细胞内的分泌和运输；V—防御机制；W—细胞外结构；Y—核结构； Z—细胞骨架；C—能量产生和转化；E—氨基酸转运和代谢；F—核苷酸转运和代谢；G—碳水化合物转运和代谢； H—辅酶转运和代谢；I—脂质转运和代谢；P—无机离子的运输和代谢；Q—次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢；S—未知功能
麦曲样品共注释到24个eggNOG功能分类。信息储存与加工（information storage and processing）分类中，黄酒麦曲中与转录组相关的K（transcription）分类相对丰度最高，而在白酒曲中则是L复制、重组和修复（replication，recombination and repair）分类相对丰度最高，而B染色质结构和动力学（chromatin structure and dynamics）分类的基因数目最低。细胞信号分类包括10个分类，注释分类中M细胞壁/膜/被膜的生成（cell wall/membrane/envelope biogenesis）分类的基因数目最高，W细胞外结构（extracellular structures）分类的基因数目最低，注释到样品的序列（unigenes）基因数目为2条。代谢过程分类的基因是与麦曲风味物质关系最直接的功能分类，黄酒麦曲中包含的8个分类的相对丰度的总和相近，2个麦曲样品分别为31.81%和32.65%；基因数目前三的E氨基酸转运和代谢（amino acid transport and metabolism）、C能量产生和转化（energy production and conversion）、G碳水化合物转运和代谢（carbohydrate transport and metabolism），2个麦曲样品中各分类相对丰度平均值分别为6.17%和5.23%，印证了碳水化合物和氨基酸代谢是黄酒发酵中的重要部分。
（2）KEGG数据库功能注释
基于KEGG数据库，对2个麦曲样品的代谢通路（Level 1）的注释信息如表3-5所示，属于代谢过程（metabolism）的基因数目最多，属于遗传信息处理（genetic information processing）的基因数目次之，属于生物体系统（organismal systems）的基因数目最少。两种黄酒麦曲的6种代谢通路的相对丰度的比例相近。
表3-5 酒曲样品Level 1代谢通路功能注释相对丰度 单位：%
KEGG数据库的Level 2代谢通路（46类pathway）的注释信息如图3-26所示，未有基因注释到化学结构转化通路（chemical structure transformation maps）；属于全局和概览通路（global and overview maps）的基因相对丰度最大，氨基酸代谢（amino acid metabolism）、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）和能量代谢（energy metabolism）次之，这与eggNOG的注释结果一致；遗传信息处理分类中，2个样品注释到转录（translation）类相对丰度平均为1.65%，占据遗传信息处理分类下注释基因数目的42.51%，在此分类下占有最大比例。
图3-26 麦曲样品中KEGG代谢通路（Level 2）分布
OS—生物体系统（organismal systems）；ME—新陈代谢（metabolism）；HD—人体疾病（human diseases）； GIP—遗传信息处理（genetic information processing）；EIP—环境信息处理（environmental information processing）； CP—细胞转化（cellular processes）
在KEGG的Level 3代谢通路上，黄酒麦曲KJS和GYLS共注释到372类（两种麦曲注释到的种类相同），3个共有代谢途径分别为鞘糖脂生物合成（glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series），Ⅱ型多肽骨架的生物合成（map01056，biosynthesis of type Ⅱ polyketide backbone），12元、14元和16元大环内酯的生物合成途径（map00522，biosynthesis of 12-，14-and 16-membered macrolides）和植物激素信号转导（map04075，plant hormone signal transduction）。